复方黑面神软膏的质量标准研究

复方黑面神软膏的质量标准研究摘要：目的提高复方黑面神软膏质量标准。方法采用薄层色谱鉴别法对成分中的当黑面神、苦参、蛇床子、白鲜皮、地肤子进行定性鉴别，用高效液相色谱法测定黑面神中表儿茶素和苦参中苦参碱的含量。结果在选定的薄层色谱条件下,色谱斑点清楚,分离效果好,无干扰；表儿茶素含量在0.00840.0336gl-1范围内呈良好的线性关系，r=1.000,测定的平均回收率为97.7%，RSD1.4%（n=6）；苦参碱含量在0.01470.0588gl-1范围内呈良好的线性关系，r=0.999,测定的平均回收率为97.6%，RSD1.5%（n=6）。结论建立的定性、定量方法较简便、准确、灵敏、重现性好。关键词：复方黑面神软膏；薄层鉴别；高效液相色谱法IStudyonthequalitystandardsofcompoundBreyniafruticosaointmentAbstract:Objective:ToimprovethequalitystandardsofcompoundBreyniafruticosaointment.Methods:TheBreyniafruticosa,Sophoraflavescens,FructusCnidii,CORTEXDICTAMNIandFructusKochiaeScopariaeradixwerequalitativelyidentifiedbyTLC.ThecontentofL-EpicatechininBreyniafruticosaandthecontentofmatrineinSophoraflavescensweredeterminedbyusingHPLC.Results:ThespotsonTLCplateswereclearwithoutinterferenceintheblankreference.tThelinearityrangeofEpicatechinIVwas0.00840.0336gl-1，r=1.000.ThelinearityrangeofmatrineIVwas0.01470.0588gl-1，r=0.999.Conclusion:Theestablishedmethodiseasy,accurate,sensitive,andreproducible.Keywords：CompoundBreyniafruticosaOintment，TLC，HPLC目录摘要.-1前言.12材料与仪器.22.1仪器.22.2试药.23方法.33.1定性鉴别.33.2含量测定.94讨论.174.1定性鉴别结果.174.2定量鉴别结果.175结论.18参考文献.19综述.21致谢.2901前言随着社会的发展进步，大气环境、工业污染等多种因素的影响，导致人类皮肤病的患病率逐渐升高，所以关于其用药情况也在逐渐受到人们的关注。我们国家中医药里对皮肤病有着很多丰富的治疗经验和文字记载。福建药物志曰：“黑面神叶，百部各60g。水煎冲明矾适量，洗患处治漆过敏，湿疹；黑面神鲜叶适量，捣烂绞汁，调雄黄末涂患处治带状疱疹。”全国中草药汇编曰：“黑面叶适量，煮水坐盆或阴道冲洗，每日1次，治阴道炎、外阴瘙痒。”在现代临床应用中，神矾散（黑面神100g、白矾30g）祛风清热、消肿解毒、燥湿止痒，用于治疗接触性皮炎、皮肤瘙痒、湿疹等皮肤病1。刘仲霞等2运用悬液定量杀菌试验方法对四种抗菌洗液杀菌效果进行随机抽样检测，结果显示，纯中草药制剂舒敛爽抗菌洗液（由黑面神、百部、荆芥、苦参、蛇床子、防风、地肤子和栀子组成）作用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和淋病球菌5min，杀菌率可达100%。林挺等人3对醋酸去炎松霜与中药三七洗剂（黑面神、苦参、七大姑、蛇床子、野菊花、三亚苦、荆芥各30g，白鲜皮20g，布渣叶6g）治疗婴儿急性湿疹的疗效进行了对比研究，证实中药三七洗剂治疗婴儿急性湿疹效果显著。李东海等人4运用复方二藤洗剂（由黑面神、虎杖、三亚苦、大飞杨、忍冬藤、南蛇藤等组成）外洗治疗掌跖脓疱病38例。广东省由于所处的地理位置和气候适合各类病菌的生存和繁衍，因此会成为多类皮肤病高发区。作为皮肤病高发的地域，在长期和皮肤病斗争的过程中，广东民间传统中医积累了大量宝贵经验。很多中药处方在防治皮肤病的过程中发挥了重要作用。如90年代运用自拟处方（黑面神、蛇床子、三亚苦、苦参、七大姑、荆芥、野菊花等各30g，白藓皮20g，布渣叶6g）医治面部激素依赖性皮炎，每次水煎煮后外洗，每日34次。结果显示，与对照组相比较疗效明显增强。近几年来广东地区皮肤病患者的人数在逐年增多，皮肤病的主要用药如抗病毒药、抗真菌药、抗变态反应药等具有较显著的副作用。中药在变应性接触性皮炎的治疗中显示出一定优势。但价格低廉、含中药有效成分的皮肤外用药1种类却很少。因此开发出使用方便、安全有效且价格便宜的中药制剂有着迫切的市场需求。复方黑面神软膏由黑面神、苦参、蛇床子、白鲜皮和五味子五味中药组成，具有消炎和止痒的功效，对各类皮肤病有较好的治疗作用。本课题的前期药理实验已证实5，君药黑面神全株水提液具有显著的抗炎止痒作用、免疫抑制作用、抗皮肤型超敏反应作用。为了较好地控制复方黑面神软膏的质量，文中对成品中黑面神等每味药进行薄层色谱鉴别，并建立HPLC法测定成品君药黑面神中表儿茶素和臣药苦参中苦参碱的含量,方法简便，准确度高，重现性好。所探索的技术路线符合现代技术要求，可为黑面神其他剂型的开发研究提供借鉴。2材料与仪器2.1仪器Agilent1100series高效液相色谱仪；BS224S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司d=0.0001g）；jj200型电子天平（常熟市双杰测试仪厂）；电子JA-1203天平（上海天平仪器厂d=0.001g）；DK-8D电热恒温三孔水槽（上海跃进医疗械器有限公司）；UV-2550型紫外-可见分光光度仪（日本岛津）；KQ3200E医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-S4数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；RE-2000B型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-型循环水真空泵（巩义市英峪华中仪器厂）；东方一A型直热式电热恒温干燥箱（广州东方电热干燥设备厂）；Goodsee-薄层色谱摄影仪（上海科哲生化科技有限公司）。2.2试药黑面神枝叶购自广州至信药业有限公司，经广州中医药大学生鉴定教研室黄海波教授鉴定为大戟科黑面神属植物Breyniafruticosa(L.)Hook.f.的干燥嫩枝叶，表儿茶素对照品（批号：110878-200102),苦参碱对照品（批号：0805-9804），苦参对照药材（批号：121019-201407），蛇床子对照品（批号：110822-2200305），蛇床子对照药药材（批号：121030-200405），白鲜皮对照药材（批号：978-9301）地肤子对照药材（批号：121148-200803）均为中国药品生物制品检定所提供。甲醇，色谱纯；水为屈臣氏蒸馏水,磷酸为分析纯。3方法3.1定性鉴别（1）称取复方黑面神软膏5g，再加甲醇20mL,放置1h,滤过,滤液浓缩至5mL,作为黑面神供试品溶液。另外取黑面神对照药材同法制成对照药材溶液以及同法制成阴性样品溶液。再取表儿茶素对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液，最后吸取上述四种溶液各10L,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（1:2:0.2:0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以25%磷钼酸乙醇溶液，在110加热至斑点显色清晰。供试品溶液在与对照药材和对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。（2）称取复方黑面神软膏5g，加浓氨试液0.3mL，加三氯甲烷25mL，加热回流30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，作为苦参供试品溶液；另取苦参对照药材同法制成对照药材溶液，再取与供试品相应量的苦参阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。最后取苦参对照品适量，加乙醇制成0.2mg/mL的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年一部附录VIB）试验，吸取上述溶液各4L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-氨水（5.2:0.7:0.6）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以改良的碘化铋钾试液，热风吹干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同的橙色斑点。（3）称取复方黑面神软膏3g，加乙醇50mL超声处理5分钟，放置，取上清液作为供试品溶液，另取蛇床子对照药材4g加水100mL煮沸30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇5mL同法制成对照药材溶液，再取与供试品相应量的蛇床子阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液，最后取蛇床子对照品溶液，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录VIB）试验，吸取上述四种溶液各6uL分别3点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-正己烷(3:3:2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。（4）称取复方黑面神软膏4g，加甲醇30mL超声处理20min，滤过，滤液加中性氧化铝（100-200目）1.5g振摇2min滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液，取与供试品相应量的白鲜皮阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液，另取白鲜皮对照药材1g加水40mL煮沸并保持微沸30min脱脂棉滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解作为对照药材溶液，取上述3种溶液各5L分别点于同一用0.5%氢氧化钠溶液制成的硅胶G薄层板上，以环己烷-丙酮-浓氨水（20:20:1）的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，以10%的硫酸乙醇溶液显色，加热至斑点显色清晰，供试品色谱中在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰。（5）称取复方黑面神软膏5g，加乙醇40mL，盐酸3mL，加热回流2h，静置，倾出上清液，清液浓缩至约5mL，加水20mL，混匀，置分液漏斗中，加石油醚（60-90）振摇提取2次，每次约20mL，合并醚液，蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取地肤子对照药材2g，同法制成对照药材溶液，再取与供试品相应量的地肤子阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照薄层层析法（中华人民共和国药典2010年版1部附录VIB）试验，吸取上述3种溶液各5L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-醋酸乙酯-氯仿（20:8:5）为展开剂，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。3.1.1黑面神的薄层鉴别参照金芥麦配方颗粒的质量8进行方法的建立。本次将展开剂定为甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（1:2:0.2:0.1），显色剂为25%磷钼酸乙醇溶液并与显色剂用10%硫酸乙醇作比较。供试品按上述方法处理展开显色后，薄层色谱中供试品与表儿茶素对照品特征成分斑点对应性好，斑点所得Rf值适中，斑点清晰。阴性样品在薄层色谱中，4在与对照药材和样品的色谱相应的位置上无干扰。对在不同温度、湿度和显色剂条件下展开的层析效果进行比较，结果表明对薄层色谱效果影响不大。薄层色谱图见图14。123456123456图1黑面神薄层鉴别色谱图图2黑面神薄层鉴别色谱图（25%磷钼酸乙醇，T=23,RH=56%）（10%硫酸乙醇，T=23,RH=56%）样品：1.表儿茶素对照品；2.黑面神对照药材；3-5.供试品溶液；6.缺黑面神阴性样品溶液123456123456图3黑面神薄层鉴别色谱图图4黑面神薄层色谱鉴别图（25%磷钼酸乙醇，T=23，RH=38%）（25%磷钼酸乙醇，T=16，RH=56%)样品：1.表儿茶素对照品；2.黑面神对照药材；3-5.供试品溶液；6.缺黑面神阴性样品溶液5图1,2为不同显色剂下的黑面神薄层鉴别；图1,3,4为对样品进行方法学考察。由图1,2对比可得，样品在10%硫酸乙醇下显色的斑点相比较而言较不明显，而在不同温度和湿度的差别性不大。3.1.2苦参的薄层鉴别在本次薄层色谱中。展开剂定为乙酸乙酯-乙醇-氨水（5.2:0.7:0.6），显色剂为改良碘化铋钾和碘化铋钾试液作比较。按正文方法处理后，供试品色谱中，供试品与苦参碱对照品显相同染色的斑点且对应性好，斑点Rf值较好。阴性样品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上无干扰。薄层色谱图见图56。123456123456图5苦参薄层鉴别色谱图图6苦参薄层鉴别色谱图（改良碘化铋钾试液，T=18,RH=65%）（碘化铋钾试液，T=18,RH=65%）样品：1.苦参碱对照品；2.苦参对照药材；3-5.供试品溶液；6.缺苦参阴性样品溶液图5,6为苦参在不同显色剂下的胶G板薄层图，图中样品和对照品相应位置上的斑点均清晰，差别性不大，对比两种显色剂下的结果，碘化铋钾试液显色的薄层相比于改良碘化铋钾试液显色的薄层中，有一个斑点缺失，可能是由于此斑点颜色过浅，被碘化铋钾颜色掩盖，总体影响不大。3.1.3蛇床子的薄层鉴别参照中国药典2010年版一部9进行方法的建立，其中将展开剂订为甲苯-乙酸乙酯-正己烷(3:3:2)，然后按正文方法对样品进行处理，展开后，色谱图中供试品斑点与对照品斑点对应清晰，且斑点Rf值较好。而阴性液相色谱中，6在与供试品和对照品相应的位置上无干扰。对在不同温度、湿度和显色剂条件下展开的层析效果进行比较，结果表明对薄层色谱效果影响不大。薄层色谱图见图79。123456123456图7蛇床子薄层鉴别色谱图图8蛇床子薄层鉴别色谱图（紫外线365nm下，T=22,RH=49%）（紫外线365nm下，T=17,RH=49%）样品：1.蛇床子素对照品；2.蛇床子对照药材；3-5.供试品溶液；6.缺蛇床子阴性样品溶液123456图9蛇床子薄层鉴别色谱图（紫外线365nm下，T=22,RH=63%）样品：1.蛇床子素对照品；2.蛇床子对照药材；3-5.供试品溶液；6.缺蛇床子阴性样品溶液图79为蛇床子样品在不同显色剂下的胶G板薄层图，图中样品和对照品7相应位置上的斑点均清晰，差别性不大，对在不同温度、湿度和显色剂条件下展开的层析效果进行比较，结果表明对薄层色谱效果影响不大。3.1.4白鲜皮的薄层鉴别参照白山片的薄层色谱鉴别方法10研究进行方法的建立。本次对比展开剂环己烷-丙酮-浓氨水（20:20:1）的上层液与展开剂石油醚（60-90）-乙酸乙酯（10:1）的展开效果，显色剂为10%的硫酸乙醇溶液显色。供试品按上述方法处理展开显色后，薄层色谱中供试品与对照药材特征成分斑点对应性较好，斑点所得Rf值适中，斑点清晰。阴性样品在薄层色谱中，在与对照药材和样品的色谱相应的位置上无干扰。如图1011。123456123456图10色谱图（环己烷-丙酮-浓氨水）图11色谱图（石油醚-乙酸乙酯）（10%硫酸乙醇，T=21，RH=57%）（10%硫酸乙醇，T=21，RH=57%）样品：1-2.白鲜皮对照药材；3-4.供试品溶液；5-6.缺白鲜皮阴性样品溶液图1011为白鲜皮样品在不同展开剂下的胶G板薄层图，图中样品和对照品的斑点均能较好的对应上，差别性不大，但在环己烷-丙酮-浓氨水下展开得到的斑点较为清晰。3.1.5地肤子的薄层鉴别参照归芍止痒颗粒质量标准研究11进行方法的建立。本次将展开剂定为环己烷-醋酸乙酯-氯仿（20:8:5），显色剂为磷钼酸试液并与显色剂用10%硫酸乙醇作比较。供试品按上述方法处理展开显色后，薄层色谱中供试品与表儿茶素对照品特征成分斑点对应性好，斑点所得Rf值适中，斑点清晰。阴性样品在8薄层色谱中，在与对照药材和样品的色谱相应的位置上无干扰。如图1215。123456123456图12地肤子薄层鉴别色谱图图13地肤子薄层鉴别色谱图（磷钼酸试液，T=20，RH=56%)(10%硫酸乙醇，T=20，RH=56%）样品：1-2.地肤子对照药材；3-4.供试品5-6.缺地肤子阴性样品溶液123456123456图14地肤子薄层鉴别色谱图图15地肤子薄层鉴别色谱图（磷钼酸试液，T=20，RH=37%)（10%硫酸乙醇，T=20，RH=37%）样品：1-2.地肤子对照药材；3-4.供试品5-6.缺地肤子阴性样品溶液图11,12为地肤子在不同显色剂下的胶G板薄层图，图中样品和对照品相应位置上的斑点均清晰，差别性不大。而通过12,13和14,15的对比，在湿度较低时，斑点显色较浅，其它影响不大。3.2含量测定9黑面神为复方黑面神软膏中的主药，具有“清湿热、化瘀滞”以及抑菌、抗病毒、抗炎等的功效，用于湿疹、荨麻疹、皮肤瘙痒、过敏性皮炎、漆过敏、阴道炎、外阴瘙痒、带状疱疹等多种皮肤病的治疗。其中复方软膏中的主要化学成分为表儿茶素和苦参碱。近年来，对苦参碱的含量测定方法的研究很多，如高效液相色谱法（HPLC)，高效毛细管电泳法（HPCE)，薄层扫描法(TLCS),酸碱滴定法等12。其中TLCS一般采用硅胶G薄层板、双波长扫描法，具有取样量少，操作简单分离效果好等优点，但测定的灵敏度和准确度有待提高；HPEC法具有选择性高，分离效率高，速度快及样品前处理简单等优点。苦参碱的碱性较强，极性较大，在采用HPCL法分析时，往往因为吸附太强而造成峰形不理想，但分离效果好。相对于苦参碱含量的测定，表儿茶素含量的测定方面的研究较少，一般采用高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳法13进行测定,毛细管电泳技术是一种近年来发展很快的分离分析技术，具有高效、进样体积小、快速和抗污染能力强的特点，有关其应用已经做过多次报道。现参照王英晶7运用HPLC测定黑面神中表儿茶素含量的方法，对研制出的复方黑面神软膏进行含量测定，建立方中指标成分表儿茶素和苦参碱的含量测定方法，经方法学验证，此方法可行。3.2.1色谱条件BostonGreenODSC18色谱柱（4.6mm250mm,5um）流动相甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱（程序见表1），流速1.0mLmin-1,检测波长220nm和280nm，柱温30，进样量20L。在此条件下供试品溶液中苦参碱和表儿茶素的峰与相邻峰能达到基线分离，其保留时间为10.026min和48.333min。理论塔板数按苦参碱峰计算应不低于4000，表儿茶素峰应不低于3600。表1梯度洗脱程序时间（min）甲醇（%）0.1%磷酸溶液（%）05951515853518826023771065595图16苦参碱对照品液相色谱图图17苦参碱样品液相色谱图图18缺苦参碱阴性样品液相色谱图12311图19表儿茶素对照品液相色谱图图20表儿茶素样品液相色谱图图21缺表儿茶素阴性样品液相色谱图3.2.2溶液的制备3.2.2.1对照品溶液的制备精密称取表儿茶素对照品8.4mg，加50%甲醇制成每1mL含0.84mg的溶液，摇匀，即得；精密称取苦参碱对照品14.7mg，加甲醇制成每1mL含1.47mg的溶液，摇匀，即得。3.2.2.2供试品溶液的制备黑面神供试品溶液的制备：取本品约2g，精密称定，用50%甲醇20mL溶解转移至25mL容量瓶，超声20min，50%甲醇定容，摇匀，过0.45m滤膜，取续滤液。苦参供试品溶液的制备:取本品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入浓氨试液1mL充分浸润膏体后，精密加入三氯甲烷20mL，密塞，称定质量，超声处理(功率140W，频率42kHz）30min，放冷，离心，取上清液5mL，减压回收至干，残渣用50%甲醇溶解转移至5mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。4123.2.2.3阴性溶液的制备按照处方量制备不含黑面神的阴性样品和不含苦参的阴性样品，按照制备供试品的制备方法制备阴性对照溶液，即得。3.2.2.4HPLC测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液20uL注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法以峰面积计算表儿茶素和苦参碱的含量，阴性样品溶液在于对照品色谱峰相同保留时间处无色谱峰出现，证明无阴性干扰。色谱图见图1621。3.2.3含量测定的方法学考察3.2.3.1标准曲线的制备分别精密吸取3.2.2.1中苦参碱和表儿茶素对照品溶液0.1，0.2，0.5，1，2，4mL置5mL量瓶中，苦参碱用甲醇稀释至刻度，表儿茶素用50%甲醇稀释至刻度，在3.2.1条件下进样分析。以进样浓度（gL-1）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，回归方程分别为苦参碱Y=1714.9X-3.8355（r=0.9999），表儿茶素Y=13346X+11.632（r=1.0000）。标准曲线图见图2223图22表儿茶素对照品标准曲线13图23苦参碱对照品标准曲线3.2.3.2精密度试验精密吸取同一浓度的对照品溶液，在3.2.1条件下进样6次，测得苦参碱和表儿茶素含量，结果显示RSD分别为0.57%和0.46%。表明实验仪器精密度良好。3.2.3.3稳定性试验取同一份供试品溶液，在室温下放置0、2、4、8、12、24、48小时后分别进样，依法测定，结果见表2和表3，软膏中表儿茶素的平均含量为1.444，RSD为1.1%（n=7）；软膏中苦参碱的平均含量为2.458，RSD为2.0%（n=7）。结果表明：供试品溶液在48小时内测定结果基本稳定。表2复方黑面神软膏稳定性考察（表儿茶素）时间（h）0248122448平均值RSD（%）表儿茶素含量(mg/盒)1.4361.4451.4251.4541.4321.4731.4331.4441.1表3复方黑面神软膏稳定性考察（苦参碱）时间（h）0248122448平均值RSD（%）14苦参碱含量（mg/盒）2.4972.4892.4652.5212.4122.3792.4432.4582.03.2.3.4重复性试验取同一复方软膏中的样品约5g，精密称定，各6份，按正文3.2.2.2项下方法制备供试品溶液，依法测定，结果见表4，5。复方黑面神软膏中表儿茶素的平均含量为1.433mg/盒，RSD为2.5%（n=6）；软膏中苦参碱的平均含量为2.433mg/盒，RSD为1.0%（n=6）。结果表明该方法有良好的重现性。表4复方黑面神软膏重复性试验结果（表儿茶素）编号含量（mg/盒）平均值（mg/盒）RSD（%）11.44121.39731.45541.43851.36561.4831.4332.5表5复方黑面神软膏重复性试验结果（苦参碱）编号含量（mg/盒）平均值（mg/盒）RSD（%）12.46722.43332.45142.42452.39362.4312.4331.0153.2.3.5加样回收率试验取已知含量的同一软膏中的样品约5g，精密称定，各6份，分两组，分别精密加入表儿茶素对照品溶液0.350mg和苦参碱对照品溶液0.600mg，按正文3.2.2.2项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率，结果见表6，7。复方黑面神软膏中表儿茶素平均回收率为97.7%，RSD为1.4%（n=6）；复方黑面神软膏中苦参碱平均回收率为97.6%，RSD为1.5%（n=6）。结果表明表儿茶素和苦参碱的加样回收试验良好，符合定量分析要求。表6复方黑面神软膏中表儿茶素回收率实验结果编号取样量（g）样品含量（mg）对照品加入量（mg）测得总量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）15.01220.35710.3500.693498.0625.01570.35830.3500.702299.1435.00110.35520.3500.687597.4945.00320.35640.3500.700199.1155.01180.35780.3500.678695.8765.00240.35570.3500.681296.5397.71.4表7复方黑面神软膏中苦参碱回收率实验结果编号取样量（g）样品含量（mg）对照品加入量（mg）测得总量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）15.01320.60720.6001.196799.1325.00340.60640.6001.186598.3535.01890.60870.6001.191398.5645.00150.60560.6001.175297.4897.61.51654.99120.60210.6001.168797.2265.02130.60920.6001.149495.053.2.3.6样品含量测定取复方黑面神软膏的样品3批，按正文3.2.2.2项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算供试品中表儿茶素和苦参碱的含量，结果见表8，9。表8复方黑面神软膏中表儿茶素的含量测定结果编号表儿茶素含量（mg/盒）0011.4280021.4530031.398表9复方黑面神软膏中苦参碱的含量测定结果编号苦参碱含量（mg/盒）0012.3870022.4510032.4284讨论4.1定性鉴别结果黑面神中薄层色谱鉴别参考文献较少,实验难度较大。根据于健东12等薄层色谱法鉴别儿茶中儿茶素和表儿茶素文献，用正丁醇-醋酸-水（3:2:1)为展开剂，5%硫酸乙醇溶液为显色剂105加热显色时，得到黑面神中表儿茶素的薄层色谱斑点不清晰且拖尾严重。后用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（70:10:20:0.5）为展开剂，10%硫酸乙醇试液为显色剂时，发现展开距离太短，斑点模糊。经过多次试验摸索最终确定使用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（70:10:30:0.5）为展开剂，25%磷钼酸乙醇溶液为显色剂，在110加热显色，所得结果斑点清晰分离17度好。其余4味药参考文献较多，在参照相关文献并进行预实验后鉴别效果理想，苦参、蛇床子、白鲜皮、地肤子均获得很好的分离效果，薄层斑点清晰，且阴性无干扰。4.2定量鉴别结果4.2.1检测波长的选择经查询2010版中国药典和大量苦参碱含量测定的相关文献，HPLC测定苦参碱含量时，所选用的波长为220nm，测定表儿茶素时选用的波长为280nm；王英晶在测量表儿茶素时，曾选用波长230nm，本实验过程中，对比了230nm和280nm波长下表儿茶素的峰值，在280nm下的效果较少，因此选用280nm作为表儿茶素的检测波长。4.2.2流动相的选择经查询2010版中国药典，苦参碱的测定是用氨基键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液(80:10:10)；但本次使用的色谱柱为C18柱，用药典的流动相在C18柱子上测定时，出现色谱峰分离度不好，出峰时间早的问题。考虑到最终要测定复方软膏中的两种成分，所以尝试摸索出一个流动相能在不同波长下测得两种成分。经摸索，选用王英晶测定表儿茶素含量时的流动相（甲醇-0.1%磷酸溶液）进行梯度洗脱，苦参碱的出峰时间为10.02min左右，峰型较好，且分离度也高。所以最终选用此流动相来测定软膏中表儿茶素和苦参碱的含量。3.2.3表儿茶素，苦参碱在同一液相色谱的条件下，经考察，在范围内的线性关系都良好，r都大于0.9998，得到的精密度，重复性和稳定性都很好，平均回收率在90%-110%之间，RSD分别为1.4%，1.5%。由此可得，以表儿茶素和苦参碱为指标成分，可以很好的控制本品软膏质量。5结论在本次实验中，所建立的高效液相色谱法，操作流程比较简单，测量的结18果比较准确且灵敏度较高，从而产品的质量可以得到稳定的控制，也为复方黑面神软膏的质量标准控制提供一定的依据。参考文献1姚启华神矾散的制备与用法J中国中医药信息杂志,1997,4(6):282刘仲霞,林红,苏伟东四种抗菌洗液杀菌效果的比较J中国消毒学杂志,2009,26(2):149-1503林挺,徐洁明中药洗剂治疗婴儿湿疹的疗效观察J实用医学杂志,2003，19(8):8294李东海,李勇,齐庆,等复方二藤洗剂治疗掌跖脓疱病疗效观察J陕西中医,2010,31(12):16265彭伟文,王英晶黑面神的药用历史及现代研究概况J今日药学,2014，24(07)：618-6226MartineMorrison,RoelvanderHeijden,PeterHeeringa,EricKaijzel,LarsVerschuren,RuneBlomhoff,TeakeKooistra,RobertKleemannEpicatechinattenuatesatherosclerosisandexertsanti-inflammatoryeffectsondiet-inducedhuman-CRPandNFkBinvivoJAtherosclerosis,2014(233):149-156.7王英晶,彭伟文,梅全喜黑面神枝叶中表儿茶素的含量测定及水提工艺优化J中国实验方剂学杂志,2014.20(9):93-96.198袁建平,吕艳,黄兴富等金芥麦配方颗粒的质量标准J中国药师,2012，15(5):643-644.9国家药典委员会中华人民共和国药典(一部)S北京：中国医药科技出版社2010:296.10王春桃,符洪白山片的薄层色谱鉴别方法研究J中国热带医学,2008,8(6):1036-1037.11林以慈,何昭斌,孙虹等归芍止痒颗粒质量标准研究J中华中医药学刊,2014,32(9):2182-2184.12蒋珍藕苦参碱的提取工艺及测定方法的研究进展J中医药导报,2005,11(8):91-94.13袁倬斌,李向军毛细管电泳安培检测法测定儿茶中的儿茶素,表儿茶素J分析实验室,2003,22:109-113.14毛丹,陈钶,王柯等HPLC法测定苦参软膏中苦参碱、槐定碱J中成药,2011,33(9):1531-1534.15高剑锋,易以木,邱娟HPLC法测定复方儿茶软膏中儿茶素和表儿茶素含量J药物分析杂志,2007,27(7):1105-1107.20综述黑面神和苦参的研究进展复方黑面神软膏由君药黑面神，臣药苦参和佐药蛇床子、白鲜皮和五味子五味中药组成，是具有消炎止痒功效外用制剂，用于多种皮肤病的治疗。近年来，对黑面神和苦参的药理作用和临床应用有较多的报道，为了给复方黑面神软膏的进一步开发利用提供一些科学依据和提高临床用药的准确性，本文将对其复方中的君药和臣药的化学成分、药理作用及临床应用的研究进展做一概述。1黑面神黑面神为大戟科植物黑面神Breyniafruticosa(L.)Hook.f.的干燥嫩枝叶,又名21青凡木，分布于广东、广西、海南、福建、云南、浙江、贵州等地，为广东常用地产药材，具有活血解毒、清热祛湿的功效。主要用于湿疹，缠腰火丹，腹痛吐泻，皮炎，漆疮，产后乳汁不通，风湿痹痛，阴痒等症的治疗1。1.1化学成分相关文献表明黑面神的叶子含有鞣质、三萜和酚类，种子含有脂肪油。M.Ilyas2首次在Breyniarhamnoides中检测到含有植物甾醇，包括胆甾醇、莱子甾醇和豆甾醇等化合物。浮光苗3对黑面神的化学成分进行了系统的研究。通过化学方法和波谱学方法(MS、IR、UV等)鉴定了其中的16个化合物，分别是aviculin、木栓醇、无羁萜、5-羟基-7，8，4-三甲氧基黄酮、表儿茶素等。另外，毛华丽4系统地对黑面神干燥地上部分进行了的化学成分研究，分离鉴定了15个化合物，其中包括熊果酸、咖啡酸、豆甾醇、香草醛、原儿茶醛、异佛尔酮等。1.2药理作用1.2.1抗炎作用根据有关文献报道，黑面神枝叶的水提物具有一定的抗炎作用。彭伟文等5通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验及腹腔注射醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高实验，并观察黑面神枝叶的水提物通过灌胃给药对炎症反应的影响，结果数据表明黑面神的水提物高、低剂量组对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀及由醋酸引起的组织毛细血管的通透性均具有极显著的抑制作用，从而表明了黑面神的水提液具有明显的抗急性炎症的作用。另外，将在小鼠右耳正反两侧涂上黑面神枝叶的水提物，通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验，观察黑面神外用给药对炎症反应的影响。结果数据显示，黑面神高、低剂量组、皮炎平对照组与空白对照组比较，对二甲苯致小鼠耳廓肿胀度在统计学上均具有显著性差异(P0.01)，表明黑面神的水提物外用给药时对急性炎性肿胀具有明显抑制作用，但不显示剂量依赖性。1.2.2抗病毒作用22孟正木等6研究鸡血藤、赤芍、芡实、白背叶、何首乌、三加皮、肾蕨和青凡木等8种中草药提取物对单纯疱疹病毒1型、水疱性口炎病毒、流感病毒A型、腺病毒3型及艾滋病毒逆转录酶活性，结果发现，青凡木(黑面神)对腺病毒、水疱性口炎病毒显示较低的CPIE，表明有强的抗病毒活性，但其细胞毒性大，ST1。1.2.3抑菌作用有文献报道7，将6只健康狗分为治疗组和对照组，静脉注入4亿绿脓杆菌造成绿脓杆菌败血症。治疗组每天每公斤体质量静脉注射24毫升5%黑面神注射液,7天为一个疗程，对照组不予治疗处理。实验期间每天抽血培养。结果显示，治疗组用药后平均57天细菌培养转为阴性，对照组10天后抽血培养仍有绿脓杆菌生长，表明黑面神有较好的抑菌作用。另据报道8，1:1200黑面神的流浸膏稀释液在试管内对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、大肠杆菌和甲型链球菌均有很强的抑菌作用，可能与其所含鞣质有关，还有待进一步研究。1.2.4抗皮肤I型超敏反应作用彭伟文等9给小鼠灌胃黑面神水提物，采用尾静脉注射低分子右旋糖酐诱发小鼠阵发性皮肤瘙痒，记录小鼠30min内的阵发性皮肤瘙痒发作次数及时间，以组胺使小鼠毛细血管通透性增高观察药物对通透性的影响，从而探讨黑面神水提物抗皮肤I型超敏反应作用。结果数据显示，黑面神水提物各剂量组均能明显抑制阵发性皮肤瘙痒发作次数，降低持续时间，显著抑制小鼠毛细血管通透性，表明黑面神水提物可通过抑制组胺的释放发挥抗皮肤I型超敏反应作用。1.3临床应用祖国中医药对黑面神的临床应用有着一定的文字记载，其临床应用主要包括治疗各类皮肤病、治疗慢性支气管炎、治疗各类咬伤等。全国中草药汇编记载:“黑面叶(鲜)30g,东风橘、芒果叶各15g，红糖9g。水煎服，每日1剂治疗慢性支气管炎。”现代临床应用中，黑面神合剂23新复方7治疗慢性气管炎262例，服药后在短期内临床症状缓解迅速，疗效稳定，复发率低，是治疗慢性气管炎疗效较好的方剂且没有明显副作用。福建药物志记载:“黑面神叶、百部各60g。水煎冲明矾适量，洗患处治漆过敏，湿疹。”相关文献报道，神矾散对于接触性皮炎、皮肤瘙痒证、脚气病、冻疮、湿热隐疹等症有效，对于接触漆或红花油引起的皮肤过敏有特效10。广西民间常用中草药载曰：“青凡木叶、黄糖各适量，捣烂，敷患处。”岭南草药志载曰：“黑面神叶、蛇总管、黑骨走马，捣烂取汁，再用洗米水将药煎汤1小碗，加入药汁和服，药渣外敷伤口周围治蛇咬伤。”2苦参苦参为豆科植物苦参SophoraflavescensAit.的干燥根。春、秋二季采挖，除去根头和小支根，洗净，干燥，或趁鲜切片，干燥。性味归经：苦，寒。归心、大肠、胃、肝、膀胱经。功能主治：清热燥湿，杀虫，利尿。用于便血，黄疸尿闭，热痢，湿疹，湿疮，皮肤瘙痒，赤白带下，阴肿阴痒，疥癣麻风，外治滴虫性阴道炎11。2.1化学成分12目前，研究表明苦参中分离经鉴定的化学成分主要有两大类：生物碱类,黄酮类化合物。从苦参根、叶、茎和花中共分离出23种生物碱，大多数为喹嗪生物碱，主要有苦参碱、槐果碱、氧苦参碱、臭豆碱、槐安碱、槐定碱别苦参碱等。从苦参总黄酮部分分离和鉴定了约60余个黄酮类化合物，其中苦参中的黄酮类化合物大多为二氢黄酮、二氢黄酮醇。显示活性的主要有苦参酮、苦参醇、槐黄醇、苦参啶、高丽槐素、去甲苦参、苦参啶醇和黄腐酚等。从苦参中还分离出植物血凝素、挥发油、脂肪酸、大豆甾醇B、大黄酚、胞嘧啶、sophoradione等化学成分。2.2药理作用2.2.1抗炎作用24谭元生等13研究发现复方苦参洗液对二甲苯和角叉菜胶所致的炎性肿胀具明显抑制作用,并具有较好增强细胞免疫功能和止痒作用。另外，刘玮等14以实验动物建立模型,观察以中药苦参醇提液研制的女性护理液的抗炎、止痒作用。结果发现以苦参醇提液和三氯羟基二苯醚复配，其抗炎和止痒作用均接近地塞米松磷酸钠注射液，间接表明苦参具有抗炎作用。焦霞等15建立小鼠哮喘模型,观察氧化苦参碱对哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液中炎性细胞、肺组织病理的改变，检测肺组织IL-4mRNA表达的变化，从而探讨氧化苦参碱治疗哮喘的抗炎作用机制及其对白细胞介素-4(IL-4mRNA)表达的影响。结果显示氧化苦参碱可显著减轻哮喘小鼠气道及肺组织中嗜酸性细胞的浸润,抑制哮喘小鼠肺组织中IL-4mRNA的表达水平。表明氧化苦参碱对哮喘小鼠有明显的抗气道变应性炎症及抑制IL-4mRNA表达的作用。2.2.2抗菌作用根据国内学者所做的的体外实验证实，苦参对多种病原体有抗菌抑菌作用。如今已知苦参碱、氧化苦参碱、三叶豆檀甙、槐定碱、高丽槐素是抗菌的活性成分。苦参对痢疾杆菌、变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和乙型链球菌有明显抑制作用。杨洁等16用中药抑菌方法,对苦参提取物进行208株表皮葡萄菌的最低抑菌浓度(MIC)测定。结果显示,苦参提取物对208株表皮葡萄球菌中的110株耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)和98株甲氧西林敏感表皮葡萄球(MSSE)的MIC90分别为1185g/mL和286g/mL,表明苦参提取物对208株表皮葡萄球菌具有较强的抑菌作用。陈亚军17用其治疗慢性乙肝患者40例并与对照组40例疗效进行比较,结果HBeAg转阴率为35%,HBV_DNA转阴率为38%,明显优于对照组(P0.05),表明苦参素具有良好的抗病毒作用。2.2.3抗过敏作用金四立等18采用被动皮肤过敏试验检测血清IgE水平;间接空斑形成细胞法检测抗体形成细胞;间接免疫荧光法检测淋巴结TH/Ts比值。结果显示苦参对小鼠血清IgE、抗体形成细胞及TH/Ts比值均无明显影响。结果表明苦参具有抗过敏作用。252.3临床应用2.3.1治疗湿疹目前国内有学者对各型湿疹患者进行了研究。徐国红19分别给治疗组和对照组注射主要含氧化苦参碱的苦参素注射液和葡萄糖酸钙，结果表明苦参素注射液对各型湿疹均有明显疗效，对急性、亚急性患者尤为显著，并且与对照组有显著性差异。2.3.2治疗肺结核李云华等20对82例HBVM阳性肺结核患者分成治疗组42例,在常规抗痨治疗的同时,给予苦参素胶囊200mg,每日三次口服。对照组40例,只给予常规抗痨治疗。结果发现对照组肺结核患者在治疗2、4个月时肝功能异常率和治疗组相比有显著性差异。结果表明苦参素对HBVM阳性肺结核患者的肝功能有明显的保护作用。2.3.3治疗银屑病苦参碱有抗炎和调节免疫的作用，并且可以抑制角朊细胞的增殖，皮肤角朊细胞异常增殖和分化是银屑病的主要病理特征。景卫霞等21将138例寻常型银屑病