化橘红提取物中总黄酮测定方法比较研究

化橘红提取物中总黄酮测定方法比较研究摘要：目的对比3种常见总黄酮测定方法（国家食品药品监督管理局颁布的保健食品检验与评价技术规范实施手册收载的保健食品总黄酮测定方法(直接紫外分光光度法测定)；2010版中国药典收录的铝盐络合法；国际公认的较为科学合理的是美国康奈尔大学刘瑞海教授的SodiumBorohydride/Chloranil-BasedAssay(简称SBC法)。方法以化橘红中总黄酮的含量为指标，从精密度、回收率、重复性、稳定性方面选取最优测定方案。结果测定结果显示铝盐络合法测得值显著大于保健食品法和SBC法测得值。结论化橘红黄酮类成分主要为二氢黄酮成分，在碱性条件下不稳定，因此不宜应用在碱性条件下操作的芦丁比色法，应用铝盐直接与黄酮类成分显色的原理，采用柚皮苷+铝盐的方法进行总黄酮测定。测定结果显示铝盐络合法测得值显著大于紫外分光光度法和SBC法测得值。关键词：化橘红；黄酮；测定方法IStudyonTotalflavonoidsinExocarpiumcitriGrandisextractcomparativemethodAbstract：ObjectiveComparisonof3methodsforthedeterminationoftotalflavonoids(commonmethodusedmanualhealthfoodoftotalflavonoidsofimplementingtechnicalstandardsfortestingandassessmentofhealthfoodwaspromugatedbytheStateFoodandDrugAdministration(bydirectultravioletspectrophotometry);2010EditionPharmacopoeiaincludedChinesealuminumsaltcomplexing;internationallyrecognizedmorescientificandreasonableisaprofessorattheCornellUniversityLiuRuihaiSodiumBorohydrid/Chloranil-BasedAssayAmerica(SBC).Selectthebestfromtheprecision,recoveryrate,stabilityandotheraspectsofmeasurement.MethodsThecontentoftotalflavonoidsinorangeastheindicator,theprecision,recovery,repeatability,stabilitydeterminationofoptimalselectionofschemes.ResultsTheresultsshowedthealuminumsaltcomplexingmeasuredvaluewassignificantlyhigherthanthatofhealthfoodandSBCmeasuredvalue.ConclusionFlavonoiswithpolyamidecolumnchromatographyareselectivelyenrichedcontainingphenolichydroxylradicalsbyUVspectrophotometry,withoutcolordetermination,theresultisaccurateandsimple,reasonabledeterminationmethod.Keywords：ExocarpiumcitriGrandis，Flavone，assaymethod目录摘要III1前言32材料与仪器52.1材料52.2仪器53方法与结果53.1紫外分光光度法53.2铝盐络合法73.3SBC法93.4总黄酮含量测定114讨论124.1紫外分光光度法机理124.2铝盐络合法机理124.3SBC法反应机理124.4测定方法的比较12参考文献14综述15致谢2201前言目前，国际上对中药的利用和研究产生了浓厚的兴趣，传统中药越来越受到人们的青睐，具有很高的利用价值和潜在的市场前景。化橘红是我国特有的传统中药材，古代记载和现代研究表明化橘红内含多种活性成分，具有化痰、理气、健脾、消食、散寒等作用，始于胸中痰滞，风寒咳嗽，喉痒气喘，饮食积滞，呕吐痞闷等症。化橘红黄酮类化合物是目前研究的热点之一。中药化橘红(ExocarpiumcitriGrandis)又名“化州橘红”、“化州陈皮”、“柚皮橘红”等，是由芸香科(Rutaceae)植物化州柚(Citrusgrandis(L.)Osbeckvar.tomentosaHort.)或柚(Citrusgrandis(L)Osbeck)未成熟或近成熟的果实外果皮干燥而成。化州柚原产于广东省化州市，果实比较小，果瓤酸苦。人们将未成熟果皮制得的化橘红称为“毛橘红”，近成熟的称为“光橘红”，两者均有助于消食、利气、散寒、化疲，主治风寒咳嗽、痰多气逆、食积暖气和呕恶痞闷等证1。为了探究化橘红的功能性质，对其化学成分进行研究发现：化橘红主要有效成分有黄酮类化合物、挥发油、香豆素类化合物、多糖等2。近年来，国际上掀起了新一轮的中医药热。自古以来，中药一直在中华民族的防病治病方面具有举足轻重的作用，即便是在今天，医学技术飞速发展，中药在人们的日常防治疾病中仍然扮演着重要角色。传统中医药被誉为“天然药物”、“绿色药物”等，逐渐成为世人青睐的对象。我国地大物博，中药材资源非常丰富，主要来源于自然界，分布广泛，品种繁多。当品种、产地、采集时间、加工方法等因素中的一项或几项不同时，中药材的质量也各不相同，而临床疗效与中药材质量密不可分。同时，中医药发展的国际环境也发生了深刻的变化。自古以来，化橘红就有着“南方人参”、“一片值一金”之称，被誉为“中华一宝”。它曾获得世界华人协会推荐产品、21世纪国际健康绿色环保产品“金象金奖”、2001年度国际农业博览会推荐名优产品等荣誉。本文主要针对化橘红黄酮类化合物的测定方法进行深入研究。黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，是植物在长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物3。它广泛存在于高等植物及羊齿植物的根、茎、叶、花、果实等中4，不仅数量种类繁多，而且结构类型复杂多样。黄酮类化1合物因其独特的化学结构而对哺乳动物和其它类型的细胞具有许多重要的生理、生化作用。一方面，黄酮类化合物具有高度的化学反应性，例如，它能清除生物体内的自由基，具有抗氧化作用56；另一方面，黄酮类化合物又具有很多重要的药理作用，对许多人类疾病具有治疗价值。它们拥有抑制酶的活性、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎症、抗过敏、抗糖尿病并发症等功能，且无毒无害，对人类的肿瘤、衰老、心血管病等退变性疾病的治疗和预防有重要意义，它作为弱雌激素，在治疗妇女更年期综合症方面有很好的应用前景。此外，黄酮类化合物还是茶及众多中草药如黄芩、银杏、沙棘等的活性成分。因此，引起了国内外化学家、药物学家的广泛重视，研究进展很快。黄酮类化合物是广泛存在于自然界的、泛指两个苯环通过三个碳原子相互联结而成的一系列化合物，包括黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查尔酮、异黄酮类等化合物。很多黄酮类化合物具有生理活性，例如芦丁、槲皮素等能够增强心脏收缩,减少心脏搏动数；杜鹃素具有止咳祛痰作用；黄芩苷具有抗菌消炎作用；汉黄芩素具有抑制肿瘤细胞作用；水飞蓟素具有保肝作用等7。黄酮类化合物具有C6-C3-C6基本骨架，并且大都呈黄色，其生色团的基本结构是吡酮环和羰基，黄酮物质的呈色是由羟基的数目，结合的位置与交叉共扼体系共同决定的。黄酮、黄酮醇多呈灰黄到黄色；查耳酮为黄至橙黄色，二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类，不呈黄色，几乎为无色；花色素所显的颜色，随pH不同而改变。黄酮类化合物因大部分含有酚羟基，显酸性，易溶于碱性溶液；其分子中-吡喃酮环上的1-氧原子，因有未共用电子对，故表现出微弱的碱性，可与强酸溶液反应。目前关于总黄酮的测定方法报导较多，收载入相关国家标准的有2种方法，国家食品药品监督管理局颁布的保健食品检验与评价技术规范实施手册收载的保健食品总黄酮测定方法(采用的是直接紫外测定法)；2010版中国药典收录的“铝盐络合法”8。另外，国际公认的较为科学合理的是美国康奈尔大学刘瑞海教授的SodiumBorohydride/Chloranil-BasedAssay（简称SBC法）9。此三法的准确性、合理性比较研究尚未见报道。本试验以化橘红提取物为研究对象，以其总黄酮含量为评价指标，比较了上述3种方法对其含量测定的影响，2为化橘红中总黄酮最佳测定方法的优选提供依据。2材料与仪器2.1材料聚酞胺粉(柱层析用，60-80目，浙江台州市路桥四甲生化塑料厂)；水为怡宝水；盐酸(广州化学试剂厂，批号20100605)、冰乙酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，20110603)、丙酮、甲醇(广东光华科技股份有限公司，批号20111126)，硝酸铝(天津市科密欧化学试剂有限公司，20100710)、四氢硼钠NaBH4(天津市北联精细化学品开发有限公司，20110420)、氯醌chloranil(AladdinChemistry，批号30560)、香草醛vanillin(天津市大茂化学试剂厂)、四氢呋喃THF(天津市富宇精细化工有限公司，20100705)，氯化铝(汕头市光华试剂厂，批号20040108)，柚皮苷对照品(北京世纪奥科生物技术有限公司，HPLC98%,20mg/支)，化橘红总黄酮提取物样品。2.2仪器8453E型紫外可见分光光度计(美国Agilent)，BP211-D型电子天平(德国Sartorius公司)，KQ-500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，XT220A万分之一天平(Precisa公司)，HH-S6数显恒温水浴锅(常州普天仪器制造有限公司)，Rayto酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)。3方法与结果3.1紫外分光光度法3.1.1芦丁对照品制备精密称取经105干燥至恒重的芦丁标准品5.0mg，加甲醇溶解并定容至100mL，即得0.050mg/mL芦丁标准溶液。33.1.2样品溶液的制备取供试品0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，超声提取20min，静置，备用。3.1.3标准曲线的绘制吸取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于lOmL比色管中,加甲醇至刻度，摇匀，于波长360nm比色。以对照品溶液浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程为y=0.0271x-0.0352（R=0.9993，线性范围为0.0049-0.0251mg/mL）。3.1.4精密度试验取芦丁供试品溶液(0.01483mg/mL)，连续测定5次，结果其吸光度均值为0.3667，RSD为0.0007%，表明精密度良好。3.1.5重复性试验精密称取供试品0.2g，平行5份，制备供试品溶液，于波长360nm下测定其吸光值，结果其含量均值为20.62mg/g，RSD为1.45%，表明重复性较好。3.1.6稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0、15、30、45、60min时测定其吸收度，结果其吸光度均值为0.3318，RSD为0.19%，说明供试品溶液在60min内是稳定的。3.1.7加样回收率试验精密称取己测含量的化橘红总黄酮粉末，加入芦丁进行试验，结果其平均回收率为99.31%，SR为1.35%，结果见表1。4表1加样回收试验（紫外）P回收率/%序号总黄酮含量(mg)m取样(g)m样本总黄酮(mg)m芦丁加入(mg)m总黄酮测得(mg)XXRSD%150.50313.8952.586.40697.33250.53.8712.586.42899.11350.50113.882.546.61599.21450.50273.8922.576.45999.88550.50093.8782.526.628101.0299.311.353.2铝盐络合法3.2.1柚皮苷对照品溶液的制备取110干燥至恒重的柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.6mg/mL的溶液作为储备液，备用。3.2.2供试品溶液的制备取化橘红总黄酮粉末约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取0.1mL至10mL量瓶中，加入10%硝酸铝溶液0.2mL，加甲醇至刻度，摇匀，即得。3.2.3标准曲线的绘制分别精密量取“3.2.1”项下储备液溶液0.033、0.066、0.133、0.167、0.2、0.267、0.333mL至10mL量瓶中，分别加入10%硝酸铝溶液0.2mL，加甲醇至刻度，摇匀，放置15min。另取10%硝酸铝溶液0.2mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，作为空白对照溶液，于306min处测定吸光度(见图1)，以柚皮苷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求得总黄酮回归方程为：y=32.615x+0.0364（R=0.9995，线性范围2g/mL-520g/mL），见图2。图1铝盐络合法样品全波长扫描图图2化橘红总黄酮标准曲线3.2.4精密度试验取柚皮苷对照品溶液(0.0165mg/mL)，连续测定5次，结果其吸光度均值为0.7017，RSD为0.11%，表明精密度良好。3.2.5重复性试验精密称取同一供试品10mg，平行5份，按上述方法测定含量，结果其含量均值为0.01068mg/mL，RSD为4.54%，表明该方法的重复性较好。3.2.6稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0、15、30、45、60、90min时测定其吸收度，6结果其吸光度均值为0.6824，RSD为2.13%，说明供试品溶液在90min内稳定。3.2.7加样回收率试验精密称取一定量样品，准确加入柚皮苷对照品，按上述方法制备，依法测定吸收度，代入回归方程，计算回收率，结果其平均回收率为106.96%，RSD=1.21%。结果见表2。表2加样回收试验（铝盐）序号总黄酮含量(mg)柚皮苷加入量(mg)回收量(mg)回收率%均值%RSD%15.165.00110.290105.2125.165.00111.674108.3435.165.00111.157108.4545.165.00110.500106.2355.165.00111.719107.3265.165.00110.791106.2106.961.213.3SBC法3.3.1柚皮苷对照品溶液的制备取110干燥至恒重的柚皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.6mg/mL的溶液作为储备液，备用。3.3.2供试品溶液的制备取125L样品乙醇溶液再加入125L四氢呋喃，加入125L四氢硼钠溶液、125L三氯化铝溶液，摇匀室温30min。然后再加入125L四氢硼钠，摇匀室温30min。加入冰醋酸溶液(500L，4)，摇匀后避光反应15min。加入250L氯醌，90震摇加热60min，自来水冲洗降温，最终溶液用甲醇定容至1mL。加入250L香草醛，摇匀。加入500L盐酸摇匀后避光反应15min，即得。73.3.3测定方法将移取适量反应液加入96孔板，490mn波长下记录紫外吸光度值。总黄酮含量以每100g样品相当于mg柚皮苷表示。根据A=EcL,A1/A2=C1/C2，得出总黄酮的含量。3.3.4标准曲线的绘制分别制备0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.3、0.6、l.Omg/mL对照品溶液，按上述的条件进行测定，以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。求得总黄酮的冋归方程为：y=0.3946x+0.2282(R=0.9996，线性范围0.125g-125g)，见图3。图3化橘红总黄酮标线（SBC法）3.3.5精密度试验取柚皮苷对照品溶液(0.0165mg/mL)，连续测定5次，结果其吸光度均值为0.2271，RSD为0.92%，表明精密度良好。3.3.6重复性试验精密称取同一供试品10mg，平行5份，按上述方法测定含量，结果其含量均值为0.01068mg/mL，RSD为2.34%，表明该方法的重复性较好。83.3.7稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0、15、30、45、60、90min时测定其吸收度，结果其吸光度均值为0.4319，RSD为4.86%，说明供试品溶液在90min内是稳定的。3.3.8加样回收率试验精密称取一定量样品，准确加入柚皮苷对照品，按上述方法制备，依法测定吸收度，代入回归方程，计算回收率，结果其平均回收率为87.8%，RSD=2.11%。结果见表3。表3加样回收试验（SBC）序号总黄酮含量(mg)柚皮苷加入量(mg)回收量(mg)回收率%均值%RSD%10.1870.180.36688.3420.1870.180.35186.2130.1870.180.33988.6640.1870.180.32085.8150.1870.180.34487.360.1870.180.35190.8787.82.113.4总黄酮含量测定利用三种总黄酮测定方法测定6批相同的样品，对比其含量测定差异。结果见表4。表4总黄酮含量测定方法比较总黄酮含量（mg/g）样品紫外分光光度法铝盐络合法SBC法120.6260.6442.54226.4267.3449.12323.3362.4344.29428.3159.2336.219522.3958.2134.52618.2164.3549.424讨论4.1紫外分光光度法机理紫外分光光度法是通过可见-紫外分光光度计，产生可见光，紫外线照射某些不同物质，不同浓度的吸收光谱的不同，可获得不同吸收光谱的曲线，同时它们的吸收峰数值与浓度成正比关系，遵循朗伯-比尔定律，不仅能鉴别物质及测定物质的含量，而且能和其他方法配合，研究物质的组成。10采用聚酰胺柱层析纯化总黄酮类化合物，主要因为黄酮类化合物大多具有酚羟基，可被聚酰胺吸附，而与不含酚羟基的成分分离，也能排除叶绿素的干扰。4.2铝盐络合法机理黄酮类化合物中的3-羟基，4-羟基或5-羟基，4-羰基或邻二酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色络合物。用分光光度法于502nm波长下测定其吸光度，与芦丁对照品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。4.3SBC法反应机理含有4羰基取代的黄酮类在四氢硼钠和三氯化铝的作用下，转变为四羟基取代黄酮。四羟基黄酮被氯醌-醋酸溶液氧化为花青苷类。花青苷类在与香草醛和浓硫酸作用下，可以在490nm下测量。4.4测定方法的比较通过化橘红黄酮提取液的全波长扫描，其吸收度和柚皮苷标准液的吸收度图谱基本相同，故选择以柚皮苷为对照品进行含量测定。根据紫外全波长扫描及黄酮类化合物的特性，故铝盐络合法中选择了306nm作为检测波长。同理，在紫外分光光度法中选择360nm作为检测波长，SBC法中选择490nm作为检测波长。10总黄酮是化橘红的主要有效成分，柚皮苷是化橘红中总黄酮的主要成分之一，因此，在临床应用中以柚皮苷作为化橘红质量控制指标来制订质量标准具有较强的可操作性。本实验建立了紫外分光光度法、铝盐络合法、SBC法测定化橘红中总黄酮含量的方法，并研究了三种方法各自对其精密度、重复性、稳定性、加样回收率进行对比。自然界约有3000种黄酮类化合物，其经典概念是指基本母核为2-苯基色原酮的一类化合物，大部分与糖结合成苷。UV是鉴定黄酮类化合物的一种重要技术，目前被广泛应用来测定中药中的总黄酮12-13。黄酮类化合物多具有3，4，5羟基，可与许多金属试剂反应生成有色络合物，根据此特点可以利用UV来测定总黄酮的含量11化橘红黄酮类成分主要为二氢黄酮成分，在碱性条件下不稳定，因此不宜应用在碱性条件下操作的芦丁比色法，应用铝盐直接与黄酮类成分显色的原理，采用柚皮苷+铝盐的方法进行总黄酮测定。测定结果显示铝盐络合法测得值显著大于紫外分光光度法和SBC法测得值。SBC方法是较为先进的国际公认的总黄酮测定方法，主要利用各种黄酮类成分可经过一系列反应全部转化为花青苷类，在490nm波长下可与香草醛和浓硫酸发生显色反应，但由于反应过程步骤较多，该方法的稳定性还有待考察。紫外分光光度法法用聚酰胺柱层析选择性地富集含有酚羟基的黄酮类化合物，不需经显色直接测定，其结果准确、简便，测定方法较为合理，但操作过程中用到剧毒物质苯，对操作人员身体健康不利。0参考文献1中华人民共和国药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)S.北京：化学工业出版社，2005：149.2曹纬国，刘志勤，邵云.黄酮类化合物药理作用的研究进展J.西北植物学报，2003，23(12)：2241-2247.3HuangMS，ZhouZC.Determinationofnaringincontentsinpummelo(CitrusgrandisorC.grandisvartomentosa)peelJ.ChinTraditHerbDrugs(中草药)，1984，15(5)：11.4Morimoto，M.；Tanimoto，K.；Nakano，S.；Ozaki，T.；Nakano，A.；Komai，K.J.Agric.FoodChem.2003，51，389.5Bandele，O.J.；Osheroff，N.Biochemistry2007，46，6097.6Saija，A.；Scalese，M.；Lanza，M.；Marzullo，D.；Bonina，F.；Castelli，F.FreeRadicalBiol.Med.1995，19，481.7肖崇厚.中药化学.上海:上海科学技术出版社,1997：265.8曹根生.脉安冲剂总黄酮的含量测定方法的初步研究J.中成药研究，1981，6(12):1315.9XiangjiuHe,RuiHaiLiu.Anovelsodiumborohydride/chloranilbased(SBC)assayforquantifyingtotalflavonoidsJ.JournalofAgriculturalandFoodChemistry，2008，56:9337-9344.10袁久荣主编.中药鉴别紫外谱线组法及应用.北京：人民卫生出版社，1999：130170.11陈新，叶文峰.萎蒿素原粉中总黄酮提取及含量测定J.江西师范大学学报，2000，24(2)：164-16612周多刚，韩兆锦.蜂胶制成品中总黄酮含量的测定J.安徽机电学院学报，2000，15(1)：67-7113张培琴，林开忠.木香顺气丸中黄酮类化合物含量测定的初步研究J.贵阳中医学院学报，2000，22(1)：41-420综述中药和中药制剂中总黄酮类化合物含量测定方法1概述黄酮类化合物是一类重要的天然色素，也是中药中的有效成分。它多分布于被子植物中，以唇形科、爵麻科、玄参科、菊科等存在较多。大多与糖结合成苷，为黄酮苷类，有的以游离形式存在，为游离黄酮或黄酮苷元。同一植物中可能同时存在游离黄酮及其苷类。黄酮类化合物泛指两个苯环(A环与B环)通过中央三碳链相互连接而成的一系列化合物。其大多具有C6-C3-C6的基本骨架，且常有羟基、甲基、甲氧基、异戊烯基等取代基。黄酮消炎、止咳、平喘的效果较好，是化橘红的主要有效成分之一。化橘红的黄酮类物质主要含有柚皮苷，还有少量的野漆树苷、积属苷、新陈皮昔等（现代实用本草，2000)。近年来，现代中医学的研究表明，天然植物药中的黄酮类化合物具有降血糖、降血脂、降低心肌耗氧量、抗心律不齐、软化血管、使冠脉和脑血管流量增加等功能。植物中总黄酮的测定方法主要包括高效液相色谱法、三氯化铝比色法、毛细管电泳法、紫外分光光度法等。目前，中药提取物的总黄酮含量测定一般采用的是高效液相色谱法。柚皮苷可以从蒸去挥发油的残渣水溶液中得到(葛发欢，元四辉，1989)。柚皮苷和野漆树苷除了上述方法以外，还可以利用溶剂提取和通过柱层析分离的方法也可以(雷海民等,2000)。黄美声等(黄美声，1984)选取了30个不同产地、不同品种的化橘红作为实验样品，采用四氢硼钾还原比色法测定了其中的柚皮苷含量，结果显示：30个样品中有24个的柚皮苷含量分布在1.86.0%之间，含量最高的是正毛橘红胎，达到了30%以上。他们还提出含量与果皮成反比，即果皮越成熟，含量越低：外果皮含量低于中果皮。之后，他们又选取了23个样品，也测定了其中的柚皮苷含量，采用的是高效液相色谱法，实验结果和前面的基本一致。柚皮苷含量还与产地有关，广1东的化州、广西的横县和宜山这三个地方产的化橘红较为著名，蔡春等(1997)比较了这三个产地的化橘红的总黄酮含量，采用的是分光光度法。结果表明，产自宜山的化橘红总黄酮含量最低，产自化州的总黄酮含量较高。品种不同，柚皮苷含量也不同。袁旭江等研究表明，若为毛橘红，其柚皮苷含量较高，并且果皮直径如果较小，其中的柚皮苷也比直径大者要高，至于野漆树苷，也是毛橘红中的含量较光橘红要高，基本是后者的两倍(袁旭江，2004)，实验中采用的是高效液相色谱法。测定方法采用薄层色谱法和高效液相色谱法结合。在毛橘红的乙酸乙酯部位存在新黄酮类化合物，可以分离得到，如柚皮苷元、芹菜素等。柚皮苷元含量的测定方法与柚皮苷不同，需采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，原料为不同品种化橘红，结果表明，各个品种的化橘红，其柚皮苷元含量稳定，毛橘红与光橘红中的柚皮苷元含量也无明显差异(袁旭江等，2004)。张超洪等(2009)采用高效液相/紫外-可见波长检测器(HPLC/UV-VIS)法，对采自广东省化州市的10个不同生长地域的化橘红中的7种黄酮类成分进行了测定。结果表明，化橘红中的黄酮类成分主要是柚皮苷，在同一时间取自10个不同地方的化橘红样品中，柚皮苷含量差异很大，最高含量可达176.075mg/g，最少的也有58.860mg/g以上。2现状黄酮类化合物是广泛存在于自然界的、泛指两个苯环通过三个碳原子相互联结而成的一系列化合物，包括黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查尔酮、异黄酮类等化合物。很多黄酮类化合物具有生理活性，例如芦丁、槲皮素等能够增强心脏收缩，减少心脏搏动数；杜鹃素具有止咳祛痰作用；黄芩苷具有抗菌消炎作用；汉黄芩素具有抑制肿瘤细胞作用；水飞蓟素具有保肝作用等1。作为一类受到广泛重视的生理活性物质，关于测定中草药、中药制剂中总黄酮类化合物含量的研究资料比较丰富，中华人民共和国药典2000年版一部(以下简称药典)、卫生部药品标准中药成方制剂(以下简称部颁标准)中相当一部分药物以测定总黄酮类化合物含量作为药物的质量标准。22.1对照品测定法约有1/5的药品标准、文献以中草药、中药制剂自身所含的黄酮类化合物作为对照品，在紫外区测定或经显色后在可见光区测定，选择对照品的最大吸收波长处进行测定，其优点在于对照品与被测物质具有相同的结构母核，直接测定或经金属离子络合显色后，对照品以及供试品的紫外光谱相似度高，两者的最大吸收波长可基本重叠。吕德屏等以黄芩苷(乙醇)为对照品，于276nm处建立了测定芩栀口服液中总黄酮的方法2。陈惠玲等以淫羊藿苷(甲醇)作对照，于274nm处分析了精毛淫羊藿及其不同炮制品中的总黄酮的含量3。除药典收载的对照品，不少科研工作者以从被测中草药中分离鉴定的黄酮类化合物作为对照品。何桂霞等以二氢杨梅素(甲醇)为对照品，经AlCl3显色后，于314nm处测定研究了藤茶中总黄酮类化合物的含量4，供试品与对照品图谱高度相似。杨吴华等以广金钱草中含量较高的黄酮成分6-C-葡萄糖-8-C-木糖洋芹素为对照品，采用柱色谱-紫外分光光度法，于272nm处测定了广金钱草中总黄酮的含量5。2.2黄酮Al(NO3)3盐络合2.2.1Al(NO3)3NaNO2NaOH络合法该法主要以芦丁为对照品，先用NaNO2还原黄酮，再加Al(NO3)3络合，最后加NaOH溶液显色，产生红色化合物进行比色测定，是使用最广泛的中草药、中药制剂总黄酮类化合物测定法，在上述药品标准、文献中总使用频率为209次，吴巧凤等以50%乙醇为溶剂，显色后于509nm处测定了六月霜中总黄酮含量6；花仲卉等以水为溶剂，显色后于500nm处测定广枣醇提物中总黄酮的含量7。2.2.2Al(NO3)3络合法席荣英等以芦丁(水)为对照，与Al(NO3)3显色后，在271nm处进行了半枝莲中总黄酮含量测定研究8；张文等以芦丁(水)为对照，与Al(NO3)3显色后，在271nm处进行了豫北地区黄芩总黄酮含量测定研究9；杨红以芦丁(75%乙醇)3为对照，与Al(NO3)3显色后，在420nm处进行了芜著茎叶中黄酮类物质含量初探10。2.3黄酮AlCl3盐络合法2.3.1AlCl3络合法刘春宇等以芦丁(水)为对照，与AlCl3络合后，在415nm处测定了沙苑子总黄酮含量11；李晓妮以芦丁(60%乙醇)为对照，与AlCL3络合后，420nm处研究了几种提取分离方法对山植中总黄酮的提取效率12。2.3.2AlCl3醋酸盐络合法钟永祥以芦丁(60%乙醇)为对照，与AlCl3NaOAc络合后，于460nm处测定了结肠康颗粒剂中总黄酮的含量13；樊淑彦等以芦丁(水)为对照，与AlCl3-KOAc络合后，于415nm处测定了荷叶中总黄酮的含量14。2.4高效液相(HPLC)法主要用于银杏叶及其制剂，按照药典15规定，以槲皮素、山柰酚、异鼠李素为对照品，以三者总含量乘以系数得出银杏叶及其制剂中总黄酮醇苷含量。管玉民等用该法研究了气候、季节、树龄对银杏叶总黄酮含量的影响16；佘佳红等以槲皮素、山柰酚为对照，按照经验公式：总黄酮苷含量=2.64山柰酚+2.51槲皮素,采用SFE-HPLC法测定了银杏叶粗提物中黄酮类化合物的含量17。2.5荧光分光光度法黄酮化合物的荧光光度测定法尚不多见，已知桑色素用于铍的荧光光度测定有很高灵敏度18。当黄酮分子中具有3-羟基(5-羟基)时，可与Al3+、铍等离子配位络合显色，成为荧光光度测定黄酮类化合物的基础。桑色素为3，5，7，2，4-五羟基黄酮，常被用作黄酮类化合物荧光光度测定法的标4准，邓淑华等以桑色素-铝络合物(乙醇)为对照，以420nm为激发波长，510nm为测量波长，测定了山楂、牡荆子等药材中总黄酮化合物含量，与芦丁作对照的铝盐显色分光光度法结果相符，且具有检出限低，灵敏度高的优点19；廖声华等以桑色素-铝络合物(乙醇)为对照，选择激发波长ex=365nm，发射波长em=499nm，测定了银杏叶中的黄酮含量，提高了检测灵敏度20。2.6其他方法胡钢亮等采用近红外漫反射光谱法对已知总黄酮含量的样品1100-2500nm处扫描建立样本数据库，以改进偏最小二乘法(MPLS)建立预测数学模型，对预测集样品进行分析，结果预测值与HPLC真值的相关系数(r)为0.973，结果准确且提高了检测效率21。刘斌等以黄芩苷(50%乙醇)为对照，采用盐酸-镁粉反应显色后，于431nm处测定了苦参汤有效部位总黄酮含量22。其他有学者报道将共振散射光谱法23、薄层扫描法24、单扫示波极谱法25、黄酮-KOH显色法26等应用于总黄酮含量测定。3小结与展望总黄酮作为一类生理活性显著且种类繁多的一类化学物质，决定了可供选择的中草药、中药制剂中总黄酮含量测定方法比较丰富。其中，紫外分光光度法作为药物的一种常用分析方法，尤其是在近十几年中，其方法学的研究已经得到普遍的认可，它在单一成分的测定中，具有很好的稳定性、重现性，而且快速、简捷，结果准确。对于成分复杂的药物，由于仪器自动化，数据计算机化处理，应用紫外光光度法进行多组分含量测定更加简便。总之，随着现代科学各个领域的不断发展，新技术新方法不断应用到药物分析中来，因此药物分析今后的发展要向着：系统筛选，自动化分析仪器的应用，集分析操作自动化，数据处理电子计算机化，达到快速、高效、特异性强、重现性好的目的。0参考文献1肖崇厚.中药化学.上海:上海科学