甲基化protocol.doc

MSAP protocol一DNA提取1. 把幼嫩的叶组织放在液氮中研磨，转移粉末到预冷的离心管中；2. 加入500ul预热的DNA抽提液，彻底混合，在65 下水浴1 h，每隔5-10min摇动一次，以使抽提破碎细胞充分与抽提液混合；3. 冷却到室温，加入等体积的氯仿-异戊醇（241），在室温下轻摇并混匀约20 min，3000rpm的转速离心30min，取上清液到另一支管中；4. 加入等体积的苯酚（饱和酚）氯仿（1：1），充分混匀，412,000 g离心10min，取上层（水层）移至另一1.5 ml离心管中；5. 重复上一步骤直至有机相与水相之间的界面上看不到蛋白质；6. 加入等体积的氯仿-异戊醇（241），充分混匀，412,000 g离心10 min，取上层（水层）移至另一1.5ml离心管中；（抽提1-2，主要目的是除去苯酚）;7. 等体积无水乙醇沉淀。20放置1 h以上，412,000 g离心10 min；8. 抛去上清；用70%的乙醇洗涤2-3次;9. 将乙醇吹干（和提DNA一样），加入适量的灭菌水溶解DNA；然后用Nanodrop定量。并电泳检测。10. 二MSAP分析双酶切反应体系11. 双酶切反应体系1：DNA 溶液500ng 2.5ul10x tango buffer 6lHpaII 30U 3ulEcoRI（） 10 U 1ul加灭菌超纯水至40l。37温浴12 h，75温浴10 min灭活。双酶切反应体系2：DNA 溶液500ng 2.5ul10x buffer 8ulMspI 30 U 3ul EcoRI（NEB）10 U 1ul加灭菌超纯水至40l。37温浴12 h，75温浴10 min灭活。双酶切电泳：双酶切结束后，取5ul进行琼脂糖电泳，酶切以后要大部分的条带都在500bp一下连接反应体系，在双酶切反应液中加入如下组分：DNA 20ULEcoRI adapter（5 pmol/l） 1lHpaII/MspIadapter（50 pmol/l） 1lATP（10 mM） 1lT4 DNA ligase（Promega） 1l10L buffer（Promega） 1l灭菌超纯水5 l16温浴 4 h，75 温浴 10 min灭活。预扩增 PCR 反应体系：连接产物(DNA) 5 lEcoRI预扩引物（10 M） 1lMseI预扩引物（50 M） 1lMgCl2（25 mM） 1.5lTaq polymerase（Fermentas，5 U/l）0.3l10PCR buffer（Fermentas） 2.5ldNTP（10mM） 0.5l灭菌超纯水 13.2l PCR 扩增程序为94 3min；然后94 30s，56 40s，72 60s共23个循环；72延伸10 min，终止反应。琼脂糖电泳检测预扩产物。选择性扩增：将预扩产物用 0.1TE溶液稀10倍，预扩产物 (DNA) 3lEcoRI预扩引物（10 M） 1lMseI预扩引物（50 M） 1lMgCl2（25 mM） 1.5lTaq polymerase（Fermentas，5 U/l）0.3l10PCR buffer（Fermentas） 2.5ldNTP（10mM） 0.5l灭菌超纯水 15.2l PCR扩增程序为94 60s，接下来94 30s，65 30s，72 60s，然后每循环1次其退火温度降低0.7，执行12个循环；接着在94 30s，56 30s，72 60s 扩增23个循环；最后72延伸10 min。2.1.6变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳及染色配制PAGE胶及电泳所需要的溶液配方如下：5TBE：Tris碱54g硼酸27.5g0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20ml加水定溶至 1000ml6%变性聚丙烯酰胺凝配方：丙烯酰胺 57gNN-亚甲叉双丙烯酰胺 3g尿素 450g5TBE 200ml加水定容至1000ml，0.45m孔径滤膜过滤，避光存于4。甲酰胺加样缓冲液：甲酰胺 98%0.5mol/L EDTA(pH8.0) 10 mmol/L溴酚兰 0.025% (m/v)二甲苯青FF 0.025% (m/v)PAGE胶的制备及电泳步骤如下：1. 玻璃板的处理。大玻璃板和小玻璃板（带凹槽玻璃板）分别清洗干净后，大玻璃板用反硅化剂匀涂抹玻璃板（3l去反硅化剂+6l冰醋酸+1ml95%乙醇），小玻璃板用硅化剂匀涂抹玻璃板（100l硅化剂+1ml95%乙醇）；2. 将0.4mm厚的间隔片沿两块玻璃板边缘放置妥当，三边用透明胶带封边，防止漏胶；3. 取80 ml 6%PAGE溶液，加入200l 10%过硫酸胺和50l TEMED搅匀后灌注到玻璃板中，将梳子插到玻璃板之间，水平静置，待胶凝固后电泳；4. 将制备好的胶固定到电泳槽上，加入1TBE电泳缓冲液，100W预电泳30 min；5. 在选扩产物中加入等体积的甲酰胺加样缓冲液，于95变性5min;6. 加入8l已变性的样品，65W电泳2.5h。银染步骤如下：1. 将带凹槽玻璃板撬起，胶完整的附在大玻璃板上，大玻璃板放入固定液（10%的冰醋酸）中固定30min；2. 用去离子水漂洗大玻璃板三次，每次2 min；3. 加入银染液（1%硝酸银溶液，用前加0.15%体积的甲醛溶液），染色30-60min；4. 取出大玻璃板，去离子水快速洗5-10s；5. 加入已经预冷好的显影液（3%