第1章植组织培养实验室构建和操作技术

第1章植物组织培养实验室构建及操作技术 植物组织培养学 本章教学目的与要求 1 掌握组织培养实验室的设计 2 掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法 3 掌握调控组织培养的主要环境条件 4 掌握灭菌和消毒的区别 5 掌握灭菌的不同方法和具体操作过程 6 掌握无菌接种的步骤 7 掌握外植体的培养方法和步骤 8 一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法 9 掌握试管苗驯化的基本程序 第1章植物组织培养实验室构建及操作技术 第1章植物组织培养实验室构建及操作技术 植物组织培养学 商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备培养基及其配制外植体的选择与培养试管苗的驯化与移栽 第1章植物组织培养实验室构建及操作技术 本章主要内容 1 培养器皿的清洗 2 培养基的配制 分装和高压灭菌 3 无菌操作 材料的表面灭菌和接种 4 将培养物放到培养室培养 5 试管苗的驯化 移栽和初期管理 第1章植物组织培养实验室构建及操作技术 第一节商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 一般组织培养的操作工序 一 设计 第一节组织培养实验室的设计与主要设备 二 仪器设备和器皿用具 1 超净工作台或接种箱2 空调3 除湿机或加湿器4 恒温培养箱5 高压灭菌锅6 冰箱7 天平8 显微镜9 水浴锅10 摇床与转床11 蒸馏水发生器12 酸度计13 离心机 一 常见仪器设备 第一节组织培养实验室的设计与主要设备 1 培养器皿 试管 三角瓶 培养皿 圆形培养瓶 果酱瓶2 分注器3 离心管4 刻度移液管5 细菌过滤器6 实验器皿 量筒 烧杯 容量瓶 试剂瓶 塑料瓶 酒精灯等 第一节组织培养实验室的设计与主要设备 二 各类玻璃器皿 1 镊子 尖头镊子 枪形镊子2 剪子3 解剖刀4 接种针5 钻孔器 第一节组织培养实验室的设计与主要设备 三 器械用具 第二节培养基及其配制 本节目的要求 1 一般掌握培养基的种类 特点 2 掌握基本培养基的配方 3 一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量 4 掌握培养基母液和常用培养基的配制方法 5 熟练掌握培养基的灭菌方法 6 一般掌握培养基的筛选办法 第1章植物组织培养实验室构建及操作技术 一 培养基的成分 第二节培养基及其配制 1 无机营养元素 inorganicelement 1 大量元素 指浓度大于0 5mmol L的元素 N P K Mg S和Ca等 2 微量元素 指小于0 5mmol L的元素 Fe B Mn Cu Mo Co等 第二节培养基及其配制 2 有机化合物 organiccompound 最常用的碳源是蔗糖 葡萄糖和果糖也是较好的碳源 使用浓度在1 5 常用3 作用 碳源 维持培养基渗透压 1 碳水化合物 第二节培养基及其配制 在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动 种类 VBl 盐酸硫胺素 VB6 盐酸吡哆醇 Vpp 烟酸 Vc 抗坏血酸 VH 生物素 VB11 叶酸 VB12 钴胺素 等 使用浓度 一般用量为0 1 1 0mg L 2 维生素 vitamin 第二节培养基及其配制 又叫环己六醇 在糖类的相互转化中起重要作用 使用浓度 一般为lOOmg L 作用 适当使用肌醇 能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成 对组织和细胞的繁殖 分化有促进作用 对细胞壁的形成也有作用 3 肌醇 第二节培养基及其配制 作用 是很好的有机氮源 可直接被细胞吸收利用 种类 最常用的是甘氨酸 其他的如精氨酸 谷氨酸 谷酰胺 天冬氨酸 天冬酰胺 丙氨酸等 使用浓度 为10 200mg L 4 氨基酸 alminoacide 第二节培养基及其配制 3 有机附加物 天然复合物 10 20 150 200ml L 150 200g L 0 01 0 05 浓度 第二节培养基及其配制 4 植物生长调节物质 hormone 赤霉素 gibberellicacid 细胞分裂素类 cytokinin 生长素类 auxin 第二节培养基及其配制 作用 主要被用于诱导愈伤组织形成 促进细胞脱分化 促进细胞伸长 促进生根 在促进生长方面 根对生长素最敏感 在极低的浓度下 10 5 10 8mg L 就可促进生长 其次是茎和芽 1 生长素类 第二节培养基及其配制 吲哚乙酸 IAA indoaceticacid 萘乙酸 NAA naphthaleneaceticacid 吲哚丁酸 IBA indolebutyriacid 2 4 二氯苯氧乙酸 2 4 D 2 4 dichlorophenoxybutyricacid 生长素种类 第二节培养基及其配制 IAA 吲哚乙酸 NAA 萘乙酸 IBA 吲哚丁酸 2 4 D 2 4 二氯苯氧乙酸 生长素作用强弱顺序 强 弱 第二节培养基及其配制 种类 6 BA 6 苄基腺嘌呤 Kt kinetin激动素 Zt zeatin玉米素 2 细胞分裂素类 细胞分裂素作用 促进细胞分裂与扩大 诱导芽分化 促进侧芽萌发 使茎增粗 抑制茎伸长 抑制根的分化 第二节培养基及其配制 Kt 激动素 6 BA 6 苄基腺嘌呤 Zt 玉米素 细胞分裂素作用强弱顺序 强 弱 第二节培养基及其配制 GA3 赤霉酸 作用 促进幼芽伸长生长 促进不定胚发育成小植株 赤霉素和生长素协同作用 对形成层的分化有影响 当生长素 赤霉素比值高时有利于木质部分化 比值低时有利于韧皮部分化 3 赤霉素 第二节培养基及其配制 5 培养材料的支持物 琼脂 agar 固体培养时最好的固化剂 用量 6 10g L 琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物 本身并不提供任何营养 琼脂能溶解在热水中 成为溶胶 冷却至40 即凝固为固体状凝胶 琼脂的凝固能力除与原料 厂家的加工方式有关外 还与高压灭菌时的温度 时间 pH值等因素有关 长时间的高温会使凝固能力下降 过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解 丧失凝固能力 时间过久 琼脂变褐 也会逐渐丧失凝固能力 第二节培养基及其配制 固体培养基的特点 与液体培养基相比 优点 操作简便 通气问题易解决 便于观察研究 缺点 培养物与培养基的接触 即吸收 面积小 各种养分在琼脂中扩散较慢 影响养分充分利用 同时培养物排出的代谢废物 聚集在吸收表面 对组织产生毒害作用 固体培养 液体培养 第二节培养基及其配制 6 抗生物质 antibiotic 种类 青霉素 链霉素 庆大霉素等 浓度 5 20mg L 作用 可防止菌类污染 第二节培养基及其配制 7 活性炭 activecarbon 目的 是利用其吸附能力 减少一些有毒物质的影响 利于生根 使用浓度 1 5g L 它的颗粒大小决定着吸附能力 粒度越小 吸附能力越大 温度低吸附力强 温度高吸附力减弱 甚至不吸附 第二节培养基及其配制 8 水 water 作用 是植物原生质体的组成成分 也是一切代谢过程的介质和溶媒 注意 用蒸馏水 最好是重蒸馏水 以保持培养基成分的精确性 大规模生产时可用自来水 第二节培养基及其配制 二 培养基的PH值 pHvalue 1 多数植物要求pH5 6 5 82 用0 1 1N的NaOH和0 1 1N的HCI调节 3 注意 经高压灭菌后 培养基pH会下降0 2 0 8 固调整pH值时 应高于0 5 pH的大小会影响琼脂的凝固能力 当pH 6 0时 培养基将会变硬 pH 5 0时 琼脂凝固不好 第二节培养基及其配制 第二节培养基及其配制 不同植物对培养基最适pH值的要求不同 见表 培养基 culturemedium 是植物组织培养的重要基质 在离体培养条件下 不同种植物的组织对营养有不同的要求 甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同 因此 没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官 在建立一项新的培养系统时 首先必须找到一合适的培养基 培养才有可能成功 三 培养基的种类 配方及特点 第二节培养基及其配制 1 根据态相不同 固体培养基 液体培养基 2 根据培养物培养过程 初代培养基 继代培养基 3 根据作用不同 诱导培养基 增殖培养基 生根培养基 4 根据营养水平 基本培养基 完全培养基 改良培养基 一 培养基的种类 第二节培养基及其配制 若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物的培养基 称为基本培养基 在基本培养基的基础上 添加各种各样的生长调节物质和其他有机附加物的培养基叫完全培养基 初代培养基 指用来第一次接种外植体的培养基 继代培养基 指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基 第二节培养基及其配制 二 MS培养基配方 第二节培养基及其配制 1 MS培养基 它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的 是目前应用最广泛的培养基 特点 是无机盐离子浓度较高 有高含量的N K 硝酸盐量大 营养丰富 三 常用的培养基及特点 第二节培养基及其配制 2 White培养基 1943年由White为培养番茄根尖而设计的 特点 无机盐浓度较低 适于生根培养 3 N6培养基 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的 特点 是成分较简单 KNO3和 NH4 2SO4含量高 不含钼 在国内已广泛应用于小麦 水稻及其他植物的花粉和花药培养 第二节培养基及其配制 4 B5培养基 是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的 特点 是含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素 5 KM 8P培养基 它是1974年为原生质体培养而设计的 特点 是有机成分较复杂 它包括了所有的单糖和维生素 第二节培养基及其配制 四 培养基的配制 一 母液 stocksolution 的配制和保存所谓母液是欲配制液的浓缩液 意义 保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取 便于低温保藏 一般母液配成比所需浓度高10 100倍 母液配制时可分别配成大量元素 微量元素 铁盐 有机物和激素类等 第二节培养基及其配制 单配法 将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液 一般用mg ml或mg L表示 混配法 将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量 分别溶解后再混合成母液 配制生长素类 可先用少量0 1N的NaOH或95 酒精助溶 浓度为 1 5mg ml 配制细胞分裂素类 一般先用少量0 5 1N盐酸加热溶解 浓度为 1 5mg ml 第二节培养基及其配制 母液的配制方法 培养基母液的配制 第二节培养基及其配制 二 培养基的配制及其灭菌 1 配制方法 1 将母液按顺序摆放2 取适量的蒸馏水 所需培养基量的2 3 入容器3 按需要量依次取母液及生长调节物质4 加入蔗糖 30g L 溶解5 加琼脂 6 10g L 煮沸 2 3min5 定容6 调PH值 pH 5 8 7 分装培养瓶 封口8 高压灭菌 第二节培养基及其配制 组织培养常见的灭菌方法 消毒 是指杀死 消除或充分抑制部分微生物 使之不再发生危害作用 灭菌 是指用物理或化学的方法 杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体 即把所有生命的物质全部杀死 第二节培养基及其配制 常用的灭菌方法 物理方法 化学方法 干热灭菌 烘烧和灼烧 湿热灭菌 常压或高压蒸煮 射线处理 紫外线 超声波 微波 过滤除菌 大量无菌水冲洗 升汞 氯化汞 甲醛 福尔马林 过氧化氢 高锰酸钾 来苏儿 漂白粉 次氯酸钠 酒精 第二节培养基及其配制 2 培养基的灭菌 湿热灭菌法 培养基在制备后的24h内完成灭菌工序 高压灭菌的原理 在密闭的蒸锅内 其中的蒸气不能外溢 压力不断上升 使水的沸点不断提高 从而锅内温度也随之增加 在108kPa的压力下 锅内温度达121 在此蒸气温度下 可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢 第二节培养基