【毕业学位论文】（Word原稿）骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义

兰州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 1 第一章 前言 宫颈癌 (最常见的女性生殖道恶性肿瘤，是发生在子宫颈阴道部及宫颈管的恶性肿瘤的总称，发病率仅次于乳腺癌，严重威胁女性的身体健康。全球每年约有 20万女性死于宫颈癌变，其中 80%的病例发生在发展中国家。我国宫颈癌患病率和病死率均约占世界三分之一，是威胁我国妇女健康和生命的主要恶性肿瘤。目前，针对宫颈癌的疫苗尚未在人群中普遍应用，世界范围内的宫颈癌的防治工作主要集中在宫颈癌的筛查，在美国等西欧发达国家，大约有一半的妇女至少 5年做一次巴氏涂片，因而其发病率在全球范围内 普遍呈下降趋势。但对大多数发展中国家来说，几乎 90%的妇女因为经济原因或者技术条件从未筛查过或者筛查不充分，有限的医疗资源主要用在了疾病的诊治而不是预防。近年来，欧洲一些国家宫颈癌发病率有上升趋势 1，全国各地也不断报道其发病有上升且呈年轻化的发展趋势。因我国的经济水平不一，筛查工作尚不完善，所以，有效的治疗及预防对我们国家而言尤为重要。 宫颈癌的治疗以手术为主，辅以化疗、放疗、生物治疗等相结合的综合治疗。这些方法在临床应用中得到了极大的认可和推崇，但仍有少数患者治疗效果差及预后不良，尤其是临床分 期较高及复发的患者，这就决定了宫颈癌相关研究的重要性。其中，与宫颈癌发生发展的相关基因蛋白水平有及其重要的临床意义，深入研究这些蛋白，可以阐明宫颈癌发生、发展及预测预后，更重要的是可以指导临床治疗，能为宫颈癌的治疗提供新的研究靶点。 分子生物学研究表明，宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒 (别是高危型（如 染密切相关，大约有 宫颈癌及其前体病变（鳞状上皮内瘤变）中存在 着对 种组织恶性肿瘤的发生如乳腺癌、喉癌、皮肤鳞状细胞癌、胃肠道鳞癌、骨髓癌患者均与其有关 2有研究报道， 对 18、 6、 11型的四价人乳头瘤病毒基因重组疫苗 18二价人乳头瘤病毒基因重组疫苗 宫颈癌预防方面已获得良好的临床效果，但直到目前还没有证据表明一旦宫颈瘤变发生，疫苗可以逆转子宫颈癌的形成，并且也不能确定疫苗是否终身有效，因此，也不应该过分强调疫苗万能 而让人盲目乐观。 的一个亚型。 化磷酸烯醇式丙酮酸（ 变为丙酮酸，在三磷酸核苷的合成过程中起着决定性作用。哺乳类的 型）： 通常均兰州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 2 以酶的活性四聚体形式存在。 要负责糖异生。 被 1， 6- 2磷酸果糖、 磷酸腺苷） 别构激活。可被 一磷酸腺苷）依赖的蛋白激酶磷酸化而失活， 糖饮食使其上调，饥饿使其下调。 动力学性质和调节机制与两个器官都需要高能量。 不受别构、磷酸化调节，也较小受营养的影响。 肪、视网膜以及所有需要大量核苷酸合成的组织中。后者包正常的增殖细胞、 胚胎细胞、干细胞、尤其是肿瘤细胞中，他们都是增殖旺盛的细胞。在组织分化的过程中， 高分化组织癌变的过程中， 7。 肿瘤具有六大显著特征：凋亡抵抗、自我增殖能力、对抗生长信号的不敏感性、无限的复制潜能、持续的血管生成能力及组织侵袭转移能力 8。目前有氧糖酵解在癌细胞中的作用成为研究的热点，被称为癌细胞的第七大特征 9。糖酵解上调导致微环境酸性毒性，所以对抗酸性细胞来说具有生长优势，能助其增殖和浸润。但至今为止，有氧糖酵解发生的分子机制还未完全阐明。 的独特作用也引起了人们的普遍关注。 底物磷酸烯醇式丙酮酸亲和力强，而以二聚体形式存在时则与之相反。 致磷酸烯醇类物质的堆积，这有利于肿瘤细胞不是糖酵解供能而转向核酸合成的方向进行，此相对于糖酵解过程，可称之为谷氨酸酵解过程，以保证肿瘤细胞增殖过程中物质的供给 10。 细胞增殖是一个耗能过程，若细胞无限增殖，细胞会因能量及物质供应不上而死亡。 磷酸腺苷 )或 磷酸鸟苷 )上，同时产生丙酮酸、 磷酸鸟苷 )，糖酵解过程中在 此丙酮酸激酶可调控苷酸激酶、磷酸果糖激酶的水平。、三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷合成，从而抑制 11。另外有研究表明，磷脂 合成的多个环节是肿瘤形成所必需的，甚至能有效促进肿瘤的形成，其一个有力证据即是脂肪酸合成酶在正常组织中呈低水平表达，但在肿瘤组织中表达上调，而且有促进肿瘤形成的作用 12。研究发现， 促进葡萄糖转化为磷脂，从而为肿瘤细胞的增殖提供兰州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 3 物质基础，又进一步拓展了生长因子信号通路与肿瘤代谢的联系 13。 在肿瘤细胞中， 适应肿瘤代谢的需要 7。研究表明，四聚体型与二聚体型1， 6果糖、丝氨酸以及不同的癌蛋白 (7)之间的相互作用来调控 14。 能的机制为 得 15。在有足够氧气供应的实体瘤中，谷氨酸酵解提供大量的丙酮酸。这些谷氨酸酵解和糖酵解中产生的丙酮酸用来合成乳酸、谷氨酸和脂肪酸，从而释放出糖酵解过程中甘油醛 3 保证肿瘤细胞中能量的供给。可见， 16,17。 在恶性肿瘤组织中，有较高浓度的 有部分进入血液循环，故在外周血及体液中可能检测到 国 发出一种用于检测 前该试剂盒已广泛用于基础实验研究中。早在 1993年， 关研究证实 ， 多种肿瘤病人外周血清中均存在 肺癌 18、胃癌 19、肾癌 20、结肠癌 21等等 ，有研究者建议把 22、睾丸癌 23及宫颈癌 2 4肿瘤标记物。目前，研究者发现 瘤细胞的侵袭转移、诱导肿瘤血管生成、增强肿瘤细胞耐药等 25 早在 1978年，已有研究证实在宫颈癌中存在糖酵解关键酶之一 在宫颈正常组织中表达较低 28。 期宫颈癌和宫颈上皮内瘤变 、 ）、 中期宫颈癌和宫颈上皮内瘤变 ）、 期宫颈癌包括浸润型鳞癌）中表达水平依次明显升高 29。有研究检测 50例宫颈癌组织、 10例宫颈良性肿瘤患者及 10例健康对照患者活组织和外周血清中 果显示 感性为 82%、特异性为 60%。故研究者推测 24。 随着 人们越来越多的开始关注其在肿瘤治疗作用。维生素 5可以通过抑制 30。在裸鼠 铂对癌细胞的抑制率 基因敲出 二者联合可以明显提高癌细胞的抑制率，而免疫组化显示联合用药对裸鼠的心脏、肺、脾、及肾脏未见明 显损害。该研究还显示，基因敲出 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 4 质粒可以通过诱导细胞凋亡及抑制细胞增殖增强顺铂的抗肿瘤作用 31。在小鼠移植瘤模型中，基因敲出 作用机制同前 32。 向 549荷瘤裸鼠的抗肿瘤效果要明显优于单独用药，增强肿瘤细胞的凋亡是主要的作用机制 33，组织中5诱发细胞凋亡，当 5%以上，细胞将全部走向死亡34,35,肿瘤细胞中 50%的 断肿瘤新生血管生成，等于切断了肿瘤细胞有氧呼吸途径，抑制 此推测，抑制肿瘤细胞糖酵解和抗肿瘤血管生成药物联合治疗在临床应用的可能性。因肿瘤的侵袭转移、血管生成、耐药及预后有关，通过 要大量的基础及临床实验研究。 其在宫颈癌发生发展作用机制的研究极少。抑制 未知晓。另有研究表明， 二者在宫颈癌发生发展中的关系仍未知。 本课题主要利用原核表达载体将 得高纯度的重组 而为进一步探讨 兰州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 5 第二章 实验材料 要生化试剂 制性内切酶 均购自 回收试剂盒 上海 ） 公司 ， E. E. 质粒 )及 他试剂均为国产分析纯试剂。 要仪器设备 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）； 海山富科学仪器有限公司）； 及型 电热恒温鼓风干燥箱 (上海齐欣科学仪器有限公司 )； 超低温冰箱（ 电泳仪（北京市六一仪器厂）； 子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）； 双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）； 海嘉鹏科技有限公司）； 管架自动平衡离心机（长沙湘仪仪器有限公司）； 子工业部第四十八研究所）。 用实验试剂和培养基 （ 1） 养基和抗生素 体培养基：蛋白胨 l0 g，酵母提取物 5 g， g，用蒸馏水定容至 1000 节 压灭 菌。 脂培养基：按照上述配方配制液体培养基，高压灭菌前加入琼脂15 g(铺制平板用 )。 卡那霉素：用蒸馏水 配制 为 50 mg/浓度，共 50 用 器过滤 除菌 ， 分装为 1 ， 保存。 （ 2）蛋白 泳相关试剂 30%聚丙烯酰胺贮液：称取 150 g 丙烯酰胺， 4 g N,N州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 6 加超纯水溶解至 500 其完全溶解后用滤纸过滤，避光 4C 保存。 三羟甲基氨基甲烷 称取 g 三羟甲基氨基甲烷加适量超纯水溶解，用浓盐酸调 至 超纯水定容至 100 1 M 三羟甲基氨基甲烷 ：称取 g 三羟甲基氨基甲烷加适量超纯水溶解，用浓盐酸调 至 超纯水定容至100 10%十二烷基磺酸钠 (称取 1 g 十二烷基磺酸钠（ 加超纯水溶解至 100 温保存。 1甘氨酸电泳缓冲液：称取 3 g 三羟甲基氨基甲烷， 14.4 g 甘氨酸， 1 适量超纯水溶解，用浓盐酸调 超纯水定容至 1 L。 2样缓冲液，见表 2 表 22样缓冲液配制方法 试剂 含量 2.0 0% .0 油 2.0 % 溴酚蓝 纯水 定容至 10 g(用时现加 ) 考马斯亮蓝 色液，见表 2避光室温保存 。 表 2考马斯亮蓝 色液配制方法 试剂 浓度 含量 (w/v) 1.0 g 甲醇 40% (v/v) 400 醋酸 10% (v/v) 100 纯水 定容至 1000 12%分离胶、 5%积层胶的制备 ,见表 24C 保存。 表 2 12%分离胶、 5%积层胶的制备方法 试剂 12%分离胶 (105%积层胶（ 4 兰州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 7 超纯水 3.3 .7 0%聚丙烯酰胺贮液 4 70 l 1.5 _ 500 l 10%00 l 40 l 10%00 l 40 l l 5 l 脱色液：冰乙酸、甲醇和超纯水按 1:3:6 的比例配置。 （ 3）镍柱纯化用试剂 8 M 尿素洗脱缓冲液：称取尿素（ 240 g，分别加入 5 5 油，定容至 500 温储存。 性结合缓冲液：称取 g, g，加入 10 ,加入尿素 （ 480 g，用超纯水定容至 1000 调 室温储存。 变性洗涤缓冲液：分别称取 g、 g 加入 10 ，加入 5.0 g 脱氧胆酸钠，加入尿素（ 480 g，用超纯水定容至 1000 调 室温储存。 （ 4） 其他相关试剂 诱导剂 蒸馏水 配制 为 1 浓度，共 50 器过滤除菌，分装为 1 ， 保存。 磷酸盐缓冲液 （ ：分别称取 g、 g、 2 g,用蒸馏水定容至 1 L，条件 4C 保存备用。 蛋白透析纯化试剂：称取 1201.2 g 尿素及 g， 用超纯水定容至5000 调 4C 保存。 考马斯亮蓝染色液： 称 取 100 马斯亮兰 于 50 5%的乙醇后，再加入 100 5%的磷酸，用 超纯水定容至 1000 兰州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 8 第三章 实验方法 基因组 取 （ 1）用物准备 配 1 000 纯水，搅拌 40 37 配 100 00 拌 40 37 用配好的 在饭盒中浸泡 1.5 、 、 10 心管、大中小 枪头 ，务必使每个管中都充满液体，上下层铺纱布，完全浸润，浸泡12 h。 用镊子取物品出并将管中液体甩掉，浸泡过的物品放入饭盒高温高压灭菌。 配制 00 8 g 00 纯水，溶解后用于浸泡电泳槽及胶床梳子，待用。同时细胞刮浸泡在 中至少 1 h。 氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、 无水酒精放入 4C 冰箱预冷。 配制 脂糖凝胶 :配置 400 8 092 压过的 15 0.3 g 琼脂糖 ,微波炉加热沸腾后，冷却后，加 匀，制胶备用。 超净台用 75%酒精棉擦拭干净，紫外线照射 30 风 15 （ 2） 提取方法 细胞 处理： 将铺满 整瓶细胞约 1106 个，弃掉旧培养基，加 8 理的冲液冲洗旧培养基， 2 次，然后加 5 细胞刮刮下，移入10 中，再加入 5 续刮移入 10 ，混匀后 2500 心1 ，弃上清，用 1 解沉淀移入 2 个去 中。 加 110607 个细胞加 1 轻吹打混匀，置于冰盒上静置 5 加入 0.2 仿 （为 1/5） ， 上下轻轻颠倒 5 ， 冰盒上 静置5见分 层现象 。 4C、 10500 心 15 见分层 ，上层清亮，中层为白色，下层为红色 。 小心吸取上清，估计约 0.5 加入 与上清等体积的 异丙醇 0.5 上下颠倒混匀 6，冰盒上 静置 10 4C、 10500 心 10 上清 ，可见核酸沉淀 。 加入 1 与 量一致） 75% 乙醇 （ 750 水乙醇 +150 压过的 ） ， 现配先用。轻轻吹打使沉淀溶解， 4C、 8500 心兰州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 9 5弃上清。 超净 台下干燥 5入适量 溶解 沉淀。保存于 冰箱备用。 备（ （ 1）在冰盒上分别加入以下试剂： 模板 5 l 1 l （ 100 l 共 l （ 2）轻柔混匀， 465 次 4 （ 3）依次加入下列试剂后，轻微混匀， 4 5 4 l l 0mM 2 l 1 l 共 l （ 4） 420 （ 5） 700 保存。 融合蛋白 +） - 构建 物设计 根据 基序列为 2516 序列 ,用 条引物，引物有上海生物工程有限公司合成，序列见表 3 表 3 引物序列 上游引物 5 ） 上游引物 5 ) 下游引物 5（ 兰州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 10 增 因 考虑到融合蛋白的纯化，所以在引物设计时分别把上游引物设计在组氨酸标签的两端，这样可以获得含组 氨酸标签及不含组氨酸标签的融合蛋白。以 5端引物 端引物 端引物 端引物 在下文中含有组氨酸标签的目的基因片段用含有组氨酸标签的目的基因片段用 无表明则两者均可） （ 1） 系（单位 l）： 5 10 l 4 l 上游引物 1 l 下游引物 1 l NA l l 共 50 l （ 2） 96 980 s， 625 s， 720 s， 40个循环后 ， 720 40个循环。取 5 用 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。因在小于 100 用 （ 3）取验证后的 化 : 在 倍体积的 3 ，充分混匀。 8000 心 30 s。倒掉收集管中 液体。 加入 500 l 9000 0 s，倒掉收集管中液体，重复此步一次。 空柱于 9000 空吸附柱开盖于超净台下吹风 5 残留乙醇挥发 将吸附柱放入一个干净的 1.5 心管中，在吸附膜中央加入20温静置 1 12000 取 5 取 5 照观察纯化 率 ,2 量质粒的浓度及纯度 ） 。 1%琼脂糖凝胶电泳检测 收产物放 保存 。 建表达质粒 +） - 1）大肠杆菌 取 冻存的大肠杆菌 37 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 11 箱中培养过夜。 从平板上挑取单个菌落接种至 5 37C,180 2 h。 取过夜培养的菌液 100 l 接种于 100 37C 180 将菌液冰上静置 10 后 4C， 5000 0 弃上清，加入 10 加样器将菌体轻轻吹散，放置冰上 30 4C， 5000 0 上清，加入 2 1 加样器轻轻混匀，每管 200 存于 4 （ 2）目的基因 +） 的分步双酶切 按下列反应体系依次加入试剂 (冰盒上操作 )： 10 0T 20 30 2o 130 共 190 00 650 酶灭活后 ， 加入 10 370 20用 法同前。 （ 3）用胶回收试剂盒纯化双酶切后的 质粒 +） ： 取 2 录，铺放保鲜膜于桌面，准备干净滤纸， 从琼脂糖凝胶中割下含目标片段的胶块，称重，记录 加入胶块重量倍的 2 ， 50 加入 1/32体积的异丙醇。 将溶胶液移入吸附柱中， 8000 心 30 s。倒掉收集管中液体。 加入 500 l 9000 心 30 s，倒掉收集管中液体 ,重复此步一次。 空吸附柱于 1200 空吸附柱开盖于超净台下吹风 5 残留乙醇挥发 将吸附柱放入一个干净的 1.5 心管中，在吸附膜中央加入 30温静置 1 心 1 保存管中 （ 4）目的片段与表达载体的连接 根据 摩尔比为 3比 1进行连接（反应体系如下）。 +） 5 的基因片段 3 州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 12 10 2 4 1 2o 9 共 20 l 162 h。 （ 5）转化 冰上溶解 上预冷连接产物。 每 200 l 感受态细胞中加入 10 l 连接产物，冰上静置 30 420s，立即冰上放置 2-3 每管加入预温至 3700 l ， 37C， 45 30荡培养。 取适量培养的菌液均匀涂布于含 50 l /菌液吸收后，倒置于 37 （ 6）阳性克隆质粒的筛选与鉴定 从过夜培养的含卡那霉素的 滑、边缘整齐的菌落，接到 5 37C 12 h， 180 用上海生工质粒提取试剂盒提取质粒。对质粒 （ 7）克隆产物的序列分析 将初步鉴定为阳性克隆的菌株送 北京六合华大基因科技服务有限公司测序 。将测序结果与 组质粒转化表达宿主大肠杆菌 测序准确的重组质粒转化大肠杆菌 感受态细胞 制备、及转化方法同 置 贮存备 用。 组融合蛋白在大肠杆菌 诱导表达 (1) 取冻存于 的菌种接种于含有相应抗生素的 37C 12h， 180 苏菌种。 (2) 按 1： 100接种于含有相应抗生素的 37C 12 h， 180 (3) 加入 1.0 ， 37 h。 (4) 取 l 4C， 12000 l 别收集菌体和上清（上清备兰州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 13 用 ）。 (5) 用 100 l 入等体积 2行 丙烯酰胺凝胶电泳（ （ 1）配置 12%分离胶和 5%浓缩胶，灌制凝胶， 将配制分离胶混匀灌入电泳槽中，加水覆盖，室温下静止 20分离胶聚合后，倒出上面的水，再灌入配置好的浓缩胶，迅速插入样品梳，室温下静止 20作过程中注意避免出现气泡。 （ 2） 蛋白样品处理：将蛋白样品及分装后的 2样缓冲液按 1:1 的比例混合，沸水 水浴 10 蛋白变性。 （ 3）上样：待积层胶聚合后，竖直拔出样品梳，用 1极缓冲液灌满电泳槽前后槽，用 10 l 加样枪在加样孔中加入处理好的蛋白样品及蛋白0 l/孔。 （ 4）电泳：将电泳槽带电极的盖子改好后，接通电源，恒电压 80 V 电泳20分离胶后，可将电压调至 100 继续电泳（电压调高后可明显缩短电泳时间，不影响电泳效果），约 2 小时，直至电泳样品目测到达分离胶的底部，关闭电泳仪，电泳结束。 （ 5）染色与脱色：将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热 1 ，摇床振荡 30 色，倒掉染色液。用超纯水除去残留的染液，再加入脱色液。可用微波炉加热，振荡摇床约 1 h，如果多次替换脱色液并延长加热时间可明显缩短脱色时间，直至条带清晰可见。 组融合蛋白表达形式的鉴定 将步骤 行 组融合蛋白表达条件的优化 （ 1） 蛋白表达量与 关系 将菌液按 1： 100接种于含卡那霉素的 37-3 入 1.0 ， 37 行 （ 2）蛋白表达量与诱导时间的关系 将菌液按 1： 100接种于含卡那霉素的 37入 .4 ， 37 h 3 h 6 h 12 行 兰州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 14 重组融合蛋白的表达形式均是包涵体蛋白。我们对含有组氨酸标签的重组融合蛋白进行了纯化。 菌培养 (1) 取冻存于 的菌种接种于含有 卡那霉素 的 37C 12 h，180 苏菌种。 (2) 按 1： 100转接于含有 卡那霉素 的 37C 12 h， 180 8，加入 .4 ， 37C 12 h， 180 (3) 将样品 40 去培养液，收集菌体。 (4) 用 20 涤细菌。 理收集菌体 (1) 冰浴超声破碎： 超声 3 s 共约 300次，功率为 180 (2) 4C， 12000 0 取上清。 (3) 将上清样品用 可作为上样样品 。 析纯化 使用镍柱进行亲和层析。 （ 1） 2 3000 上清。 （ 2）加入超纯水 2 悬混匀， 3000 3 上清。此步重复两次。 （ 3）加入 悬混匀， 3000 3 上清。此步重复 4次。 （ 4）加入 悬混匀，室温静置 1 h。上柱 后静置 10 柱收集样品。 （ 5） 3 柱，重悬，混匀。静置 10 柱收集样品。 （ 6） 500 0 100 350 500 1 悬混匀，上柱后静置 10 分别收集样品。 透膜蛋白透析 （ 1）透析袋处理： 将透析袋剪成适当长度（ 10段。 在大体积含 2%（ m/v） 碳酸氢钠和 1 将透析袋煮沸 10 将透析袋用超纯水彻底清洗。 兰州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 15 将透析 袋置 1 煮沸 10 将透析袋冷却，存放于 4 （ 2） 半透膜蛋白透析方法 用超纯水将透析袋再次清洗干净。 检查透析袋是否漏水。 将透析袋中的超纯水排净后，将蛋白液倒入袋中，量约为透析袋长度的 1/3，夹住透析袋的另一段。 放入预先配好的 5000 42 h。 倒出 2500 入超纯水 2500 入 g。调 C， 12 h。 重复上一步， 共 3次使尿素终浓度为 ， 收集透析后蛋白。 兰州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 16 第四章 实验结果 的基因的克隆和序列分析 图 4组质粒 +） - 胞全基因组 脂糖凝胶电泳结果 琼脂糖凝胶电泳结果显示人宫颈癌细胞系 别表示 明仅有少量降解，见图 4 兰州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 17 图 4颈癌细胞系 目的基因 增结果 琼脂糖凝胶电泳显示 820 与该基因的 码序列 )区大小相符 ， 见图 4 图 41、 4500、 3000、 2000、 1200、 800、 500、 200 2、 3、 4、 5、 兰州大学硕士毕业论文 骨代谢标记物在实体瘤骨转移诊治中的意义 18 组质粒双酶切验证 重组质粒双酶切后经琼脂 糖凝胶电泳检测到大小约为 1800 5400 明 )图 4 图 4组质粒双酶切验证 1、 4500、 3000、 2000、 1200、 800、 500、 200 2、 ) 3、 ) ) 组质粒的测序鉴定 将质粒 )将 测序结果与 结果显示二者序列完全相同 ， 并无突变。部分测序结果见附录。 中的表达形式及表达条件 的优化 合蛋白的表达形式 重组菌诱导后表达产物的 导的重组菌在约 58 预计的大