【毕业学位论文】（Word原稿）利用实时荧光定量PCR法检测口腔白假丝酵母菌-口腔医学

第一章 前言 究背景 口腔是一个湿度和温度以及营养状况非常适宜微生物群落生长的环境，健康人的口腔可包含有超过 700种不同的细菌、病毒和真菌等微生物种群 1, 各种微生物群落间通过复杂的相互作用达到一种动态平衡。近年来随着临床广谱抗生素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂等的广泛使用，假丝酵母菌感染在局部及全身的发病率呈逐渐上升的趋势。 有报道称健康人口腔中假丝酵母菌的检出率为 35等。 从口腔中分离出的主要真菌属假丝酵母菌属，有超过 350种假丝酵母菌，其中有 10余种与人类疾病相关，并可定植于人口腔当中 2。各种形式的口腔疾病中均可分离出假丝酵母菌，但其与疾病的关系尚无定论。从口腔中分离出的可致病的假丝酵母菌中，白假丝酵母菌最常见。 A 等的假丝酵母菌学研究表明，从各种形式的人类假丝酵母菌病中 80%可分离出白假丝酵母菌 3。白假丝酵母菌感染机体后可侵犯全身多个组织器官，引起全身系统性假丝酵母菌病。如能做到早诊断早治疗即可降低其发病率和死亡率。 口腔假丝酵母菌病一般可分为：伪膜型假丝酵母菌病、急性红斑型假丝酵母菌病、慢性红斑型假丝酵母菌病、慢性增殖型假丝酵母菌病。口腔内假丝酵母菌感染一般不出现 明显临床症状，仅表现为口腔局部疼痛，口干或烧灼感。多累及年龄较大的老年人，婴幼儿及免疫功能较低及佩戴义齿者。白假丝酵母菌是主要致病菌，具有临床分离率高，致病性强的特点。因此，寻找一种临床可行的，简便快捷的假丝酵母菌鉴定方法，对于假丝酵母菌病的诊断治疗及流行病学分析都十分重要。目前，对于自然人群口腔假丝酵母菌的携带特征、种群分布及其耐药情况等，相关研究资料匮乏。口腔假丝酵母菌感染的诊断必须依靠形态学鉴定方法来证实。但这些方法耗时长、敏感度低、阴性结果不能完全排除、可能有创伤性、对实验操作人员要求较高等，使得当 前实验室检测技术不能满足目前的临床诊断需要 4。而且口腔假丝酵母菌感染目前没有一个准确的检测和诊断标准。传统的 易出现假阳性，实验可复性低，过程易污染。实时荧光定量 感、快速、污染率低等特点。目前广泛应用于农业科研、医学病理、食品检测和病原微生物检测领域。利用实时荧光定量 内外文献鲜见报道。 究目的与内容 究目的 本研究拟通过对兰州市自然人群口腔浓缩漱口液样本的检测，了解兰州市城乡居民口腔假丝酵 母菌的分布， 携带特征 及其药物敏感性，同时探讨口腔假丝酵母菌的分布与性别、年龄、义齿、口腔卫生状况之间的关系，为临床口腔假丝酵母菌病的预防以及早期诊断和治疗提供一定的理论依据。 本研究将还将利用实时荧光定量 立有针对性的口腔白假丝酵母菌实时荧光定量 口腔白假丝酵母菌病的早期诊断提供依据。并为下一步研发口腔非白假丝酵母菌及其他口腔微生物实时荧光定量 究内容 本研究第一部分对兰州市城乡居民采用含漱法取唾液样本，利用培养法和科玛嘉显色法分离 、鉴定口腔假丝酵母菌。按不同年龄、性别、口腔卫生状况、戴用义齿等分组，分析各组口腔假丝酵母菌的检出及分布情况 , 并采用药敏纸片法进行氟康唑、两性霉素 B、制霉菌素、 5 本研究第二部分建立实时荧光定量 将其应用于 临床检测口腔白假丝酵母菌，为口腔假丝酵母菌早期感染的临床诊断及合理使用抗真菌感染的药物打下一定的基础。 并为下一步研发口腔非白假丝酵母菌及其他口腔微生物实时荧光定量 第二章 兰州市城乡居民口腔假丝酵母菌分布 及 其耐药性 料与方法 究对象 从 2009年 7月 0月 ,在兰州大学口腔医院、兰州市中医院、兰州市榆中五中、兰州市定远镇卫生院随机选取研究对象 942例，其中男 516例，女 426例。平均年龄 11。城镇、农村分别为 456、 486例。按照不同年龄、性别、牙结石程度、是否戴义齿、城乡等情况分组。 实验对象纳入标准：无全身系统性疾病；无口腔粘膜病；近 3个月无抗生素服用史；在兰州市有一年以上居住史。所有取样对象均做到知情同意。 验用品 色鉴定培养基鉴定培养基 (法国科玛嘉公司 ) 净工作台 (杭州汇尔仪器设备有限公司 ) 量移液枪 上海方瑞仪器厂专业生产 ) 氧化碳恒温培养箱 (上海立德泰勀科学仪器有限公司 ) 速冷冻离心机 (凯特试验仪器公司 ) 动双重纯水蒸馏器 (江苏省金坛市友联仪器研究所 ) 力加热搅拌器 (郑州英峪领科仪器设备有限公司 ) 低温冰箱 (日本三洋公司 ) 热恒温水浴锅（ 上海比朗仪器有限公司 ） 床检查 由两名经过微生物培养系统性培训的口腔临床专业医师询问并记录所有受检者年龄、性别、职业，有无系统性疾病，检查并记录口腔是否有 粘膜病、戴义齿及牙结石情况，采集并处理口腔浓缩漱口液样本。 腔浓缩含漱液样本的采集与处理 采用口腔浓缩含漱液法采集样本，受检者空腹，采集时间为上午9:000，无菌 10 吐于无菌试管内 ,并于 2h 内将样本送往实验室处理。将样本离心53000r/稀释，振荡，混匀。弃上清液 ,加入甘油进行封装， 存，备用。 腔假丝酵母菌的培养、鉴定 将样本接种于 定培养基，根据鉴定培养基上生长的菌落形态和菌落颜色鉴定假丝酵母菌。根据白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌和克柔假丝酵母菌所含的物质与培养基底物发生作用后分别呈现绿色、紫色、深蓝色和粉红色的特性，达到鉴定假丝酵母菌的目的 6。 37孵育 48h，生长 1个或 1个以上假丝酵母菌菌落的样本为假丝酵母菌检出阳性。 物敏感性实验 真菌纸片扩散法药敏实验的 抑菌圈直径 判定对药物的敏感性 7 (表 1) 表 1 真菌纸片扩散法判定标准表 （ 药物 敏感 抑菌圈直径 耐药 抑菌圈直径 氟康唑 19 14 两性霉素 B 制霉菌素 15 15 10 10 5 19 14 准菌株 白假丝酵母菌 (0028)、热带假丝酵母菌（ 50 )、克柔假丝酵母菌 (258)、光滑假丝酵母菌 (2725)由赫尔辛基大学口腔医学研究院惠赠。 计学分析 采用 计软件进行单因素方差分析， P 80 19。口腔假丝酵母菌病一般为浅部黏膜 假丝酵母菌 感染， (1,3) 体液中的量不高 20，因此一般不用做口腔假丝 酵母菌感染的检测和鉴定。 子生物学方法 目前应用广泛，可用于培养后 假丝酵母菌 菌种的鉴定和标本快速诊断。应用分子生物学方法检测临床标本中假丝酵母菌的 者 提高诊断灵敏度。自 1985年 技术已成为分子生物学研究中使用最多、应用最广泛的手段之一。 板、酶、 子等。引物选择必须满足特异性和敏感性，和临床应用的简便性。假丝酵母菌 常用通用引物包括 18转录间隔区 ( 28有检测时间短、灵敏度高的特点，还可用于检测检测一些依靠培养法不能检测的微生物种类 21。 等在 通过对 54项研究中的 4694名患者中使用 22。 近年来 ,以 但其针对临床标本敏感 性却不高 ,且不同实验室的数据之间缺乏可比性 ,限制了其在临床 假丝酵母菌 感染检验中的推广应用 6。同时 已知 假丝酵母菌 菌的孢子可呈气溶胶方式存在于自然环境中 ,他们对试剂和标本的污染会导致其检测结果产生假阳性 23。 制性片段长度多态性串联式 )法 用来鉴定血培养阳性的假丝酵母菌，可有高度特异度和灵敏度 ,检测限 为每毫升血 10方法具有简便、特异、价廉以及自动化等优点，非常适合无分子生物学实验经验者操作。从 整个过程 4,结果稳定可靠 24。 但是 法繁琐难度大，检测成本较高。 时 术（ 是一种可对病原微生物核酸进行量化检测的分析技术，可实时检测 荧光信号，通过分析软件对起始模板进行定量及定性分析，与常规 具有特异性强、自动化程度高等优点 。 P. 93例（患者样本 145例，健康志愿者样本 48例）浓缩漱液培养的假丝酵母菌，结果显示 也蒙假丝酵母菌 ( 着明假丝酵母菌 （ 的十种常见致病口腔假丝酵母菌。培养法检测出患者样本中有 85例假丝酵母菌阳性样本（ 59%），健康志愿者样本中有 17例假丝酵母菌阳性样本（ 38%）。 测出患者样本中有 97例假丝酵母菌阳性样本（ 67%），健康志愿者样本中有 18例假丝酵母菌阳性样本（ 40%）。同时证明培养法可以出现假阳性的结果。与以往血样本相比，使用 浓缩漱液培养样本检测假丝酵母菌仍然是一个初步的，有待于进一步评估的方法 7。但由于推广应用仍有一定的限制 25。 时荧光定量 目前已应用到农业科研，食品卫生监测，细菌、病毒等微生物检测和研究。是一个循环扩增产物量的变化通过 26。该技术污染率低、 耗时短、精度高、 能实现多重反应、定量结果准等特点。目前该技术已经应用于食品检测、肿瘤耐药基因表达的研究、病毒感染的定量监测，此外对各种病原体均可进行准确的定量检测 27 假丝酵母菌胞外 究 侵袭性假丝酵母菌 病，证实该方法具 有高度特异性 和敏感性（ 10飞克 ） 29。国内文献鲜见使用实时荧光定量 丝酵母 菌进行检测的报道。 总之，采用传统的口腔假丝酵母菌菌种鉴定费时、繁琐、易出现假阳性。我们应该立足并不断改良现有的口腔假丝酵母菌常规检查法及分子生物学方法，快速、准确地鉴定口腔假丝酵母菌，为制定合理的临床治疗方案打下一定的基础。使用新兴的分子生物学技术，如实时荧光定量 时结合浓缩漱口液取样法检测口腔假丝酵母菌，患者可接受性强，操作简便、敏感性高、特异性强，将助于临床医生对口腔假丝酵母菌病的早期诊断和治疗。 参考 文献 1. 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