【毕业学位论文】（Word原稿）水通道蛋白5过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究

兰州大学硕士研究生学位论文 水通道蛋白 5 过表达与 宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 1 第一章 前言 女性生殖系统 恶性 肿瘤严重威胁着 全世界广大妇女 的健康 与 生命。宫颈癌 位居 全球女性恶性肿瘤 的第二位 ， 已成为癌症患者死亡的主要原因之一，全世界每年约有 30 万 人死于宫颈癌 1。宫颈鳞状细胞癌（ 占所有宫颈癌的 80 ，然而腺癌不常见，仅占 20 。 宫颈癌的发生是包括人乳头瘤状病毒（ 感染在内的多种因素联合作用演变的结果 ， 正常宫颈鳞状上皮组织经历慢性炎症等刺激转化为宫颈癌前病变，即 宫颈上皮内瘤样变（ ，病变进一步加重，宫颈原位癌突破上皮下基底膜发展 为浸润性宫颈癌 ，发生局部浸润和远处转移 2。宫颈原位癌高发年龄在 30 35 岁之间，浸润性宫颈癌在 50 55 岁之间。 宫颈癌的发病因素至今尚未明确，可能是吸烟、性生活活跃、经阴道分娩次数多、对宫颈致癌物质敏感、高危型人乳头瘤状病毒、单纯疱疹病毒以及人巨细胞病毒感染等多种因素联合作用的结果。当癌细胞的恶性程度加深，他们常侵犯淋巴系统，并转移到机体远处的盆壁周围淋巴结。在宫颈癌发生发展的多个步 骤之中，癌细胞转移播散到远处淋巴结例如盆腔，是导致宫颈癌患者治疗失败和死亡的主要原因。 白产物，与视网膜母细胞瘤和 白的抗癌功能相互作用，使正常角化细胞中这些肿瘤抑制因子失活。尽管如此，并非所有的受 染的宫颈组织均发展成宫颈癌，除 染之外，可能有其他因素参与宫颈癌的发生。由于宫颈癌的发生是一个多步骤的过程，这为研究恶性肿瘤的转移过程提供了一个良好的模版。宫颈转化区上皮细胞化生过度活跃，暴露在致癌因素条件下更容易发展成 浸润性宫颈癌 。迄今为止， 宫颈癌是目前唯一由 国际妇产科联盟（ 定义的 主要妇科恶性肿瘤。 尽管近 40 年 来 宫颈 刮片 细胞学筛查 、阴道镜、宫颈活组织检查以及高危型人乳头瘤状病毒 测的普及 ，使 宫颈 癌前病变 和浸润性 宫颈癌 得以尽早 发现和 诊断 ， 并采取相应的治疗措施， 其发 生 率和 病死 率 较之前 已有明显 改善。以手术 为主、 放 疗联合 化疗 为辅的治疗策略 已成为 人类许多 恶性肿瘤的 首要 治疗 措施 ， 但仍有约 三分之一的 宫颈癌 患者 因肿瘤全身转移、播散或 复发 而死亡 ， 特定的 患者治疗后病情 的 缓解 相差甚远，且疾病的 愈后难以 预测， 然而，疾病的早期检测往往能提高 治疗效果。 在恶性肿瘤发病机制的研究过程中，某 些异常的分子生物学 改变有 可能对 恶性肿瘤 的 诱导、形成和进展 起 关键 作用。因此， 寻找 与 宫颈组织恶性转化以及宫兰州大学 硕 士研究生学位论 文 水通道蛋白 5 过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 2 颈癌形成、浸润和转移相关的特定的分子生物学标记，研究与宫颈上皮细胞可塑性相关的上皮标志物 对宫颈 恶性肿瘤 发病机制的 了解尤其 重要。 水通道蛋白的发现 近几十年来， 以研究 上皮细胞胞膜 的 渗透性 为基础 ， 提出了 一种存在于细胞质膜上的分子通道，并假设该通道能特异性介导水分子跨细胞膜和跨上皮转运 。 1992 年， 学者们在哺乳类动物成功克隆出 第一个水 分子 特异性通道蛋白 ， 即 水通道蛋白 1（ ， 3。此后，水通道蛋白 家族 （ 的其他成员 相继在哺乳类动物 体内克隆成功 ， 族 逐渐 扩增 至 13个成员 ，即 水通道蛋白的分子结构 细胞膜上聚集成同型四聚体，其中每个结构单元由 6 个跨膜 们是以细胞质为向导的氨基和羧基末端，包含一个独特的水孔道。电子低温晶体学媒体分辨率结构分析结果显示，来自于同一个孔的 6 个倾斜的螺旋片段围绕并形成一个中央孔，该孔道可能包含额外的蛋白密度区域。 小型、疏水、细胞膜固有蛋白，其各蛋白质氨基酸序列的水性图是相似的，显示至少有 6 个足够长的非极性区域跨越细胞膜。相关研究推测哺乳类动物的水通道蛋白单体大小的范围在 26间。水通道蛋白的序列对比显示出一系列高度保守的序列，包括两个 “列、单个 “列和 “F/Y列。哺乳类动物所有的 子中氨基酸含量占 19从所有哺乳类动物体内鉴定出 2 个亚组，分别为“ 水通道蛋白 ” 和 “ 水 。所有转运甘油或大分子 物质的 “ 水 也转运水分子。与各水通道蛋白氨基酸序列（ 比，各水 含两个额外的肽链跨越。 深入的分析显示，其分子的第一个和第二个部分之间具有同源性 4，显示 一个基因内的复制事件演变成水通道蛋白基因家族。这种串联重复模型对于水通道蛋白的结构蕴含深刻的意义。 依据相关的研究，学者们提出了水通道蛋白的 一级结构、二级结构和三级结构的假设。水通道蛋白的一级结构，显示了保守氨基酸序列的位置、串联重复模型和水 级结构显示了水通道蛋白的 6 个跨膜螺旋区域的拓扑模型，朝向细胞质的氨基末端和羧基末端，保守 列的兰州大学 硕 士研究生学位论 文 水通道蛋白 5 过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 3 定位，以及水 通道蛋白的三级结构模型提示其呈一个双孔的通道 蛋白 。 亲水性配置提示其可能有 6 个螺旋形区域。学者们利用表位附加的原理，通过水通道蛋白受体嵌合体、位点特异性抗体证明了这一基本的拓扑学结构，表明氨基（ 羧基（ 端均朝向细胞质膜 5。许多水通道蛋白含有 且在原生生物中是单糖基化的。纯化的人红细胞 物化学分析显示， 50的 体是糖基化的，糖基在 多聚寡糖在 基上发生糖基化 6。尽管如此，糖基化作用对水通道蛋白的功能以及膜定位不是至关重要的。假设的子虽然有 6 个跨膜模型，但该模型仅在 以证实，因此学者们提出了 膜区域的其他组装模型。虽然不能直接描述水通道蛋白的结构和 功能， 但 许多研究已经证实渗透性驱动水的跨膜转运与葡萄糖载体、活化的环一磷酸腺苷（ 性纤维化跨膜导电调节器（ 尿素转运体 多种钠溶质协同转运蛋白相关。因此，这些转运蛋白可能包含一种在特定情况下开放的连续不断的水流闸门通道。与水通道蛋白相比，这些转运蛋白的膜分布密度相对较低，因此很难明确其是否对整个细胞质膜的透水性产生深远的影响。在钠依赖性协同转运蛋白的研究中， 提供了证据支持上述的假设，在协同转运机制下，可以发生逆浓度梯度的水路转运，一个协同转运蛋白转运单个钠离子，溶质分 子伴随大量的水分子发生转移 7。但其确切机制和生物学意义仍在研究当中。 水通道蛋白的表达及其一般生物学特性 一种小型跨膜蛋白（单体大小约 30广泛表达于机体多种细胞质膜参与液体跨膜转运。其主要表达于液体转运组织，例如肾小管、腺上皮、脂肪组织和星形神经胶质细胞。一些哺乳类动物的水通道蛋白（ ）显示出对水具有高度选择性，然而其他的 此之外还可以转运甘油分子（ ， ， 0 和 至更大的溶质分子 （ 尽管如此，对于离子和二氧化碳通过水通道蛋白可能的转运机制，水通道蛋白翻译后修饰功能的直接调节，例如磷酸化作用的确切机制 ， 至今仍未明确。水和溶质分子跨细胞膜转运所通过的分子通道的名称、单体 通道蛋白介导的溶质转运的生理意义等，这些尚未解决的问题对寻找恶性肿瘤的发病机制至关重要。 至今已经发现的水通道蛋白家族由 13 种跨膜蛋白组成，分别从哺乳类动物兰州大学 硕 士研究生学位论 文 水通道蛋白 5 过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 4 克隆得到，更多的来源于两栖类动物、植物、酵母、细菌和某些更低级的生物体。众所周知，在尿液浓缩和腺体分泌机制中，其传统的功能是介导液 体的跨细胞膜转运。在受伤的角膜、脑中风、肿瘤和感染过程中， 参与组织受压时体积的膨胀。 泛分布于机体各种组织，能选择性介导水分子的快速跨生物膜转运，形成水分子进出细胞的主要途径。根据其渗透特性以及特异的氨基酸排列顺序模型，将 族分为两组，分别转运水以及甘油和小分子溶质。 型在人类阴道独特的定位，可能对妇女阴道润滑起重要作用 8。 水的跨膜转运对于组织细胞和器官各种各样的生理过程至关重要，例如细胞体积的调节、液体分泌和细胞迁移。水分子经过细胞膜扩散和快速转运是其主要的两种跨 膜转运方式，而后者受 调节。迄今为止，研究发现几乎所有的已知的 功能，包括肺水肿、尿液浓缩、腺体分泌和缺血性脑水肿， 均 与基本的功能：渗透性驱动水分子快速跨膜 转运 有 关。 节细胞的水分子转运和细胞体积，对于机体水份的自稳态起重要作用。一些 型（被称之为水 与其他分子例如甘油和尿素的转运 9。 而且， 导细胞信号的转导 10。促进细胞迁移，敲除小鼠的 因，该小鼠的肿瘤血管生成明显减弱。近 5 年来，近 500 多项研究报道了 生物学功能，引起了众学者极大的兴趣，这些研究包括水通道蛋白的无性克隆、遗传学、组织定位、发生和表达的调节、转基因动物模型以及结构和功能分析。虽然有关 构和功能的大量研究已经完成，但是仍有许多基本问题尚未解决，而且其中某些问题的解决依然很棘手，尚需更进一步深入研究 。 水通道蛋白与恶性肿瘤的关系 相关研究已经证实 具有某些不可预知的功能。新近的研究表明其具有促进肺癌发生的潜在作用，而且 后不良有关 11。在肺癌细胞株上调 为 RK/12。近来的研究发现 13，提示 越来越多的研究发现 能成为抗癌治疗的新靶点，归因于其促进肿瘤发生、进展和侵袭的作用 14。 由于特定的组织学定位， 不同的肿瘤组织中表达特 定 的类型，例如 要表达于脑组织肿 瘤 15， 在兰州大学 硕 士研究生学位论 文 水通道蛋白 5 过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 5 脑的恶性肿瘤和脑水肿组织中 达明显升高，因此其在恶性肿瘤发生中可能起到重要的作用 16。 因缺失能诱导机体对致癌物诱发的皮肤恶性肿瘤产生抵抗。甘油分子通过 运促进细胞 成，从而刺激细胞增殖和恶性肿瘤发生。不仅如此， 泛过表达于许多肿瘤组织，例如脑、肺、前列腺和结直肠癌。 过表达于结肠癌 17。 结构及一般生物学特性 基因定位于人类 12号染色体 2号染 色体上连锁共存，并组成 65个氨基酸，是一个分子量 27初在唾液腺组织克隆得到。广泛 表达于哺乳类动物肺、脑组织、角膜、胰腺、唾液腺和泪腺等多种外分泌腺的管腔膜，以及气道粘膜下层腺体和支气管黏膜上皮的 型肺泡上皮细胞。 且能渗透性转运水分子。虽然已有相关研究证明了 如对细胞旁通透性的调节，参与细胞增殖和细胞迁移，对局部水通透量的调节有助于这些过程的发生，然而介导这些过程的特异性机制仍不明确。气 道黏膜为了回应生理的和病理的刺激，气道上皮细胞能动态地调节细胞旁通透性，而 方面迫使机体打开离子通道和通过细胞旁通路转运大分子物质，阻止这些分子进入上皮下组织；其次，他能分离和调节细胞顶端膜和基底膜的极化区域。气道上皮渗透性转运的动态变化涉及到受体配体进入到气道上皮细胞，从而调节细胞信号转导 18。在气道上皮细胞， 粒斑蛋白的定位相关，从而导致细胞旁通透性发生改变。在唾液腺， 管如此，该系统也与封闭蛋白 闭蛋白 除 组织微小气道水渗透性明显下降，然而与野生型相比，急性肺损伤不会发生在 19。推测 利于急性肺损伤的发生。 恶性肿瘤的关系 具备侵袭力以及远处转移潜能是恶性肿瘤的主要特点。研究发现， 达和肿瘤细胞的透水性很可 能成为肿瘤播散和转移的重要决定因素 20。 兰州大学 硕 士研究生学位论 文 水通道蛋白 5 过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 6 达增强 的肿瘤细胞其透水性明显增强，恶性肿瘤细胞的侵袭潜能增强的一个潜在因素可能是 表达导致细胞透水性发生改变，与 达相关的恶性倾向增强的其他潜在因素可能部分归因于粘蛋白 5达的上调 21。 现阶段，分子靶向治疗已成为抗癌疗法研究的热点，近几十年来，国内外广大学者对 肿瘤的相关性进行了研究，这些研究均发现 肿瘤形成起重要作用，许多人类恶性肿瘤样本例如肺癌 22、胃癌、结肠癌、卵巢癌和 乳腺癌均伴有 达增强。 特别是，结肠癌细胞株和人类结肠癌组织中 表达与癌细胞增殖和发生肝转移相关 23，提示 达的变化可能在肿瘤发生过程中起一定作用。在 表达的鼠肺成纤维细胞株（ 胞株），其细胞增殖能力显著增强，根据这一结果，学者们提出了 号转导通路 24，此外，有关 其相关的介导细胞侵袭的下游通路之间的分子间链接的研究，提示 合在原癌基因 域，一个与许多恶性肿瘤转移和侵袭相关的非细胞质酪氨酸激酶受体。 研究了 小鼠的乳腺导管上皮细胞的免疫定位 25。在乳腺肿瘤库， 高表达，其很可能成为一个重要的生物标记蛋白参与恶性肿瘤 的 发生和进展。 然而有关 大量人类宫颈恶性肿瘤组织表达的研究相对较少， 阶段抗癌的新策略逐渐倾向于分子介导靶向治疗和生物治疗，故研究恶性肿瘤组织中 表达及其临床意义有助于为宫颈癌提供一种新的治疗靶点。 上皮间质转化的分子生物学基础 当上皮性肿瘤细胞获得浸润能力，他们通常与细胞 减少以及间叶细胞的前体再表达有关，这常常涉及到上皮间质转化（ 生的分子学改变包括：上皮标志物缺失，例如 叶细胞相关性蛋白神经钙粘蛋白（ 纤连蛋白和波形蛋白的重新表达，小 （ 导的细胞骨架重新排列，管理基因程序的转录因子表达上调和向细胞核转运增加。在 程中，细胞形态和功能的改变伴随着相应蛋白表达产物的改变，包括上皮 标志物的缺失和间叶细胞标志物的重新表达 26。上皮细胞分别通过生长因子与生长因子受体、细胞外基质和整合素结合，来应对环境的刺激。在上皮细胞向间充质细胞转化过程中，以 达下调为特点的变化成为 生最具特征性的标志。 在于成熟细胞的黏着连接，作为维持上皮细兰州大学 硕 士研究生学位论 文 水通道蛋白 5 过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 7 胞极性的一个关键分子， 合形成一个蛋白质复合体连接到肌动蛋白骨架。 有抗细胞增殖、抗侵袭和抗远处转移能力，达缺失导致多种类型的肿瘤 细胞发生播散和转移。恶性肿瘤中达缺失的机理包括基因突变、表观沉默、翻译抑制和蛋白水解过程 。曾经普遍认为，由于转录抑制因子的活性，间充质细胞一般不表达 主要表达于间叶细胞的一些转录因子，参与 因转录抑制和 上皮间质转化与恶性肿瘤的关系 上皮细胞通过特异的细胞间粘附链接复合体互相连接，具备了上皮顶端侧和基底侧极性。然而间充质细胞间粘附较松弛，成为梭形的游动细胞，仅具有细胞前后极性。上皮细胞通过上皮间质转化等多步骤的过程转化成间 充质细胞。协同表达上皮性和间叶细胞性特征的杂交细胞是一种亚稳定的表型 27。极化的上皮细胞通过紧密连接、黏着连接、细胞桥粒和缝隙连接等细胞间链接相互紧密连接在一起，这些链接复合体共同阻止细胞发生移动。上皮细胞发生间叶细胞样转化的机制包括上皮间黏附连接的抑制、获得间叶细胞的标记物、细胞骨架的重组、脱落凋亡的抑制和增强的细胞迁移和侵袭能力。当上皮细胞完全转化成间充质细胞，其获得了细胞塑形能力。 学者们提出，在生理和病理条件下存在三种类型的 一种类型 胎 发育过程中，第二种类型 生在炎症 、组织重构和创伤愈合过程中，然而第三种类型 生在肿瘤浸润和转移过程中。细胞的这种转化过程是可逆的，间充质细胞通过间叶细胞 得上皮细胞的特性。如果一个上皮细胞发生不完全的 能形成一个同时具备上皮细胞和间充质细胞特性的不稳定的杂交细胞，这与不同肿瘤组织中存在癌细胞相一致。来源于良性肿瘤的上皮极性已经发生改变的上皮性癌细胞仍然保持着上皮细胞的许多特性。上皮性癌细胞采取间叶组织样改变从肿瘤原发部位脱离出来，这种 表型的转化使肿瘤细胞从他的原发组织脱离出来，形成二级转移灶。癌细胞中，正常的 细密调节常常被中断，而变得异常增强。因此，致癌的 号通路促进了上皮性癌细胞的迁移和浸润能力，导致其具备其他的恶性特征，例如干细胞特征、抗细胞凋亡性、逃逸免疫监视和化学阻抗。 在上皮性癌进展过程中，细胞通常失去上皮细胞特征，获得间叶细胞表型。在 80 年代初期就已经在胚胎发育过程中被检测到，越来越多的研究发现兰州大学 硕 士研究生学位论 文 水通道蛋白 5 过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 8 其与原发性肿瘤的转移相关，成为细胞发生恶性转化的重要环节之一，为宫颈癌转移机制提供了分子机理。 原位癌 发生间质浸润过程中起关键作用。在宫颈癌逐渐进展过程中，人乳头瘤状病毒感染有助于细胞转化，和典型的上皮细胞转化为上皮性癌细胞，以混杂有上皮细胞和间质细胞为特征。与宫颈癌细胞展有关的分子中，一些作用于他们的同源性受体的可溶性分子能够刺激宫颈上皮细胞发生间质转化。在宫颈癌细胞， 离子转运系统和细胞骨架调节系统一样能诱发 生。与肿瘤促进因子相比，一些肿瘤抑制剂例如稳定自由基聚合 ()能够通过抑制 生从而阻止肿瘤形成和 发生远处转移播散。 浸润和转移的发生是大多数癌症相关死因的主要原因。在恶性肿瘤转移过程中，极化的上皮恶性肿瘤细胞离开原位点，获得浸润和远处转移能力，侵入其下方的基底膜，进而侵犯淋巴管和血管壁，随血液循环运输到全身各处，从循环系统中 脱离 出，播散到次级位点，并在转移位点生长。上皮性癌细胞不仅通过集体细胞迁移而且通过 球 形或非蛋白水解样变形等单个细胞迁移形式和间叶细胞样运动从原发肿瘤位点播散出来。这种表型转换使得肿瘤细胞能从他的原始组织脱离出来，并在远处器官形成转移 灶 。上皮细胞自稳态破坏引起的这种可塑性能导致恶性肿 瘤进一步发展，这与上皮特性的消失以及转移潜能表型的获得有一定关系。在恶性肿瘤，由间叶细胞转化激活的细胞变成运动型，而且侵袭力增加了 28。因此，从上皮样细胞转化为类间质细胞样的表型转化代表了上皮细胞可塑性和癌症转移的一种重要机制。 达缺失和波形蛋白 表达增强 是 生的 2 个重要环节。达上调刺激 表皮生长因子受体（ 表达相关。肿瘤细胞和宿主细胞分泌的各种各样的生长因子 启动 发生，表皮生长因子就是其典型的生长因子之一，在间质浸润性或淋巴结转移的宫颈癌 ，其受相关刺激而表达上调。 一个锌指状的转录因子，他受 号通路表达上调，通过诱导 达下调和波形蛋白表达上调从而介导 生。迄今为止，有关 宫颈癌进展过程中所起的作用的相关研究甚少。有学者研究了表皮生长因子受体过表达、 达上调和 达模式相关的蛋白例如波形蛋白和 人类宫颈组织及宫颈癌细胞系的表达 29。研究发现达缺失或功能紊乱与宫颈癌细胞的侵袭力相关，而且与恶性肿瘤分化等级及预后不良有关。 众所周 知，肿瘤细胞具备间质浸润能力被认为是恶性肿瘤的一个重要判定标准，而且其经常被用于区别宫颈鳞状细胞原位癌和浸润性宫颈癌。一般认为癌细胞的侵袭性与 关， 发生以间充质上皮细胞一般表形的改变、细胞兰州大学 硕 士研究生学位论 文 水通道蛋白 5 过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 9 间链接断裂和细胞移动性增强为特征。表皮生长因子导致 而成为 一个诱导物。宫颈癌的进展伴随着表皮生长因子受体过表达、 达下调和波形蛋白表达下调。一般认为，达下调是恶性肿瘤进入浸润期的一个关键步骤，其显著 性的转录抑制作用被认为是 达缺失的主要因素。 生的特点之一就是细胞膜 达异常或缺失，正常情况下，要表达于上皮细胞的细胞膜，是细胞 与 合并形成复合体协助细胞间粘附，以保持上皮细胞极性并维持细胞内环境稳态。异常的 合体表达对上皮性肿瘤的浸润和转移起重要作用。 达可能通过诱导细胞形状发生改变，使上皮细胞发生纤维母细胞样改变或纺锤体样改变，从而失去 细胞间连接，导致上皮细胞极性消失和 生 30。而且， 白分子结构中含有原癌基因 结合位点，此位点被磷酸化后具备生物学活性，能激活 使 达上调。上调的 达则通过激活整合素通路，加强细胞内吞 1，导致细胞膜上 达减弱，细胞间的粘附链接减弱，从而促进 生。因此， 子结构的完整性对 发生起重要作用。尽管如此， 进肿瘤发生的信号通路至今尚未阐明。在人类宫颈癌， 何促进 生导致宫 颈细胞发生恶性转化的确切机制仍不明确。 兰州大学 硕 士研究生学位论 文 水通道蛋白 5 过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 10 第二章 材料及方法 料 织标本 选取 2010 年 10 月 2012 年 10 月在兰州大学第一医院妇产科就诊的已确诊的患者，样本总量 114 例包括： 30 例正常宫颈组织， 28 例 织， 56 例宫颈鳞癌组织，宫颈鳞癌和 织标本均来源于因宫颈病变行子宫全切术和宫颈锥切术的患者，正常宫颈组织来源于因子宫肌瘤、子宫脱垂等非肿瘤性病变行子宫切除术的患者， 56 例宫颈鳞癌患者其中 22 例年龄 45 岁， 34 例年龄 45 岁。按照国际妇产科联盟 (宫颈癌的诊断标准进行 床分期 ， 其中 A A 期患者 27 例， B 期患者 29 例。所有样本均已取宫颈组织进行了病理活检确诊，宫颈癌组包含 19 例高分化癌， 15 例中分化癌， 22 例低分化癌； 24 例发生了淋巴结转移， 32 例未发生淋巴结转移。所有患者手术之前均未接受 任何 形式的放化疗、生物学治疗以及局部物理治疗。 切取新鲜宫颈组织样本块（大小约 迅速封装入已编号的灭菌冻存管中，快速放入液氮罐储存，以 备蛋白免疫印迹分析。再切取新鲜宫颈组织块（大小约 存于 4%多聚甲醛溶液中常规固定 24 小时。梯度酒精脱水后用石蜡包埋机进行包埋，一部分切片进行常规 色用于病理组织学诊断，另一部分切片用于免疫组织化学染色分析。所有病理切片均由同一位病理诊断医师 阅 片以明确诊断。样本分为 3 组：正常 宫颈 组织、 织和宫颈鳞癌组织。 要试剂 （ 1）兔抗人 克隆抗体，购自 司。 （ 2）兔抗人 克隆抗体，购自 司。 （ 3） 良型蛋白质定量试 剂，购自武汉博士德生物工程有限公司。 （ 4）蛋白酶抑制剂，购自武汉博士德生物工程有限公司。 （ 5）辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 抗，购自 北京中杉金桥生物技术有限公司。 （ 6）免疫组化二步法（ ）试剂盒（试剂 1 为聚合物辅助剂；试剂 2为辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 聚体），购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 （ 7） 色试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 兰州大学 硕 士研究生学位论 文 水通道蛋白 5 过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 11 （ 8）硝酸纤维素膜，购自武汉博士德生物工程有限公司 。 表 2配置缓冲液 序号 名称 配制方法 1 l 磷酸盐 缓 冲 溶 液（ 分别称取氯化钠 8g、氯化钾 酸氢二钠 磷酸二氢钠 将其溶解于蒸馏水 800，滴加盐酸调节溶液的 至 后加入蒸馏水定容至 1L。高压蒸气灭菌（不少于 20 分钟），保存于常温或 4 冰箱中。 2 l 枸橼酸抗原修复液 称取枸橼酸 入蒸馏水配置成 100液，再称取枸橼酸钠 入蒸馏水配制成 500液，分别取枸橼酸溶液 90枸橼酸钠溶液 410加入 4500馏水，并滴加枸橼酸溶液调整溶液的 至 3 冲液 称取氯化钠 8g，氯化钾 入 800馏水，用盐酸调整溶液的 到 入蒸馏水定容至1000加入 温 20（ 2 要仪器及设备 （ 1）蛋白 质 免疫印迹电泳设备，购自 南京聚康医药化工有限公司 。 （ 2）旋转混合仪，购自北京卓川电子科技有限公司。 （ 3）半自动轮转式 超薄切片机，购自北京中仪光科科技发展有限公司。 （ 4） 列电热恒温干燥箱，购自山东济南百戈实验仪器有限公司。 （ 5）日本 微数码拍摄图像分析系统，购自上海肯强仪器有限公司。 （ 6）病理组织摊片烤片机，购自 康医疗设备有限公司。 （ 7）实验用 冰箱，购自北京福意电器有限公司。 （ 8）普通高压锅及电磁炉，购自 郑州中天实验仪器有限公司 。 （ 9）普通微波炉，购自厦门华联电子有限公司。 （ 10）光学显微镜，购自宁波高新区科博汇科技有限公司。 兰州大学 硕 士研究生学位论 文 水通道蛋白 5 过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 12 试验方法 蛋白免疫印迹分析 （一）提取总蛋白 取冻存的宫颈组织块迅速置于预冷的生理盐水中漂洗数次，称重，剪碎， 放入研钵内，加入液氮，取适量细胞裂解液，其中含有 1%蛋白酶抑制剂，在使用前数分钟内加入苯甲基磺酰氟（ 使 l，抑制蛋白酶活性 。按组织净重：裂解液 =1： 10的比例，加入相应体积的细胞裂解液充分研磨完成后取悬浮液转移至离心管内，静置 15在超速低温离心机下， 4 、 12000转 /分离心 15去除不可溶性分子，收集上清液。 （二）蛋白质浓度测定 使用 检测 各 样本中 的 蛋白 质 浓度，用牛血清白蛋白 (标准品，按照 定量试剂（武汉博士德生物工程）说明书计算提取液 的 蛋白 质 浓度。 1 将 干标准品 (10 )用磷酸盐 缓冲液 (生理盐水稀释成 8个浓度梯度的蛋白 质 标准品溶液。 2 各宫颈组织中总蛋白的提取采用总蛋白提取试剂。 3 取待测蛋白 品各 20蛋白标准品 20别滴加入特异标记的微孔板中。 4 每个微孔 中 滴加约 200考马斯增强型试剂 (溶液 A)，震荡 30S 使其充分混匀。 5 充分混匀后停止震荡，将样品在室温下孵育 10 6 在酶标仪中检测各样品在 595的光吸收值（ ）。 7 根据相应的 绘制标准曲线，通过标准曲线判断出特异的 对应的 样品蛋白浓度。 （三）制胶 务必清洗干净玻璃板，正确组装好制胶装置，制备分离胶和浓缩胶。将适量体积的双蒸水、丙烯酰胺、 l 的 冲液、 十二烷基硫酸钠（ 确加入制胶管，充分混匀后，最后加入 10过硫酸铵和 N,N,N,N分离胶的 冲液 制好后彻底混匀，尽快灌胶，避免产生气泡。等待 30掉封液的水，开始制备浓缩胶，配制方法与分离胶一致，但其 度 为 1l。灌胶后小心插上梳子，避免产生气泡，等待 25胶完全凝聚后备用。 （四）电泳 兰州大学 硕 士研究生学位论 文 水通道蛋白 5 过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 13 检测各蛋白样品浓度，最终把各个蛋白样品的浓度调成一致。调好电泳仪各项设置，电压 80压。使用移液枪准确上样，每孔道上样量约 20好装置， 进行 12% 启动电泳，待指示剂溴酚蓝跑到 关上电泳仪电源，取出 。 （五）转膜 提前预冷转膜液，硝酸纤维素膜要平衡预处理 10出电泳完的玻璃板，自来水冲洗，放入盛有 100膜液的小 盆中，切除未加样品的孔，留下加样品的孔，制作 “三明治 ”的顺序，从下到上依次为黑色夹子、海绵垫、滤纸、胶、硝酸纤维素膜、滤纸、海绵垫和白色夹子。将浸过甲醇的硝酸纤维素膜盖在胶上可提高转膜效果。在膜的拐角处用剪刀做记号以示区别，合上夹子并夹紧，插入转膜槽中，夹子黑色面对应转膜槽黑色面，夹子白色面对应转膜槽红色面，转膜槽中倒满转膜液，盒中放入冰袋，吸收转膜时散发的热量。 120流半干转膜 60移至已备好的硝酸纤维素膜上。 （六）封闭 称取 500甲基）氨基甲烷缓冲盐溶液（ 0， 中，制成 100闭液。转膜结束后，将封闭液倒入洗脱槽中。从转膜槽中取出夹子，用镊子取出已经转膜完成的硝酸纤维素膜，放入 含有 5脱脂奶粉的 闭液中并置于摇床上封闭 硝酸纤维素膜 1h。 （七）孵育一抗 用镊子将封闭好的硝酸纤维素膜置于两层塑封膜之间，封口机将转膜条带封闭于塑封膜中。将提前配置好的一抗分别加入不同条带中， 液稀释的 ，兔抗人 克隆 一抗 （稀释 1： 500； 兔抗人 克隆 一抗 （稀释 1： 1000； 兔抗人 克隆 一抗 （稀释 1： 500；武汉博士德生物工程） ， 避免塑封膜内留有气泡，封闭塑封膜口，将条带贴在旋转混合仪上室温孵育一抗 4h。以 为内参。 （八）洗膜 孵育结束后，取下条带，剪开塑封膜并取出条带，置于 液中清洗，将洗膜槽置于摇床上洗膜 20洗 3 次。 （九）孵育二抗 液稀释的 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 释 1： 1000； 北京中杉生物技术 )二抗孵育 1h，方法同于一抗孵育。 （十） 再次 洗膜 兰州大学 硕 士研究生学位论 文 水通道蛋白 5 过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 14 二抗孵育结束后，仍需用 液洗膜 20洗 3 次，将膜上的非特异性结合抗体洗脱，使最后的结果更加清晰。 （十一）曝光 使用电化学发光（ 蛋白质 检测试剂盒 对 特异性蛋白 进行检测 。准备好 光液，将 A 液和 B 液等体积混合，将塑封膜粘贴在 X 光片夹内，将膜、 光液、 X 光片夹带入曝光室。准备好清水、显影液和定影液。关闭日光灯，将条带置于塑封膜内，滴加配置好的发光液，使其均匀覆盖整个条带，静置 1出 X 光胶片时需关闭所有光源，将剪好的 X 光胶片覆盖在条带上，放置 后不可移动，将曝光好的 X 光片放入显影液中漂洗显影，蒸馏水清洗后放入定影液中定影 30可看到清晰的条带。 （十二）数据分析 打开成像软件，可以得到成像仪里面 X 光片的初步图像，调节增益、对比度、曝光，使图像逐步清晰，点击拍摄命名好图片名称后保存图片。使用 图像分析软件对蛋白表达水平进行分析。 免疫组织化学检测 采用免疫组织化学通用型二步法 ( )检测 。 （一）切片、摊片、烤片 取 4%多聚甲醛固定 的 石蜡包埋标本 ， 置冰箱预冷， 使用 进行 连续切片，制成厚度 约 为 4颈 组织切片，贴附于 经 多聚 理 的 载 玻片， 放入 电热恒温干燥箱 90 烤片 2小时。 （二）梯度酒精脱蜡和再水化 二甲苯 、 、 中脱蜡各 15 3次；无水乙醇各 5 3次； 95乙醇 585乙醇 5馏水 5l 3次（时间和清洗次数可适当延长 至 30 （三）高压抗原热修复 将约 800枸橼酸盐修复液（ 入高压锅内，温度调至1700 ，待锅底开始冒 气泡时放入玻片，旋紧锅盖，待高压锅开始排气约 5闭电源，约 1分钟后停止排气，打开锅盖，自然冷却约 45可采用乙二胺四乙酸（ 行 微波抗原热修复。 待玻片冷却至室温后， 取出玻片， 3次。 （四）阻断内源性过氧化物酶 每张玻片滴加 50% 过氧化氢（ 离子水（ 使其 完全覆盖组织）放入保湿盒内室温孵育 10断时间可延长至 1h。取出玻片， 士研究生学位论 文 水通道蛋白 5 过表达与宫颈癌发生及临床病理特征相关性的研究 15 洗 5 3次。 （五） 孵育一抗 每张玻片滴加 50抗人 释 1： 200，抗人 释 1： 100， 放入保湿盒内 温箱孵育 30置于 冰箱过夜 ，孵育 12 （六）复温 取出保湿盒室温下复温约 45时可见盒盖有水珠形成，取出玻片在 3次。 （七）孵育二抗 每 张玻片滴加二抗试剂 1（聚合物辅助剂，即用型） 50温下孵育 10 37 孵育 30取出玻片 ， 3次。滴加二抗试剂 2（辣根过氧化物酶标记的 ， 羊抗兔 用型，北京中杉金桥生物技术有限公司）室温下孵育 20出玻片 ， 3次。 （八）显色 取二氨基联苯胺（ 色剂 A、 B、 0加入 850张切片滴加一滴 0秒，观察组织变色， 若组织呈现棕褐 色 、 不可溶性沉淀物 则 视为阳 性，甩去多余水分，自来水浸洗 5馏水 浸洗 5 （九）苏木素复染 将切片浸入苏木素液染细胞核（ 6可见组织呈紫蓝色，自来水洗至无色，蒸馏水洗 1遍。 （十）盐酸酒精分化 每张切片迅速在盐酸酒精内浸染 2s，可见组织逐渐变成粉红色，自来水浸洗3次，至组织变成紫红色。 （十一）返蓝 流动的自来水冲洗切片约 4见切片逐渐变蓝紫色。（也可水浴锅返蓝），保持切片湿润（避免干片），光学显微镜下观察细胞核染成淡蓝色，若细胞核染色过淡，则重复 上述过程 。 蒸馏水 浸洗 3然晾干 玻 片 （或温箱烤干）。 （十