【毕业学位论文】（Word原稿）洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系

兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 1 第一章 前言 噬体由来，概念及分类 1962 年 人使用电子显微镜在人的肝细胞中观察到的“自我吞食” (象，将其命名为“ 即自噬。 1974 年士因为在自噬方面开创性的成果而获得了诺贝尔奖，稍后溶酶体也被发现。近些年来，人们对自噬的研究逐步深入，目前研究表明，自噬是真核细胞在正常发育、自体免疫、衰老或遭受生物与非生物胁迫过程中对自身胞质组分再分解利用的重要方式之一。自噬主要分为 4 类，即巨自噬（ 微自噬（ 超自噬（ 分子伴侣介导自噬（ 泛存在与真核细胞中，一般说的自噬指的就是 程中，最初由来源不明的膜包绕待降解物形成自噬体（ 或自噬泡（ 随后 外膜与液泡膜融合，使体（ 入液泡内，此后 膜破裂，将内含物释放到液泡内并被液泡内的各种水解酶降解； 液泡或溶酶体的膜通过内陷作用直接包裹长寿命蛋白，通过修剪（ 成泡内小泡，稍后泡内小泡破裂，内含物释放到液泡内，进而被液泡内的水解酶降解（ (007)）；：细胞内的液泡或溶酶体直 接破裂，其中的水解酶被释放到细胞之中，导致周围大量细胞质和细胞器的降解 (007)； ：一些具有选择性的可溶胞质蛋白与溶酶体膜表面的受体结合，然后被转运到溶酶体内，最后被溶酶体内水解酶降解的过程。 噬现象的研究现状 关于 20世纪 90年代， 后通过筛选大量的自噬突变体，成功筛选出一批酵母自噬相关基因，目前在酵母中已经发现 30多个自噬相关基因，这些基因所编码的蛋白质参与到自噬的各个过程，包括自噬体产生的诱导，小泡的成核，质膜包裹内含物，自噬体装配完成，与液泡融合等。对于单细胞的酵母，通过自噬降解作用使物质能重新循环利用，对维持胞内相对的稳态起到十分重要的作用，这也是自噬的主要功能之一。 兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 2 其次是其他哺乳动物和人类 (et 1998; 005),在动物中自噬除了参与细胞营养胁迫过程外，还参与肿瘤的形成，免疫反应，程序化细胞死亡，神经退行性疾病等方面的生理生化过程。 近年来在植物方面自噬的研究也取得了一定的进展。目前的研究表明，在植物生长发育过程中，自噬主要有两种途径，即 007)。 是液泡膜内陷，包裹周围的细胞质组分（核糖体，线粒体，细胞核，部分细胞质等），形成泡内小泡，然后泡内小泡通过 挤压断离作用，使包裹内含物的小泡脱离液泡膜而进入液泡内。前人在研究橡树橡胶颗粒向液泡内的转运及萌发的小麦种子中贮藏蛋白的积累过程中，发现了液泡凹陷包裹细胞内组分的类微自噬现象 (et 1992; et 2001)。同样的，在一些植物种子萌发过程，微自噬参与由“内吞”作用运输 到液泡中的贮存蛋白和淀粉颗粒的降解 (et 2003; et 1980)。然而， 同， 初起源于未知来源的前体，前体包裹带降解的组分，然后扩张延长，最终形成双膜结构包被的 后 膜与液泡膜融合，释放 液泡中。最后自噬小体在液泡中各种水解酶的作用下解体，释放出内含物，内含物在液泡中降解后生成的分子物质可以循环利用 (et 2006)。 与多种多样的细胞代谢途径。巨自噬在很多植物中都有报道，如拟南芥 (et 2002; et 2002),烟草(996)。 进入 21世纪后，随着研究领域的拓宽，人们发现 与细胞发育、衰老和自体免疫有关 (et 2006; 005),因而研究者对 今已成为当今植物细胞和分子生物学研究的热点，被越来越多的研究和报道。 物自噬体（泡）形成的过程、及分子机制 通常我们说的自噬为巨自噬（ 在降解无功能或受损蛋白质及细胞器过程中起主要的作用， 成前体（ 前体继续发育，形成双膜结构且包裹待降解物的 液泡融合形成自噬溶酶体，降解物在自噬溶酶体中降解 (008)（图 1）。 1） 自噬是被雷帕霉素标记（ of 激酶信号诱导产生的 (000)。 止 抑制时， 合，经过磷酸化作用后诱导自兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 3 噬产生。 个非常关键的步骤 (et 2000; 005)。在拟南芥中，只有一个 两个 因被鉴定 (et 2002; 002)。然而， 因有个小的基因家族（ (et 2006)，其功能仍在进一步研究中。 2）小泡成核 小泡成核现象由液泡分拣蛋白（ 3,4 二磷酸 3一复合体包括 件 (005)。拟南芥 变体表现出如下缺陷表型： et 2007) (et 2007b) (008)。 对营养胁迫更为敏感。 c. 发育畸形。 008)。这些结果表明 一个多功能的蛋白。 3） 在 ，包括两个泛素类的共价结合路径 (005; 001; 005)。在这两个路径中， 为泛素类标签 ,分别共价结合到标靶磷脂酰乙醇胺（ 成 个中间体被转运到 酶 后分别到达 et 2000; et 2002; 008; 005)， 合需要 白酶的参与， 价结合 4） 双膜结构的 裹部分细胞内含物（核糖体、质体、叶绿体、部分细胞质等），最终外膜与液泡融合，释放自噬小体，然后将内含物降解。在酵母中， 合体起了决定性的作用，包括了 白 族 (005)。 变体有早衰、对营养胁迫敏感等典型的自噬缺陷表型，表明 南芥基因 株表现出典型的自噬缺陷表型 (et 2010)。 5） 在裂解过程中， 中， 兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 4 图 1自噬体在植物细胞内形成发展的过程 图 1核心自噬基因参与自噬过程路径图（ J,005) 物自噬标记物 近期的报道大量的讨论了研究自噬作用的工具 (et 2009; 兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 5 et 2010)。这些报道主要集中在植物细胞中荧光标记物方面。 1）刀豆素 A。自噬体不仅可以在自噬被诱导时期积累，也可以在自噬后期被抑制而积累。例如，如果自噬体和溶酶体的融合被抑制或延迟，自噬体将积累（ et 2010)。刀豆素 2）嗜酸性染料。中性红， 酸性结构的标记，但对自噬体的特异性不强（ 2004）。因此，不推荐用这些染料标记自噬体活性。 3）绿色荧光蛋白标记。细胞质中 变体缺陷和 价结合路径中观察到了这种现象。例如， 双突中检测发现 (et 2004)， et 2011)和 D 未发表数据）也有发现。 光在突变体细胞质中出现的原因现在还不清楚。但是所有发表的文章中，以花椰菜花叶病毒 35 物自噬中的生理功能 关于 量的证据表明 物生长与发育、细胞衰老有关，还与植物抗生物或非生物胁迫（氧化胁迫）有关。 噬与植物营养物质的循环利用 植物在遭受饥饿胁迫（ C、 件下，会诱导自噬 的产生。水稻（ 胞在受到 C 胁迫时，通过自噬作用，把蛋白质等物质运送到液泡中(007)；烟草（ 遭受 C 胁迫时，细胞中出现大量的双膜包被结构，这些双膜包被的自噬体，包裹部分细胞内含物，运送到液泡中，降解后组分可以循环利用 (996)。在拟南芥中，自噬的相关功能被较为系统和全面的研究。通过超微结构的观察，可以看到拟南芥中自噬的整个过程：饥饿诱导后双膜结构自噬体形成，自噬体外膜与液泡融合，液泡内形成自噬小体，自噬小体解体，内含物在液泡中降解。利用分子生物学技术 ，对 关基因表达量进行检测发现，在饥饿胁迫时，明营养胁迫确实可以诱导自噬的发生。更为有利的证据表明，在受到营养胁迫时，大部分 座叶大面积黄化，生殖系统退化等表型。且当饥饿胁迫去除后，其表型仍不能完全恢复。这兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 6 一现 象表明自噬在植物受到营养胁迫时起着十分重要的作用，可以分解胞内物质使组分循环利用，维持一个相对平衡的细胞内稳态，从而暂时性的减小外部胁迫对植物致命的生存压力。 噬与植物生长与发育 在植物整个生长发育过程中，自噬体的积累在形态学上属于程序化细胞死亡（ 一种 (et 2011; 005)。在植物 et 2011)。在动物中，自噬突变体表现出形态学上的缺陷，包括新生老鼠致死和果蝇蛹的发育延迟 (008; 010)。在植物结构学上，不仅在几个拟南芥 价结合突变体中没有明显变化，而且在 有的成活拟南芥突变体中，叶片衰老加速，说明在衰老叶片中，不仅自噬能调控 有其他机制共同作用。 管的延迟分化是所有 变体中仅有的和 关的表型。这一发现表明对 自噬可能有泡状体的生物起源 (999)作用。在植物细胞中至少有两种结构类型的泡状体，溶解泡状体和蛋白储存泡状体（ 二者分别执行分解和储存功能。大量数据表明有很多方法可以产生植物泡状体，然而泡状体生物起源机制仍然不清楚 (et 2009)。部分原因是没有一个功能性 泡状体突变体是致死的 (et 2010; et 2001)。对自噬突变体缺陷型植株液泡进行更系统深入的分析也许可以揭示液泡生物起源的延迟或者小的碎片化结构的泡状体形成。对大量的拟南芥突变体做前体再生将会是一项非常有意义的实验。 在单子叶植物中自噬和 形成有关。小麦细胞中包含醇溶蛋白的蛋白体的运输和自噬过程十分相像 (et 1992)。在玉米糊粉细胞也观察到细胞质和 噬泡包含运输蛋白 ,但这些泡状体却不含 白 (011)。 小麦中的一项研究发现自噬参与了小麦花的败育 (et 2008)。小麦花的超薄切片观察表明，在子房中，发现不同程度的自噬降解作用，且发现了有力的 证据，如染色质凝缩，细胞核解体等现象。利用 术，对自噬相关基因 因的检测，其表达量迅速上升。以上结果表明在小花程序化死亡过程中，有自噬的参与。但到底是自噬减缓了程序化细胞死亡还是加速了程序化细胞死亡现在还不清楚。 在花瓣衰老方面，研究者以大牵牛花为对象，发现自噬可能对其花瓣衰老起调控作用 (et 2009a; et 2009b; et 2009)；兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 7 后研究发现， 用基因沉默技术后 ，细胞内自噬减少，衰老加速。以上种种结果表明，自噬的确可以在花瓣中被激活，主要作用就是延缓其衰老。 细胞自噬现象与根的生长发育密切相关。在众多 变体中， 根也受到一定影响 (et 2004)，在 变体中，根的伸长也受抑制 (et 2002; et 2007a)。有趣的是，在拟南芥根中自噬为组成性表达，且在伸长区和分化区自噬活跃程度远远超过其他区域。以上结果表明细胞自噬在根生长发育过程中起到重要作用，有可能影响根的伸长和分化作用。 噬与植物细胞衰老 植物的衰老过程实际上是植物衰老部分物质被降解后，可以循环利用的分子被运送到正在发育、急需大量营养供给的幼嫩组织或生殖器官，这是一种营养物质的再利用过程。近年大量的研究结果表明，自噬在植物衰老过程中，起到重要的作用。 大量的文献报道拟南芥突变体 现叶片严重黄化、蛋白总量下 降及衰老相关基因激活等衰老表型。即使在没有胁迫的条件下， et 2010; et 2002; et 2005; et 2005; et 2004) 。植物衰老时叶绿素含量下降，叶绿体被降解，叶片出现典型的黄化现象。最近的报道表明，在衰老细胞中自噬确实参与叶绿体降解的一 系列过程。在 20世纪 80年代， et 1982)等在观察暗培养的小麦时发现，叶绿素水平和核酮 糖 加氧酶（ 活性下降，叶绿体含量也减少，更为重要的是，在液泡中发现了叶绿体，表明叶绿体在细胞中的降解是经过一系列细胞内机制完成。随后，这一现象在越来越多的植物及器官中被发现 (et 1984; et 1995)。以电子显微镜技术为手段研究衰老小麦叶片中 察到 et 2003)。以上结果表明衰老细胞内存在一个 解机制，自噬作为胞内蛋白降解的经典路径，极有可能参与了这一过程，从而使分子组分循环利用。因此，在衰老的叶片细胞中，可能存在两种自噬相关的叶绿体降解路径，一个是直接包裹叶绿体，送入液泡中降解，另一个是将包裹 而对叶绿体内蛋白逐步降解。 然而拟南芥 变体中，叶绿体及其相关蛋白仍然可以被降解，这表明植物细胞中仍有其他路径来行使这一功能，这一方面的研究仍在继续。 兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 8 噬在受到生物和非生物胁迫时的作用 植物因 缺少运动免疫细胞，只能依靠先天的免疫系统来抵御识别外来病原体。植物免疫受体可以分为两个大类：细胞表面受体和细胞内的免疫受体。表面受体，也叫做模式识别受体（ 识别一个病原相关的分子模式（ 是一个微生物结构，或者功能单元，活化 ，直接或者间接的通过对病原体的免疫应答和效应器相互作用细胞 。他们的相互作用致使免疫效应器（ 活，结果是使细胞致死，称作超敏反应（ (010; 006)。 自噬突变体表型表现出较早的衰老并伴随着细胞加速死亡 (011; 009)，超敏细胞死亡在植物抵抗疾病方面有着重要的作用，可以限制病原体的扩张，自噬可能以某种方式帮助植物防御反应，尤其在 自噬控制的细胞死亡和植物防御反应的关系首先在烟草中发现。病毒诱导的 因沉默（ 不受控制的细胞死亡扩散。丁香，番茄，或者铁线蕨实验表明这种植物细胞死 亡的缺陷由 后人们发现自噬和 关系：自噬体是被可侦测的效应器（ 导的 (et 2009)。 因为过早的衰老和病原体诱导的超敏细胞死亡，在光下生长的自噬突变体需要水杨酸（ 号，实际上，水杨酸在自噬突变体里高度积累 (et 2011; et 2009)，表明 自噬负调控了水杨酸的信号通路。水杨酸类似物用于病原体感染和治疗可以诱导植物 et 2009; 008)，表明自噬和水杨酸信号互为负反馈调节。然而，一些自噬表型没有被水 杨酸的缺乏而抑制，如 物在黑暗诱导下的衰老和饥饿下的生长抑制 (et 2009)。同样的，被病原体侵染引起的细胞死亡，二孢白粉菌在 明自噬功能和水杨酸信号通路有依赖的方面，也有独立的方面。在自噬突变植株中自噬的水杨酸依赖活性可以解释为活性氧（ 是部分依赖水杨酸的 (et 2011; et 2009)。 通过检测 因来证明它们是否参与非生物胁迫的反应。除了氧化胁迫外，多重突变体对盐和缺水胁迫高度敏感 (et 2009)。这种超敏机制目前还不太清楚， 能是一个十分重要的参与因子。 受到营养胁迫和环境胁迫时，是一个普遍的植物应答调节子 (et 2004; 004)， 植物细胞中和动物中一样，可能诱导自噬的出现兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 9 (007; et 2007)。因此 ,营养、生物、非生物胁迫都可能诱导 果使自噬活性增高。相反的，在一个假设的非胁迫情况下， 片相比野生型来说，积累较高水平的过氧化氢，表明自噬限制 et 2009)。 如降解蛋白质和受损的细胞器），额外的非生物压力可以使 噬现象研究过程中出现的问题 目前研究发现尽管在不同细胞、组织、植物和环境条件下都有双膜结构的类植物中，大量与酵母 因具有同源性的基因（如 、 4、 7、 9、 18等）已经被克隆或鉴定，并获得了一些具 因敲除突变体，但具体到植物中 构、形成与转运机制和不同器官组织中所行使功能的研究才刚刚开始 ，许多问题仍然没有研究清楚。存在的主要问题有： 1）观察 植物中可能存在两种路径，一种是成熟的 接与液泡融合，随后其中的内含物被液泡内的水解酶分解；另一种是先被溶酶体结构的细胞器吞噬，形成自噬溶酶体，自噬溶酶体随后与液泡融合，并被液泡内的水解酶分解。以上两种路径在悬浮培养的烟草细胞中同时存在。然而，在不同细胞、组织、植物、发育阶段、环境等条件，哪一种途径其主导作用，目前仍不清楚。 2）根据氨基酸序列的同源性，在植物中克隆和鉴定了很多与酵母 因同源的基因，然而，这些基因在 程中所行使的准确功能现在还不清楚。即使是对研究最早、生物结构最简单的酵母 3) 双膜包被的 P 的主要特征，但是有关 的来源仍不完全清楚。目前有两种观点 :第一种观点支持膜来源于一种称作 隔离膜，许多 张头尾联合最终包裹部分细胞质与细胞器形成 C。 的生成不依赖其他膜性细胞器（如高尔基体、内质网），合成过程具有独立性。第二种观点认为 V 的膜来源于内质网或高尔基体等膜性细胞器。 4）过去研究一直认为细胞凋亡（ 一个概念，即 同于而，近年来大量研究结果表明， 是 些 形态学特征不符，而在有些细胞中虽显示出 态特征的细胞死亡，但并非是程序化的； 显示 D 也属于 同类型的 相互关联，相互影响的。然而在植物细胞方面关于自噬作用的具体功能和调节机制、自兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 10 噬与 5) 植物而言主要局限于拟南芥，其次为烟草，就器官、组织和细胞水平而言，主要局限在正在萌发的种子，受营养胁迫的细胞悬浮培养物、自然衰老或受外来病原真菌侵染的叶肉细胞。在其他植物、组织、细胞较少报道。 6）自噬在植物雄性不育系花药败育过程中是否积极参与细胞死亡过程及这一现象是否具有一定的普遍性。以前关于植物自噬作用的研究主要集中在体细胞方面，在生殖细胞尤其是雄性不育系花药中鲜有报道。 数分裂过程与雄性不育败育的细胞和分子生物学机制 减数分裂是植物有性 生殖过程中最为关键事件之一，也是生物遗传、生物进化和生物多样性得以进行的前提和基础。减数分裂使亲代和子代的染色体数目保持恒定，这样保证了物种遗传物质的稳定性，而同源染色体交换及非同源染色体重组，使配子的遗传基因多样化，对生物进化及环境适应等方面起到十分积极的作用。减数分裂发生在花粉母细胞和胚囊母细胞中。 自花药原基中的孢原细胞。为了保证有性生殖的有效性，孢原细胞经过分裂形成许多 些过减数分裂形成更多的雄配子体。如此大的一个群体，通过怎样的机制维持细胞分裂的同步性以及保证最终产物具 有相同的生活能力？这是一个极有意义而长期悬而未决的问题。 在 19 世纪发现植物的雄性不育现象。本世纪以来，雄性不育的遗传理论也不断发展。植物产生雄性不育主要受环境和遗传两大因子的影响。温度和光照这两个环境因子对植物雄性不育有重要的作用。从植物雄性不育性的遗传背景来看，可分为核不育和细胞质不育。细胞质雄性不育在显花植物中广泛存在 (988)，其表现为卵细胞发育正常，可以通过人工传授正常花粉而结实，但小孢子发育异常，不能产生花粉或花粉败育，属母性遗传，即细胞质遗传。 此外，植物雄性不育在作物育种上具有重要的实用价值。然而关于植物雄性不育系花药败育的细胞和分子生物学机制目前仍不完全清楚。花药（粉）败育实际上是由基因控制的 种 有 结构出现表明 能与参与 化、同步性分裂及 过进一步研 究，希望能对 子调节机制、 时，进一步了解 兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 11 究目的与意义 鉴于在以上植物 观察到的 态与结构上与目前定义的 V 十分相似，因此我们推测在这些植物的生殖细胞中都可能有 发生。在 作用可能与消除早期（造孢时期）因细胞不对称分裂造成后来的 的是通过同步减数分裂，获得大量均一的有功能的雄配子体，以保证成功的受精； 在 中， 可能与 因控制的花药或花粉败育及 是仍有许多问题有待研究，如它们的膜来源是什么？被膜包裹的内含物是否具有选择性？自噬是否真正参与到植物花药败育过程？这一现象是否具有一定的普遍性？ 洋葱（ 百合科葱属， 2 年生草本植物，是我国主要栽培的蔬菜作物。本实验以甘肃酒泉农科所提供的 洋葱为材料，通过光镜、电镜及分子生物学技术等手段，验证在洋葱的败育中是否有 者 自噬与洋葱 紧密相关？同时也可以验证 此，本实验在以前课题组研究的基础上，以洋葱花药为实验材料，采用细胞与分子生物学研究手段，对以上问题进行必要的探索。 兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 12 第二章 材料与方法 物材料 雄性不育系和可育系洋葱（鳞茎）由甘肃酒泉农科所提供。 2011 年 4月 7日种下鳞茎。所有鳞茎都种植在相同大小的培养盆中，每个培养盆种一个鳞茎。在室外自然光下培养，隔一天浇一次水 。 5月下旬洋葱可育系和不育系产生花芽， 6月中旬开花， 7月下旬花朵开始凋谢。收 集不同发育时期的新鲜花芽进行实验，并固定处理一批电镜用包埋块。 剂配制 良苯酚品红染液配制： 取 3000%乙醇中 取 0入 90% 石炭酸水溶液 取 55冰醋酸和福尔马林各 6色液 取原液 C 20 30入 45%的乙酸 7080入加山梨醇 3%戊二醛固定液： 磷酸缓冲液（ 885%戊二醛 12酸 2%锇酸原液的配制： 2%的 入棕色磨口试剂瓶中，在通风厨内把安瓿瓶敲破，即刻加入双蒸水，配制成 2%水溶液，盖上盖子，放置过夜或更长时间使其溶解。此后作为储备液，于冰箱中密封保存。 兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 13 %锇酸固定液： 磷酸缓冲液 (2 %锇酸 8mL 糖 16 埋剂配 方： 3 80 12滴 配制完成后需搅拌 1验试剂盒 植物组织 取试剂盒 : 50转录试剂盒： 生工生物 一链 验方法 S 系花药形态分析 采集新鲜的洋葱 察花梗、花托、花萼、花冠、雄蕊群和雌蕊等部分，对 花的不 育有个直观感性的认识。 药发育过程涂片法观察小孢子发育 5月下旬收集洋葱 涂片法挤压出不同发育时期的花药，经过改良苯酚品红溶液染色后在光镜下观察可育系与不育系洋葱花药不同发育时期生殖细胞的显微结构。生殖细胞的发育由雄蕊原基开始，产生花药原始体，进一步发育成造孢细胞以后发育成花粉母细胞，经过减数分裂，最终形成花粉。兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 14 通过改良苯酚品红染色，找出在花药形成过程中 定不育系花药的不育现象发生在花药发育的具体时期，为下一步实验做铺垫。 品固定， 浸透，包埋，修块及切片观察 固定： 从 S 系中剥离花粉母细胞时期，四分体时期以及小孢子时期花药，根据需要，花药被切成长 1后迅速放入含 3%的戊二醛和 酸的 ,在室温环境中处理 6小时，中间换一次固定液。然后样品用 涤三遍，每次 后投入含 1%四氧化锇的 酸缓冲液（ 4过夜。随后样品经过梯度冷酒精脱水： 30%70%95%每级 20100纯酒精三次，每次 20 浸透： 将脱水后的材料用环氧丙烷过渡 30间换一次液体），随后于 2:l、 l:1、1:2环氧丙烷 /环氧树脂包埋剂 (分别浸透 2 4h，最后用纯环氧树脂浸透 1温）。 包埋： 用滴管向包埋板孔注入混合好的 孔一滴，用干燥牙签将浸透好的组织块拨入包埋板中，并将组织块按所需切面置于模孔顶端，用滴管向模孔注满 包埋好的模板放入温箱中聚合： 35 24h 45 24h60 24h。包埋块聚合以后，分别用纸袋装好编号，放于干燥器中保存 备用。 修块： 将包埋块用标本夹持器夹紧，将标本夹持器放在支持座上，便于显微镜下观察，用双面刀片在包埋块上表面水平削一刀，使包埋的组织刚好露出，将包埋块削成梯形截面，最后将包埋块放于干燥器中保存。 切片： 包埋好的样品块用薄片切片机（ 行切片，厚度两微米，将切片放于干净的载玻片上，经 苯胺蓝染色，用双蒸水冲洗后，在光镜下观察。 薄切片机切片及电镜观察 将选择好的目的包埋块，用超薄切片机（ 新切片。铜网捞取切好的片子，用饱和醋酸双氧铀 水溶液和柠檬酸铅染液染色后，保存于干燥器中，待干后进行观察。在 观察并照相。 兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 15 定检测 因在洋葱根、叶及花药中表达 提取 ，及可育系和不育系花药的总 转录后，使用刘岩林同学根据不同植物 5 5 进行 25个 后琼 脂糖凝胶电泳，检测 20 1 l l l l l l 模板 1 l 程序过程 温度 时间 预变性 94 4性 94 30S 退火 54 30S 延伸 72 40S 兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 16 第三章 实验结果 F 系和 花药形态学观察分析 月下旬花芽开始发育， 6月中旬开花。早期刚形成花蕾时， 开花药，这些花药呈浅绿色，比较圆润饱满。随着花的进一步发育，花朵盛开，经过仔细比较，花梗、花托、花萼、花冠、和雌蕊发育正常，但 花 6个花药中，有不同数目的花药畸形，每朵花中畸形花药数目从 1到 6都有发现 (图 3取一朵开放的 3），剥离花药，看到有 5个花药形态畸形，一个花药正常。将部分花药放大，我们发现，在形态上，正常花药 (图 3)整体饱满，表面平滑，色泽光亮， 药隔笔直，畸形花药 (图 3)较为干瘪瘦小，表面有沟壑凸凹不平，色泽暗淡，药隔深且弯曲。由此可以说明，此品系的确为雄性不育株系。 图 3- 1 A： 花朵，显示有正常的六个花药； B,C： 花朵，显示有不正常的花药 ,B 为三花药畸形， D： 一朵花中六个花药其中 5个为畸形化药，一个正常； E： 色亮丽； F： 中畸形花药，花药干瘪皱缩，色泽暗淡。 兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 17 片法观察 和 花药发育过程 在洋葱 花蕾压片中，可以观察到 形态饱满圆润的花粉母细胞 (图 3)，此时花粉母细胞形态规则，染色体形状完整。四分体时期的细胞具有相对明显特征 (图 3)，此时四分体细胞外面仍有胼胝质包裹，四分体结构排列较为紧凑，以及较为规则、比较饱满的小孢子细胞 (图 3)；然而在 中发现大部分花粉母细胞初期形态相对不规则，染色体混乱，有些细胞发育畸形（图3,D）， 到了花粉母细胞时期的稍后期，可以看到细胞胼胝质壁增厚不明显或者没有，细胞呈变形虫状，严重畸形（图 3），随后细胞结构完全破坏，只有部分细胞和和细胞质残余（图 3）。细胞未向四分体方向发育，走向解体。由此可以看到， 的不育发生在花粉母细胞阶段。由于某些原因未能接着发育到四分体以及小孢子阶段。 图 3 A： 花粉母细胞形态规则圆润，较为规则，细胞核浓缩，处于第一次减数分裂时期； B：C： 小孢子； D， E： 花粉母细胞，大部分细胞形态和 分细胞畸形，解体； F：解体的 胞结构完全破坏，只有部分细胞核和细胞质残余。 F 系和 葱花药显微结 构观察 洋葱成熟花药壁由外到内依次为：表皮、药室内壁、中层、绒毡层（图 3）。表皮和药室内壁的液泡化程度很高。此时的中层和绒毡层细胞呈扁平的条状，绒毡层的外形很不规则。洋葱绒毡层为腺质绒毡层，在发育过程中在原位解体。在绒毡层以内的 积巨大，约为表皮、 药室内壁细胞的 2，早期造孢细胞呈较为规则的多边形。随着 继续发育，细胞间隙加大，细胞变得圆兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 18 润，细胞外的胼胝质壁增厚，细胞核中的染色质浓缩变形为染色体，小孢子开始为进入减速分裂前期做好准备（ 图 3） 。 过精妙的减数分裂形成 四分体（ 图 3）， 4个小孢子大多呈等四面体排列，外层由厚厚的胼胝质包被。此时药壁的表皮、药室内壁和中层细胞没有特殊明显的形态变化，但绒毡层的体积极度膨大，细胞呈较有规则的椭圆型，细胞核巨大且呈规则的圆形，位于细胞中央，绒毡层细胞与细胞之间接触紧密无间隙，细胞内有较多的液泡化现象。随后的继续发育使四分体胼胝质壁解体，成型的 4个小孢子被释放出。此时绒毡层逐渐解体消失，（ 图 3）。这一时期小孢子壁继续发育和加厚，形成了完整的花粉壁结构，覆盖层、基粒层、外壁内层和花粉内壁都清晰可见（ 图 3）。 图 3 A：早期花粉母细胞排列紧密，染色质松散，表皮、药室内壁、中层和绒毡层已分化形成； B：晚期花粉母细胞胼胝质壁加厚，染色质凝聚，绒毡层细胞体积没有明显变化； C：经过减数分裂形成四分体， 4个小孢子被包裹在厚厚的胼胝质中； D：四分体胼胝质壁解体，小孢子释放成为游离状，此时绒毡层细胞膨大明显； E：小孢子晚期时细胞核迁移、靠边，产生极性；绒毡层明显收缩； F：小孢子经过一次不均等分裂形成二胞花粉。 EN：T： 兰州大学硕士 研究生学位论文 洋葱雄性不育系花粉母细胞败育与自噬现象的关系 19 药结构表皮，药室内壁 ，中层和绒毡层及花粉母细胞分化已形成，看出表皮和药室内壁细胞的液泡化程度比较多，一个中央大液泡占据细胞的大部分，细胞质和细胞核被挤到一个较小的区域（ ）。在洋葱花药发育早期的初期阶段，洋葱花药的表皮和药室内壁细胞相对狭长，呈现长条状（ 图 3, C） ；随着花药的发育，表皮和药室内壁细胞膨胀变圆，体积变大。中层细胞大致呈长条形，细胞核为长条状，绒毡层细胞处于分化早期阶段，形状不甚规则。但随后绒毡层 细胞却解体消失，而不是 减数分裂后形成体积膨大的形态特征（图 3、 F、 G、 H、I），中层细胞也有部分解体。 1）在发育初期，即造孢细胞时期，细胞形态不规则，细胞壁 (度弯曲变形，呈变