HE染色PPT课件.ppt

HE染色试验技术及注意事项 1 HE染色又称苏木素 伊红染色法 是普通光学显微镜观察与鉴别细胞凋亡与细胞坏死的一种染色方法 2 报告内容 HE染色原理试剂染色步骤注意事项几种常见的染色问题 3 HE染色原理 苏木素 苏木红 蓝色色精 分化和蓝化 氧化 铝 细胞核 负电荷色酸 染料有色部分 伊红 染色 染色 正负电荷的极性吸附 正电荷色酸 染料无色部分 水解 渗透作用或者弥散作用完成 4 试剂 苏木素染液 细胞核着色 盐酸乙醇分化液稀氨水伊红染液二甲苯梯度浓度乙醇 5 染色步骤 常规脱蜡 苏木素染色 5 15min 水洗 盐酸乙醇溶液分化 30s 水洗 伊红染色 1 3min 水洗 氨水反蓝 30s 水洗 90 乙醇 5min 80 乙醇 30s 100 乙醇 2次 10min 二甲苯 3次 5min 封片 染色 脱水 透明 封片 脱蜡 染色的时间 应根据室温 及组织的具体情况来确定 做之前做预实验 6 7 注意事项 1 脱蜡 切片脱蜡后才能染色 且脱蜡应彻底 脱蜡好坏主要取决于二甲苯的温度和时间 如果二甲苯是用过一段时间 切片又比较厚 室温低应增加脱蜡时间 脱蜡不净是影响染色不良的重要原因之一 2 染色 根据实际情况 通过预实验得到最佳染色时间 一般情况下新配的苏木素染液中只需染1 3min左右 应根据染片的多少 逐步把染色时间延长 分化时间不易过长 分化应在镜下观察 分化过度 应水洗后重新在苏木素染液中染色 在水洗分化和使切片在自来水或稀的氨水中充分变蓝 蓝化 新配的伊红染色块 切片染色不易过长 应根据染切片的多少逐步延长染色时间 切片使伊红染后 分化时间要短 8 3 脱水 染色后通过各级酒精脱水 从低浓度到高浓度 低浓度酒精对伊红有分化作用 切片经过低浓度时要短 向高浓度逐渐延长脱水时间 脱水不彻底 使切片发雾 在显微镜下组织结构模糊不清 4 透明与封片 切片染色脱水后必须经二甲苯处理 使切片透明 才能用树胶封片 应引起注意的是 二甲苯纯度不纯使切片透明不够 会影响切片质量 9 几种常见的染色问题 脱蜡 切片中白色的区域脱蜡不彻底 染色液由于石蜡斑点的残留而不能渗透着色 原因 烤 烘 片温度太低 脱蜡前没有充分烤 烘 干 二甲苯脱蜡时间不足 或二甲苯使用过久 造成脱蜡不尽 对策 用无水乙醇去掉玻璃片上的水分 重新二甲苯脱去石蜡 切片需退回到脱蜡步骤 延长脱蜡时间 或跟换二甲苯 驼色 漂白 重新染色 10 染色 1 苏木素染色 原因 染色时间短 苏木素过度氧化 失去染色能力 分化时间过长 苏木素染色太浅 细胞核与细胞质颜色对比度差 对策 切片重新染色 11 细胞核过染 核膜 核仁等不清晰 细胞质 尤其是皮肤上皮细胞 含有大量的细胞核染色液苏木精 导致细胞核与细胞质比例失调 原因 与图2相反 染色液时间过长 切片太厚 分化步骤时间太短 对策 如果切片不是因为太厚 脱色 漂白 重新染色 对于染色和分化时间做些适当的调整 若太厚则需要重新切片 12 切片细胞核棕色 表明苏木精没有充分蓝化 或苏木精过度氧化失去染色能力 原因 苏木精染色液过度氧化和切片在苏木精染液染色后返蓝不足 对策 染色前检查苏木精染色液的染色能力 过渡氧化 应及时更换 其次 在苏木精染色后 给切片以足够的蓝化时间 13 染色后有杂质 原因 苏木精染色液中的金属膜 黏附在玻片上 对策 每天染色前仔细过滤苏木精染色液 或建议使用半氧化苏木精染色液 14 2 伊红着色 切片中央区域伊红染色不均匀 可能为弱碱性溶液残留导致伊红拒染所致 原因 伊红染液的pH值可能大于5 也可能是蓝化液残留过多 切片太薄 或切片经伊红染色后在乙醇脱水时间过长 对策 检查伊红染液的pH值 用乙酸将其调节在4 6 5 0之间 使伊红染色色彩艳丽 确保每次蓝化后 用自来水冲干净 检查切片的厚度 脱水时不要让切片在低浓度乙醇停留时间过长 因为含水多的低浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉 15 原因 伊红染色液浓度太高 切片在伊红染色时间过长 切片在伊红染色后经乙醇脱水步骤时过的太快 而使乙醇分化伊红的作用不能产生 对策 适当稀释伊红染色液 减少伊红染色时间 或者使切片在乙醇脱水等步骤时 停留时间相对均匀 同样 也要检查切片的厚度是否合适 伊红深染导致细胞核与细胞质没有层次 缺乏对比 16 在显微镜下呈现大量水珠或云雾状改变 原因 切片经梯度乙醇处理后没有完全脱水 导致二甲苯透明中性树胶封固后残留大量水分 也可能是封片的时候出现的气泡 对策 移去盖玻片 用二甲苯溶解封固剂如中性树胶 将切片置入新鲜的无水乙醇换几道 待切片重新脱水完全后 用新二甲苯透明 中性树胶封固 所有用于脱水和透明的液体 在使用一定时间以后 应即时更换 将切片浸如二甲苯中 重新封片 封片 17 盖玻片上有封固剂所致切片组织模糊不清 原因 盖玻片上可能有封固切片的封固剂 对策 移去盖玻片 重新用干净的盖玻片封片 18 封片后镜下则会出现类似色素的点状结晶或类似 裸核 样的改变 原因 切片封片前放置在空气中时间太长 以至于二甲苯挥发切片干燥所致 对策 移去组织切片上的盖玻片和封固剂 重新处理 将切片水洗数分钟 然后重新脱水 透明 封固 封片过程中要保持组织切片的轻度湿润 尽量不要让其干燥 19 原因 盖玻片弯曲或不平整 封固剂