葡萄糖异构酶.ppt

酷不酷 他说了算 1 小组成员 周杰张芬周伊玲陈艳梅 第七节葡萄糖异构酶 2 本节课的框架 3 一 葡萄糖异构酶的概念 也称木糖异构酶 或简称异构酶它可以催化D 木糖 D 葡萄糖 即将D 核糖等醛糖转化为相应的酮糖 由于葡萄糖异构化对果糖具有重要的经济意义 因此工业上习惯将D 木糖异构酶称为葡萄糖异构酶 二 葡萄糖异构酶的用途 异构酶的主要用途就是将葡萄糖异构化成高果糖浆 4 葡萄糖异构酶的优点 味道纯正 具有较强的保温性 着色性和防腐性 营养价值较高 可不经消化直接被肠胃吸收 果糖的代谢不受胰岛素调节 糖尿病人可以利用 系饮料 糕点等食品工业的理想用糖 在蜂蜜中含量最为丰富 它的甜度约为蔗糖的1 2 1 8倍 目前在全世界范围内 各国都大力发展果葡糖浆和结晶果糖的生产 5 淀粉的浆液经过 淀粉酶的催化作用 可以形成糊精 糊精经过糖化酶的催化作用形成葡萄糖 葡萄糖在葡萄糖异构酶的催化作用下 分子的结构发生变化 这叫做葡萄糖的异构化 葡萄糖经过异构化 就形成了果糖 如果把果葡糖浆中的果糖和葡萄糖分离开来 将分离出来的葡萄糖再次进行异构化 并且如此反复多次 最后的混合物中果糖的含量可以达到70 90 这样的混合物就叫做高果糖浆 果葡糖浆生产过程 回吧 6 二 酶的特性 葡萄糖异构酶的生物学性质葡萄糖异构酶能催化D2葡萄糖至D2果糖的异构化反应 它是工业上大规模从淀粉制备高果糖浆的关键酶 且该酶可将木聚糖异构化为木酮糖 再经微生物发酵生产乙醇 A 热稳定性 B 底物专一性 C 金属离子的影响 D 最适pH和温度 亲爱的 想我了吗 嘿嘿 7 四 国内外的研究情况 目前国内许多科研机构和企业正在进行葡萄糖异构酶研究和应用 在与基础理论研究中有关的基因改造 酶学性质 以及在遗传育种过程中突变型筛选 都需要一个准确 快速 具有较高重复性的测定葡萄糖异构酶活的方法 让俺好好看看 8 中国科学技术大学生命科学学院独家承担国家科委863 项目 葡萄糖异构酶的蛋白质工程 经十五年科技攻关目前已完成葡萄糖异构酶的蛋白质工程改造 获得性质改良的基因重组葡萄糖异构酶 并利用基因工程方法构建表达量极高的基因重组链霉菌工业生产菌株 目前已拥有两项国家专利 同时正在申报 表达突变体酶GIG138P的7号淀粉酶链霉菌基因工程菌株SM33XZ及其构建方法 的美国专利 已具备将基因重组葡萄糖异构酶产业化的成熟的科技条件 项目旨在建立完整的葡萄糖异构酶蛋白质工程研究系统 利用蛋白质工程技术对葡萄糖异构酶的某些性质缺陷进行改造 如提高酶热稳定性等 使其更好地应用于工业生产 项目涉及菌种筛选 基因克隆 基因表达 基因突变 酶动力学 分子设计 工程菌构建以及酶的固定化研究等诸多方面 9 我国对a 淀粉酶 葡萄糖淀汾酶和葡萄糖异构酶的研究取得了可喜的成就 但由于一些因素的影响 我国果葡糖浆的工业尚未形成一定规模 其主要问题是 1 果葡糖生产技术 尤其是酶制剂未完全过 2 原料价格过高影响生产成本 3 果葡糖浆价格高 在果葡糖生产的系列酶中 葡萄糖异构酶是关键 这不仅是因为葡萄糖异构酶的价格比淀粉贵几十倍 更重要的在于异构酶的性质和反应条件和淀粉酶不相适应 在调节PH和支队Ca 等离子过程中增加了工艺流程 从而提高了成本 影响酶的活力和产品的质量 为此 葡萄糖异构酶的蛋白质过程势在必行 而我们将葡萄糖异构酶经过改造后 在工艺上可望省略一次离子交换柱处理 酸咸调节等步骤 并可能在较高温度下 80 进行转化反应 从而大大加速反应速度 使重组葡萄糖异构酶生产的果糖浆产量高 质量好 味道鲜美 我国的果葡糖工业生产现状 回了 10 五 酶的筛选 酶的提取是指在一定条件下 用适当的溶剂处理细胞破碎后的含酶原料 使酶充分地溶解到提取液中的过程 酶的提取方法有盐溶液提取法 碱溶液提取法和有机溶剂提取法等 为了提高酶的提取率和防止酶提取后变性失活 提取过程中必须注意保持适宜的温度和pH 并且添加适量的保护剂 提取液中含有多种酶 要想从提取液中分离纯化出某一种酶 必须根据这种酶的特性 选择适合的分离纯化方法 11 葡萄糖异构酶主要是胞内酶 可以直接用其菌体 进行反应 提取胞内酶 首先要破碎细胞 破壁 膜 然后将含有酶活性的部分用过滤或离心法去除残留细胞和细胞碎片 从而得到澄清溶液 再采用逐步逐级分离和浓缩等步骤将所得的无细胞提取液纯化 常用破碎处理方法 机械破碎法 指利用捣碎机 研磨器或匀浆器等将细胞破碎开来 物理破碎法 指利用温度差 压力差或超声波等将细胞破碎开来 化学破碎法 指利用甲醛 丙酮等有机溶剂或表面活性剂作用于细胞膜 使细胞膜的结构遭到破坏或透性发生改变 酶学破碎法 指选用合适的酶 使细胞壁遭到破坏 进而在低渗溶液中将原生质体破碎开来 酶的提取 12 葡萄糖异构酶的分离纯化 分子筛 DEAE FF 离子交换层析的一种 离子交换树脂为纤维素类 透析 13 IEXC可在中性条件下 利用多肽的带电性不同分离纯化具有生物活性的多肽 其可分为阳离子柱与阴离子柱两大类 还有一些新型树脂 如大孔型树脂 均孔型树脂 离子交换纤维素 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶树脂等 在多肽类物质的分离分析研究中 对多肽的性质 洗脱剂 洗脱条件的研究较多 不同的多肽分离条件有所不同 特别是洗脱剂的离子强度 盐浓度等对纯化影响较大 Wu等报道利用离子交换柱层析法 探讨分离牛碳酸酐异构体和牛血清白蛋白 鸡血清白蛋白酶的提取条件 获得了有价值的数据供今后此类物质分离研究 离子交换层析 14 透析在纯化中极为常用 透析膜的截留分子量为5000左右 如分子量小于10000的酶液就有泄露的危险 在纯化中 可除去盐类 有机溶剂 低分子量的抑制剂等 超滤一般用于浓缩和脱色 不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别 用一些简便的方法 使蛋白质混合物得到初步分离 BACK 15 提取和分离纯化后的酶制成酶制剂 如将某种酶的酶液进行干燥处理后 加入适量的稳定剂和填充剂 就可以用来催化化学反应了 但是 这样的催化反应结束后 酶制剂和产物是混合在一起的 产物的纯度不高 并且酶制剂不能重复使用 为此 科学家设想将分离纯化后的固定到一定的载体上 使用时将被固定的酶投放到反应溶液中 催化反应结束后又能将被固定的酶回收 这样的酶叫做固定化酶 例如 将葡萄糖异构酶吸附到离子交换树脂上 或者包埋在明胶 制成的固定化葡萄糖异构酶 不仅可以用于使葡萄糖转化成甜度更高的高果糖浆 而且可以在生产中反复使用 目前 科学家已经研制出膜状 颗粒状等多种形态的固定化酶 六 酶的固定化 16 酶的固定化方法归纳起来有三种 载体结合法 交联法和包埋法 看懂了吗 17 载体结合法 指将酶固定到非水溶性载体上的方法 根据固定方式的不同 这种方法可以分为物理吸附法 离子结合法和共价结合法 物理吸附法是指将酶吸附到固体吸附剂表面的方法 固体吸附剂多为活性碳 多孔玻璃等 离子结合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法 载体有离子交换树脂等 共价结合法是指酶和载体以共价键的形式结合在一起的方法 这种方法需要酶和载体都具有氨基 羧基或羟基等官能团 18 交联法 指通过双功能试剂 将酶和酶联结成网状结构的方法 交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物 包埋法 指将酶包裹在多孔的载体中 如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中 或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中 前者包埋成格子型 后者包埋成微胶囊型 19 现在国内普遍采用的是钼铵酸显色和半胱氨酸 咔唑法 这些方法的优点是灵敏度高 现象直接 用肉眼可以粗略辨别酶活大小 但所用试剂多 易受环境温度的影响 特别是后者需在浓硫酸存在下显色 对实验者和一起易造成损伤 因此 有必要建立新的简便快速的检测酶活的手段 七 酶活力的测