化学遗传学方法.ppt

第三节化学遗传学方法 二十年前 编码蛋白的发现引起了细胞周期调节领域的一场革命 它们作为重要的信号传导组分的确认加速了在这个领域的研究 为进一步生物化学研究提供了必要的起点 在近些年 生物活性的小分子化合物已经在细胞生物学中起到类似的作用 化学生物学这一新领域把那些致力于了解和模拟自然世界的化学家和生物学家带到一起 1994 哈佛大学的TimMitchison 1 教授在首期的 Chemistv Bio1ogy 化学和生物学 上阐述了化学遗传学 chemicalgenetics 的基本概念 他指出要探索生命过程必须有干扰生命过程的手段 然后才能了解其后果 随后 哈佛大学stuartL Schreiber教授和TimMitchison教授开始利用小分子来系统地探索细胞和蛋白质的生理功能 1 化学遗传学采用小分子活性化合物作为探针 以多种方式影响靶蛋白的功能 探索和控制细胞过程 从另一方面来说 化学遗传学研究所获得的成果 小分子化合物及其生物学效应 除了被用来揭示生命的基本活动规律外 还可能成为候选药物 也就是说化学遗传学的研究活动不是单纯的基础研究 而与应用紧密相联 所以很多大型制药公司都非常关注化学遗传学 例如 哈佛大学在成立一个以从事化学遗传学为核心的 化学与细胞生物学研究所 时 著名的默克制药公司 Merck 就成为了该所的主要赞助者之一 可以说 化学遗传学的出现把传统的学术研究实验室引进了药物开发的战场 2 在 化学遗传学 出现的同时 又出现了 化学基因组学 的概念 两者的研究思路 内容基本相同 只不过化学基因组学在化学遗传学及化学蛋白质组学的基础上又向前一步 研究与人类疾病密切相关基因的生物功能 考虑到本书中很少涉及到基因组学内容 因此 主要介绍化学遗传学方法 化学遗传学与传统的遗传学在思路上有相通之处 它还可以分为正向化学遗传 forwardchemicalgenetics 和反向化学遗传 reversechemicalgenetics 前者用动物细胞 微生物以及它们的裂解产物来寻找对生物过程产生影响的小分子 并确定相应的蛋白靶 后者则是先高表达某种蛋白 寻找与蛋白结合或影响纯蛋白的功能的小分子 再对找到的小分子在体内进行对此蛋白的功能影响实验 3 一 化学遗传学的基本方法 根据人类基因组的草图 基因的表达产物 蛋白质的数量在100 000到数百万个 其中大部分属于目前还不清楚的未知蛋白质 而化学遗传学通过使用小分子作为探针研究细胞内或完整组织中蛋白质的功能 通过这些分子探针作用模型的生物化学解释 有助得到关于复杂细胞过程中蛋白质功能的新信息 化学遗传学的第一个关键环节是合成可供筛选的小分子库 第二个关键环节是发展准确 高速和低成本的化学库筛选方法 获得尽可能多的机理和特异性信息 第三个关键环节是确证筛选得到的化合物结构 并确认蛋白标靶以及优化化合物的蛋白亲和性 4 1 小分子化合物库的构建 高通量合成和制备 过去 生物活性小分子主要是从生物有机体中发现的 但是 很可能它被认定的活性是由于机体内许多化合物的协同作用造成的 而不仅仅取决于这一小分子 为了克服这一困难 需要构建包含大量具有确定结构的小分子化合物库 5 2 生物活性的检测 高通量筛选 在过去 从万个化合物中筛选具有生物活性的小分子化合物是比较烦琐和困难的 高通量筛选是指运用自动化的筛选系统在相对短时间内 通过特定的生物模型来对成千上万化合物进行活性筛选 现在人们可以尽可能采用自动的方式利用96 384或1536孔板进行生物活性分子的筛选 图a 在设计化学遗传学适合的筛选方法过程中 首先要确定是采用哪种化学遗传学方法 即正向还是反向化学遗传学方法 以便选择 纯蛋白 细胞 或 胚胎 检测方式 图b 筛选过程首先是确定生物活性靶点以及检测活性的方法 然后再设计相应的用于高通量筛选的平台 为了确保高通量筛选结果的有效性 所用的检测方法必须灵敏 而且重复性好 6 7 高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系 它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础 以微板形式作为实验工具载体 以自动化操作系统执行实验过程 以灵敏快速的检测仪器采集实验数据 以计算机对实验获得的数据进行分析处理 在同一时间内对数以千 万计的样品进行检测 并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转 分子水平和细胞水平的实验方法 或称筛选模型 是实现高通量药物筛选的技术基础 由于高通量药物筛选要求同时处理大量样品 实验体系必须微量化 这些微量化的实验方法有些是应用传统的实验方法加以改进建立的 更多的是根据新的科学研究成果建立的 高通量筛选技术 8 高通量药物筛选的检测系统快速 高灵敏度的检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一 在高通量药物筛选中 检测系统一般采用液闪计数器 化学发光检测计数器 宽谱带分光光度仪 荧光光度仪等 检测仪器灵敏度的不断提高 即使对微量样品的检测 也可以得到很好的检测效果 常用的高通量药物筛选模型可以根据其生物学特点分为以下几类 受体结合分析法 酶活性测定法 细胞因子测定法 细胞活性测定法 代谢物质测定法 基因产物测定法等等 9 1 酶标仪 酶标仪是一种用途广泛的生物检验医疗设备 利用酶联免疫分析法 根据酶标记原理 根据呈色物的有 无和呈色深浅进行定性或定量分析 这是一种极具生命力的免疫学技术 可用于单克隆抗体筛分 凝血分 抗生素灵敏度检验 以及其它需要进行比色的分析工作中 10 按照功能的划分 酶标仪可以分为光吸收酶标仪 荧光酶标仪 化学发光酶标仪和多功能的酶标仪 光吸收酶标仪是用来进行可见光与紫外光吸光度的检测 特定波长的光通过微孔板中的样品后 光能量被吸收 而被吸收的光能量与样品的浓度呈一定的比例关系 由此可以用来定性和定量的检测 光吸收的检测技术成熟 成本低 操作简单 但是动态范围窄 灵敏度比较低 特异性不强 一般可见光和紫外光分别采用钨灯及氘灯作为光源 而紫外 可见酶标仪是可以将两种光源进行切换 适应不同测量波长的需求 11 荧光酶标仪是用来进行荧光的检测 通过激发光栅分光后的特定波长的光照射到被荧光物质标定的样品上后 会发出波长更长的发射光 通过发射光栅后到达检测器 荧光的强度与样品的浓度呈一定的比例 荧光检测灵敏度高 可实时检测 使用方便 检测模式多样 但是容易受外界干扰 激发光与发射光容易互相影响 干扰检测 化学发光是来自生物化学反应中的自发光 可分为辉光型和闪光型两种类型 辉光型发光持久 稳定 能持续一段时间 闪光型发光时间短 变化快 稳定性不强 需要应用自动加样器才可以进行 化学发光中发出的光子数与样品量呈一定比例关系 化学发光酶标仪灵敏度非常高 动力学范围广 12 2 多功能酶标仪 多功能酶标仪又称多功能微孔板检测仪 可对以微孔板为体系的实验提供多种不同模式的检测 通常 多功能酶标仪至少可提供 吸收光 荧光 发光 三种不同的检测模式 一些中高端多功能酶标仪还可完成 时间分辨荧光 荧光偏振 荧光共振能量转移 等高级荧光检测实验 13 多功能酶标仪工作站Flexstation 3具有双光栅提供1nm步径全波长检测 可对6 384孔微孔板进行光吸收 紫外 可见 200 1000nm 荧光强度 250 850nm 化学发光 250 850nm 荧光偏振 400 750nm 和时间分辨荧光 250 850nm 五大功能的检测 14 3 高通量自动筛选系统 高通量药物筛选应用的实验方法总体积一般要求在2 250 l 自动化操作系统主要是指实验室自动化工作站 俗称药物筛选机器人 是由计算机控制的全自动实验室操作设备 试验室自动化工作站的基本功能是可以自动连续地完成试验的基本操作 如加样 即向每个反应单位 微板中的每一个孔 中加入各种不同成分 不同浓度 不同容积的溶液 稀释 实际上就是加入一定容积的样品或试剂溶液后 再加入一定的溶媒 转移 主要是完成某一试剂或样品的位置变化 混合 将加入的不同溶液进行混合 混合的方式有震荡 也可以用加样器反复吹吸混合 15 洗板 用适当的溶液清洗试验用的微板 或洗除不需要的反应液 温孵 让反应体系在一定的温度条件下保持一定的时间 使之完成反应过程 自动化工作站可以严格控制温孵的温度和时间 检测 试验室自动化工作站一般都可以与某一种或多种检测仪器连接 在试验操作完成后 可以自动进行必要的检测并自动采集储存数据 完成整个试验过程 16 目前 用于高通量药物筛选的仪器种类很多 其最大的特点是可以对各种不同规格微板中的样品直接进行测定 如同位素放射活性的测定 化学发光测定 生物发光测定 可见光比色 紫外光比色 荧光测定以及电化学测定等等 实验数据的分析处理系统是高通量筛选的必备条件 由于高通量药物筛选可以在短时间内产生大量数据 对这些数据的采集 储存 分析 处理 必须依靠计算机完成 一般条件下 目前高通量药物筛选使用的检测仪器 基本上都实现了数据采集的自动化 结果检测完毕 试验结果就自动储存在计算机中 17 一般来说 高通量筛选模型基本上可分为基于靶点的筛选模型 target basedassay 亦称体外生化筛选模型 细胞水平筛选模型 cellbasedassay 和胚胎水平的筛选模型 embryo basedassay 三类 由于标记技术的发展 如显色反应 荧光 化学发光以及同位素标记等 对于细胞水平和胚胎水平的筛选模型也可以通过直接观测表型来分析功能分子对生物过程的影响 18 1 体外生化筛选模型 体外生化筛选模型主要是用来研究与生物体内重要生理过程相关的酶与底物 受体与拮抗剂或激动剂 蛋白质与蛋白质之间的相互作用 见第二节相互作用与分子识别 可以在体外通过蛋白结合能力或酶催化活性检测的方式完成 主要采用光学如发光 光吸收或荧光测定的方法 这些靶点往往和某个疾病过程相关 这是HTS中使用最多的模型 根据生物分子的类型 分子水平的药物筛选模型主要分为受体 酶 通道 基因和其他类型的模型 其特点是药物作用靶标明确 应用这些模型可以直接得到药物作用机理的信息 19 2 细胞水平筛选模型 细胞水平筛选模型主要用于研究涉及信号传导和转录调节过程中的相关靶点 由于该筛选体系与生物活性体系比较接近 因此被广泛用于生物学和药物研究中 细胞水平的筛选也可以根据研究方向的不同选择微生物或哺乳动物细胞 两者各有利弊 微生物系统 如酿酒酵母和大肠杆菌 具有廉价快速的特点 但是细胞的通透性不好 很多微生物还具有能将化合物有效泵出的系统 筛选时化合物往往难以接近靶点 从而造成假阴性 错过一些本来具有不错活性的小分子 哺乳动物细胞通道性好 更接近真实的活体环境 但是价格相对昂贵 也比不上微生物系统的快速 细胞水平的筛选主要有细胞表型筛选 报告基因检测 细胞印记以及细胞增殖测定 细胞基础的生理测定和黑色素色素 易位测定等 20 细胞表型筛选 具有一定遗传型的生物个体 在特定的外界环境中 通过生长和发育所表现出的种种形态和生理特征的总和 是生物体的可见特征或特性 即为其表型 phenotype 相同遗传型的生物 在不同的外界条件下 会呈现不同的表型 但这不是真正的变异 因为在这种个体中 其遗传物质结构并未发生变化 显微镜检测技术可以检测细胞表型的变化 例如细胞形变 增生 凋亡以及纺锤体形态 该模型是观察被筛样品对细胞的作用 但不能反映药物作用的具体途径和靶标 只能反映出药物对细胞生长等过程的综合作用 着眼于细胞整体的某些功能 所以这种检测方法主要适合于初步筛选 21 细胞外形上的变化 22 inhibitorsofSARS冠状病毒 CoV 23 细胞表型筛选需要通过各种显微镜观察细胞整体形态变化 细胞器以及细胞骨架的形态变化 这就需要用荧光染料分子对细胞和细胞内部的组分进行标记 小分子荧光探针已经称为化学生物学研究的不可缺少的工具 如作为生物大分子的标记物 酶的底物 环境指示剂以及细胞成像剂等 小分子荧光探针一般由两部分组成 荧光团以及与生物大分子 受体 专一性高亲和力结合的配体 通过受体与配体的相互作用来标记蛋白质 小分子荧光探针应该可以穿过细胞膜并且无毒 能够与受体专一性稳定结合 使得其在进行监测的较长时间 几个小时 内保持稳定性 背景噪音水平尽可能的低 探针尽可能地设计成一定的模式 使得多种荧光团能够方便地结合 选择合适的受体可以实现对蛋白质位点专一性结合 24 作为荧光标记的试剂 分子中含有比较活泼的官能团 这些基团易与蛋白质分子中的NH2 OH SH等共价结合 形成比较稳定的结合物 活性基团主要包括以下基团 25 对于受体的选择有以下两个要求 1 受体与目标蛋白质融合后必须能够被基因表达 2 受体应该尽可能小 以致不干扰目标蛋白质的正常生理功能 因此较理想的受体是一段短序列的肽链并且能够插入目标蛋白质的许多位点 一般说来 受体与配体的结合应当尽可能地快 有利于监测时间敏感性的生理过程 受体 配体的作用一般包括半抗原 抗体 生物素 抗生物素蛋白 酶 底物 酶 抑制剂 蛋白质专一性结合试剂等 26 为了能够在荧光显微镜下观察细胞内部的形态结构 人们利用一些与细胞内生物大分子专一性相互作用的小分子化合物与不同类型的荧光染料偶联 设计合成了一系列细胞探针 如核酸 或细胞核 探针 溴乙啶 吖啶橙 Hoechst33258 DAPI等 细胞骨架探针 紫三醇荧光探针 毒伞素荧光探针等 细胞器探针 细胞器标记酶底物探针 细胞膜探针 磷脂 鞘磷脂 胆固醇荧光探针 以及某些特殊部位的蛋白质 与抗体偶联或与专一性结合试剂偶联 探针 荧光染料的种类很多 如荧光素类 罗丹明类 香豆素类 二氟化硼 二吡咯甲烷 BODIPY 类及乙锭类化合物 27 28 不同类型的荧光探针具有不同的激发波长和发射波长 从而在荧光显微镜下呈现出不同颜色的图像 可以容易地区分细胞的各个不同部位的形态变化 29 30 31 32 33 34 35 36 37 报告基因 reportergene 由于转录因子和基因表达相关因子是药物作用的重要靶标 从而出现了报告基因法 如果把靶基因表达的调控序列与编码某种酶活性的基因相连 转入细胞内 通过简单地检测酶活性的变化 就可以反映化合物对转录因子和基因表达的作用性质和程度 一般把这种能间接反映基因转录水平的编码某种酶的基因称为基因报告法 在应用时 首先确定构建模型所需的调控序列 然后根据具体情况选择载体 应用最普遍的有荧光素酶基因 半乳糖苷酶基因 Cal 和氯霉素已酰转移酶基因 CAT 38 报告基因方法 39 目前活体细胞应用较多的报告基因是绿色荧光蛋白 GFP 因其适于活体细胞检测 被称为生物传感蛋白 它的优点是具有自发荧光 不需其他的底物和辅因子且荧光稳定 另外GFP与其他蛋白嵌合后不影响其自身荧光特性 GFP及其变体作为报告基因适用于实时动态研究体内或细胞水平的蛋白定位和转位 蛋白的降解 蛋白 蛋白的相互作用 细胞骨架动力学 细胞周期 并可检测目的基因表达变化 这类报告基因的表达可以在多种组织和细胞中 采用不同光学检测方法通过对探针或化学发光底物的光学信号的检测 来进行靶标功能的研究 40 细胞印迹 Cytoblot 即高通量整体细胞免疫检测 high throughputwhole cellimmunodetectionassay技术 38 是在酶偶联免疫吸附测定 ELISA 和免疫印迹 westernblotting 的基础上发展起来的 该方法用于快速检测小分子对DNA合成 蛋白质翻译后加工 乙酰化 磷酸化等 及细胞周期等的影响 其基本原理与免疫印迹十分类似 但是检测某一类细胞中的分子是在多孔培养板上的整体细胞水平进行的 41 首先以待检测的分子作为抗原制备抗体 即一抗 然后选择合适的二抗进行检测 如采用连接有辣根过氧化物酶的二抗与一抗偶联 形成的复合物通过加入氨基苯二酰一肼 luminol 过氧化氢和对碘苯酚进行检测 若细胞中有待检测的分子 即抗原存在 则引发的化学发光反应使底片感光 如果不存在 则无发光反应 其最大的优点是能够进行活性小分子的高通量快速筛选 可以采用组织特异的细胞在纳升到毫升的规模培养 但该方法一般适合于初筛 要进一步明确所得小分子的活性还需结合其他筛选方法 42 43 3 胚胎水平筛选模型 这类筛选比细胞水平的筛选更接近活体环境 可以看做是对药物研发过程中动物试验的改进 比较常用的是斑马鱼胚胎 zebrafishembryo 和果蝇胚胎 fruitflyembryo 等 由于传统的动物试验所使用的动物体积相对较大 繁殖期也较长 难以实现高通量筛选的要求 44 45 斑马鱼 斑马鱼 zebrafish 是一种热带硬骨鱼 体积小 3 4cm 可在较小的空间大量繁殖 产卵量高 每周产卵可达200多个 发育快 许多组织在受精后24小时开始形成 成熟周期短 3 4个月 体外受精且胚胎透明 发育过程可在体视解剖镜下观察 斑马鱼的这些特点使它适宜于作大规模的突变筛选 是研究基因功能和脊椎动物发育机制的重要手段 46 斑马鱼与人类基因在引起相关疾病时的表型极为相似 可将斑马鱼作为研究人类疾病的重要模式生物体 所以 斑马鱼常常用于进行造血系统病理和生理功能的研究 47 48 49 50 51 52 线虫 为假体腔动物 有超过28 000个已被记录的物种 尚有大量种尚未命名 绝大多数体小呈圆柱形 又称圆虫 roundworms 它们在淡水 海水 陆地上随处可见 不论是个体数或物种数都往往超越其他动物 并在极端的环境如南极和海沟都可发现 线虫属两侧对称 体长 通常两端尖 并具透明隔腔 消化道与体壁间充满液体的体腔 一般为雌雄异体 有些则为雌雄同体 即个体兼具雌雄生殖器官 53 54 甘油醛 3 磷酸脱氢酶 55 酵母 酵母是一种以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核微生物 在我国已有4000多年的应用历史 早期对酵母的利用主要体现在酿造 食品和医药生产等领域 利用酵母生产的核苷酸 核黄素 细胞色素 维生素D2以及辅酶A等药物曾为人类健康事业的发展做出过巨大的贡献 作为一种单细胞真核生物 酵母繁殖速度快 培养周期短 基因操作相对简单以及研究费用相对低廉 使得其成为现代生物医学研究中的一种模式生物 酿酒酵母S1cerevisiae作为第一个完成全基因组序列分析的真核生物 更是在生物医药研究领域中得到了广泛的应用 56 57 58 59 高内涵筛选 虽然目前已经形成了可日筛选10万样次的超高通量筛选技术 但是 高通量药物筛选技术的单靶点单指标的筛选方法 已经不能适应药物发现的需要 而且也不利于对化合物活性的综合评价 在此情况下 以多指标多靶点共同作用为主要特点的高内涵药物筛选技术应运而生 60 高内涵药物筛选模型主要建立在细胞水平或胚胎水平 通过观察样品对固定或动态细胞的形态 生长 分化 迁移 凋亡 代谢及信号转导等多个功能的作用 涉及的靶点包括细胞的膜受体 胞内成分 细胞器等 从多个角度分析样品的作用 最终确定样品的活性和可能的毒性 从筛选载体上看 高内涵药物筛选与高通量药物筛选并没有显著的区别 也在微孔板上进行 目前使用较多的仍然是96孔微板 高内涵药物筛选的检测体积并未因检测指标增加而增高 操作步骤同样简单可行 自动化 61 3 靶点的鉴别和确认 在第二节中我们论述了许多生物活性检测技术用来确认和表征小分子与蛋白质之间的相互作用 但是 在正向化学遗传学中 小分子化合物库通过细胞表型变化方式筛选 当一种化合物被鉴定出后 就需要确定该化合物作用于哪种蛋白质靶点 这时要涉及到多种不同的检测方法 当然 靶点可能不是蛋白质 也许是细胞膜或核酸 而在反向化学遗传学中 蛋白质已经事先选定 需要通过与蛋白质的结合能力筛选对与其结合的小分子配体进行检测 采用靶点鉴别的方法 初筛出与小分子化合物结合的蛋白质 如亲和层析 噬菌体展示 mRNA展示克隆 酵母三杂交 生化抑制等 然后再通过其他生物技术进一步确认 生物质谱 免疫化学检测 功能展示克隆等 这里介绍几种靶点鉴定的方法 62 1 小分子微阵列检测 借鉴DNA芯片技术 人们发展了一种称为小分子印迹 smallmoleculeprinting 的技术 后来改称为小分子微阵列检测技术 smallmoleculemicroarrays SMM 来筛选靶蛋白的小分子配体 小分子微阵列是一种新的高通量鉴定蛋白质结合的小分子配体的方法 有时又称为化学芯片 小分子微阵列是一种具有1000 100000个探针部位对称排列整体的平面 每个探针部位可以含有通过共价或非专一性吸附固定化的小分子化合物 如多肽 糖 类药物分子 天然产物等 63 首先 将应用组合化学合成的小分子分别溶解在适当溶剂中 采用高精度的机器人将1nl含有每一种小分子的样品溶液精确定位点样于一块经过处理的载片上 所有的化合物都含有共同的连接反应官能团 可以通过共价键的形式将小分子固定在载玻片上 从而形成高密度的小分子阵列 1000个点 cm2 用荧光标记的蛋白质探出需要的小分子配体 在载玻片洗涤除去非专一性吸附的蛋白质后 可以通过扫描荧光斑点证实哪个小分子与蛋白质发生了较强的相互作用 在此基础上 这些小分子可以依次被多种标记的靶蛋白分别进行筛选 该方法选择性好 灵敏度高 64 在小分子芯片 SMM 制备过程中 小分子的固定是极其关键的步骤 因为它决定了小分子以哪种方式与靶蛋白相互作用 也决定了在合成期间应该引入哪些化学基团以便得到均匀固定化的小分子 目前 有多种方法用于构建小分子芯片 如共价固定 光活化交联和原位合成 65 66 共价固定 Puskas和他的同事们用丙烯酰化的和环氧化反应建立了六种可以共价固定化核酸 蛋白质和小分子的玻璃表面 他们使用树枝状化合物和三氨基连接体系增加了固定化的效率 这种方法可进一步应用于表面疏水性和亲水性的修饰 从而可以产生各种变化的表面有利于小分子芯片 SMM 的应用 Waldmann等使用温和的条件建立了一种在芯片上具有化学选择性的连接方法 该方法由有机磷衍生的玻璃和带有叠氮化的分子构成 67 光活化交联 Mrksich等利用光活化后引发的D A反应制备小分子芯片 首先他们将2 硝基 3 4 二甲氧基苯甲氧酰 NVOC 保护的氢醌固定在金包衣的玻璃表面 经过紫外照射 氢醌被活化 然后经化学的或电化学氧化形成对苯醌 再与环戊烯标记的配体反应 68 原位合成 这是一种不经过小分子的固定化步骤 而是直接在芯片的玻璃上连续合成形成小分子的方法 如Kodadek等使用MeNPOC 保护的羟基乙酸和光活化偶联等步骤制备的小分子芯片 69 2 亲合层析技术 亲合层析技术是将小分子通过一个臂连接到固相介质 然后将蛋白质萃取液通过亲合层析柱 在某些情况下 靶蛋白被吸附在柱上 靶蛋白被洗脱下后 可以通过质谱技术进行微量的顺序分析并根据遗传密码和遗传信息转译成基因顺序 这些方法要求蛋白质与小分子配体之间必须具有较强的亲和力 否则会存在问题而不可靠 70 将小分子配体 L 通过一个连接臂固定到固体载体上 然后与含有目标靶蛋白 T 的蛋白质萃取液培育一定时间 通过一系列的洗脱步骤除去未结合的蛋白后 改变体系缓冲液的条件 如离子强度 pH等 将所有结合在亲和层析载体上的蛋白质洗脱下来 再用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳研究这些蛋白质的性质 为了减少非专一性结合蛋白的数量 可以采用固定一个没有活性的小分子配体类似物 A 同时进行亲和层析实验 电泳后进行比较 同时采用在蛋白质洗脱液中加入过量的游离配体方法 使目标靶蛋白先于有游离配体结合 而非专一性蛋白与固定化配体结合 洗脱后经电泳实验可以进一步排除非专一性蛋白 也可以采用系列层析技术 即在经过一次亲和层析后 再将其洗脱液与新的固定化配体培育 进行第二次亲和层析 洗脱后 经过电泳实验 并与第一次洗脱液的电泳图谱比较 最后确定小分子配体结合的蛋白质 图中箭头所指电泳条带 71 72 73 3 噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置 在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下 使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达 融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面 展示在的噬菌体表面的多肽或蛋白与固定化的小分子配体经过一定时间孵育后 洗去未结合的游离噬菌体 然后以竞争受体或酸洗脱下与小分子配体结合吸附的噬菌体 洗脱的噬菌体感染微生物宿主细胞后经繁殖扩增 进行下一轮洗脱 经过3轮 5轮的 吸附 洗脱 扩增 后 与小分子配体特异结合的噬菌体得到高度富集 然后将该噬菌体表面展示的多肽或蛋白质进行鉴定 确定靶蛋白 74 噬菌体展示技术示意图 75 4 酵母三杂交系统 酵母三杂交系统 three hybridsystem 是近几年在酵母双杂交技术的基础上发展的由活性小分子鉴定靶蛋白的方法 其基本原理与酵母双杂交类似 只是在 钩 与 鱼 之间加了 饵 构成三杂交中的3个组分 其中的 饵 是一种修饰过的活性小分子 是由活性小分子和配体A连接而成 钩 是由配体A的受体蛋白与DB融合而成 鱼 是由cDNA库中的蛋白融合在AD上构成 当待筛选靶组织的cDNA库中的某一蛋白与小分子相互作用时报告基因的转录被启动 这时细胞可通过报告基因检测 76 77 三杂交系统 78 79 4 化学遗传学的特点 化学遗传学看起来与传统的遗传方法类似 化学遗传学继承了传统遗传学方法高度特异性和方便实用性的优点 但是化学遗传学与传统遗传学方法相比 有其独特的优越性 就像在遗传审查中关键突变体的分离一样导致突变基因的鉴定 小分子作用模式的解释能产生感兴趣细胞靶部位的鉴定 因此 化学遗传学方法具有以下特点 80 即时性 化学遗传学可进行实时研究 采用传统遗传学的方法 无论是基因突变还是反义RNA或是RNAi等方法 调节蛋白水平都需要一段时间来完成 这对于研究细胞内的动态过程显然不适宜 而用小分子化合物调节细胞内蛋白质的功能时 小分子则是直接对蛋白发生作用 因此具有高实时性 可以在加入小分子之后的几分钟到几个小时之内立刻观测到蛋白功能的变化 这不仅方便了研究 而且也大大加速了研究进程 81 可逆性 与传统的遗传方法 基因突变 相比 由于化学遗传学所使用的小分子化合物与体内生物大分子的作用常常是可逆的非共价相互作用 它只是暂时地抑制或激活了某种蛋白质的生物活性 使细胞的整体功能发生了改变 在一定时间后 这些小分子化合物会被细胞内的酶催化代谢分解掉 因此 它们对细胞的生物学影响是可逆的 小分子的作用就像是开关一样 当加入的小分子被代谢清除之后 蛋白的功能又可以恢复到正常状态 而在遗传学方法中 基因敲除和过度表达通常是不可逆的 具有永久性 82 可调性 化学遗传学是通过调节加入的小分子的浓度来逐级地观测小分子对特定蛋白功能影响 可以通过改变小分子浓度来影响它的作用效果 而遗传学方法将基因直接敲除 因此该基因表达的蛋白的功能是完全丧失的 比如 AnthoyC Bishop等人通过在5 50000nmol L范围内逐步改变抑制剂浓度来研究其对激酶Cdc28功能的影响 83 可操作性 用化学遗传学方法进行研究时 就可以在细胞 胚胎等有机体发展到一个合适的阶段时 再加入小分子 从而来观察和研究它对生物学功能的影响 而有些对生命体很重要的蛋白 敲除其基因往往是致命的 甚至在还没有观察到感兴趣的表型之前 研究对象就已经死亡 以致无法进行下一步工作 另外 在化学遗传学中 一个小分子化合物可用于研究一系列不同有机体中的同一个过程 比如 布雷菲尔德菌素 brefeldin 可用于研究酵母 植物甚至哺乳动物细胞中从内质网到高尔基体的运输过程 如用传统遗传学的方法 其工作量就相当的大 一旦改变所要求的实验对象 就要重新筛选新的遗传突变体 84 虽然化学遗传学 化学基因组学有诸多优点 但是认为化学遗传学可以替代遗传学的观点却是错误的 事实上 遗传学的某些特点是化学遗传学所没有的 最典型的就是遗传学的特异性 蛋白质和基因是一一对应的关系 理论上 任何蛋白都能找到和它相对应的基因 可以通过对这段基因的操作实现对蛋白功能的探索 通过基因的修饰 人们可以利用遗传学的方法来有针对性地研究某一个蛋白的功能 这是遗传学的特异性 而化学基因组学中所研究的小分子则不一定都能做到与靶蛋白特异性结合 目前 化学遗传学方法的主要缺点是不能象遗传学那样直接应用 例如 采用小分子化合物诱导细胞产生的新的细胞表型 无法通过遗传的方法扩大生产以便继续研究细胞内的生物过程 另外 由于生物体内许多蛋白质的含量相当低 对某些未知蛋白质来说 即使可以通过一些方法鉴定出它的基本性质 但是如果不能通过基因重组的方法得到足够量的样品 继续深入的研究将是十分困难的 85 二 正向化学遗传学 传统的正向遗传学 forwardgenetics 是从细胞特定的形态 表型 phenotype 出发 最终达到分离相关基因或基因群的目的 例如 科学家们通过对果蝇的卵进行放射处理来诱导随机性的基因突变 如果科学家们对果蝇的翅膀发育有兴趣 他们将从经过放射处理的卵所孵化的果蝇当中选择那些翅膀有缺陷的个体 如翅膀较小的个体 并对果蝇的基因组进行扫描 找出发生变异的基因 一旦某个基因被确定并分离出来 将会开展一些能够表明这一基因对翅膀的正常发育有重要影响的试验 86 正向遗传学方法 它的研究过程通常分三步来实现 首先 促使细胞和机体组织随机突变 比如通过x射线照射的方式 然后 选择具有特定表型的细胞或机体来进行进一步研究 最后 确定引起特定突变的基因 87 88 正向化学遗传学的目标是找到对生物活性小分子敏感的蛋白 其基本思路是 先用一系列的小分子来处理所要研究的细胞或有机体 然后鉴定出所需要的表型 最后找出生物活性小分子所作用的靶蛋白 正向化学遗传学 89 正向化学遗传法自身具有较高的发现能力 因为它不需要预先知道太详细的生物机理 就可以找到能与小分子作用的包含在某一特定过程中的已知蛋白 还可以找到在该过程中未知的蛋白 正向化学遗传学同时还提供了可以干扰靶蛋白的新的工具分子 它面临的挑战是能否找到高效准确地确定新表型的方法 90 1 正向化学遗传学实例 myoseverin的发现 1 2 6 9 三取代的嘌呤库的构建碱基是核苷酸的基本结构单位之一 已有许多经结构修饰的碱基成为药物 并在抗菌及抗肿瘤中起着重要作用 Chang和Schultz等人以几种细胞周期依赖性激酶 CDKs 和其天然的抑制剂Olimoucine为基础 选择嘌呤环作为多样性合成的骨架 将固载化的胺与2 氟 6 氯嘌呤反应得到与树脂相连的嘌呤 然后引入另外两个取代基 该方法能够在3个位置上引入不同的取代基 构成了2 6 9 三取代的嘌呤库 91 92 2 高通量筛选 细胞周期的正常运行决定着细胞的增殖 分化和凋亡 受周期蛋白 cyclin 周期蛋白依赖性激酶 cyclidepedentkinase CDK 和周期蛋白依赖激酶抑制剂 CDKinhibitor CKI 在多个层次上共同调节 2 6 9 三取代的嘌呤化合物可以作为周期蛋白依赖性激酶CDK1和CDK2抑制剂而用于抗肿瘤研究 但是对于已经分化的神经原细胞和肌肉细胞来说 细胞很少再分裂增殖 因此 细胞一旦受伤 细胞生长受到阻碍 恢复起来很难 因此 人们希望找到一种化合物来引起肌肉细胞分化 达到再生目的 93 骨骼肌细胞细胞分化的特点是一个单核成肌细胞融合成多核的肌管的过程 为了形成肌管 成肌细胞必须停止分裂 在这个过程中 细胞表达肌细胞专一性转录因子 如MyoD Myf5 MEF2 肌浆蛋白以及细胞周期调节蛋白 如周期蛋白A cyclinA 等 这些变化导致特征性标志物表达 如骨骼肌肌球蛋白重链 SMMHC 和乙酰胆碱受体 在两栖动物的肢再生期间 多核的肌管解体成能够生长并裂变裂成单细胞的单核碎片 这就说明在某些脊椎动物肌肉可以通过肌管解体再生 为了探索在哺乳动物细胞这种肌肉再生的可能性 将2 6 9 三取代的嘌呤库用于体外筛选可以使分化的鼠肌细胞 C2C12 肌管裂变的小分子化合物 94 Rosania等人将几百个2 6 9 三取代嘌呤类化合物库加入到生长多天的肌细胞 C2C12 96孔培养板上 采用MTT方法和荧光标记进行细胞表型筛选 找到了一种能够诱导多核的肌管可逆地裂变成为单核碎片的化合物 命名为myoseverin 95 从图中可以看出在myoseverin处理之前 细胞连接成一个整体 图C 但是在肌细胞培养液中加入20 mol LMyoseverin处理24h后 可以明显看到细胞相互分离 图D 而多核的肌管可逆地分裂成为单核碎片 图B 如将化合物除去 将细胞转移至新鲜的培养介质中后 肌管分裂促进了DNA合成和细胞增殖 转录过程和生物化学实验表明单独的myoseverin并不能逆转生物化学分化过程 Myoseverin还可影响一些生长因子 免疫调节因子的表达 事实上 myoseverin被注入组织后 一部分肌细胞就可期望再度生长并增殖 因而产生新的肌肉组织 96 3 检查化合物相连的目标蛋白质 肌细胞的表型筛选表明了myoseverin可以使肌管裂变 但是myoseverin是与哪种细胞生物活动过程中的目标蛋白质发生作用呢 根据肌管的细胞结构 预计肌管的裂变过程与细胞结构的骨架蛋白质有关 所以使用带有荧光标记的抗微管抗体 绿色 观察细胞形态的图像 用Hoescht33258对细胞核内的DNA进行染色 蓝色 从而可以清楚地看到药物处理前后细胞形态的变化 97 可以看出在被myoseverin处理之前 细胞与微管紧密相连 但是以myoseverin处理过的细胞表现出破裂的微管 由于微管蛋白结构比较复杂 所以 还不清楚myoseverin直接在微管蛋白还是其它微管结合蛋白 MAP 上发生作用 为了检验这一点 从细胞骨架中提取了纯净的微管蛋白 它可以在特种溶剂中组装制造微管 因此 当myoseverin加入时 管形结构明显消失 所以 这证实了myoseverin直接在微管蛋白或微管上发生作用 98 为了寻找具有生物活性分子与之相互作用的靶蛋白质 首先将myoseverin上N 9位的异丙基更换成一个末端含有一个氨基的6个碳链的长臂 然后与溴乙酰化的赖氨酸连接 而赖氨酸的 氨基被生物素化 构成了一个亲和标记试剂 图1 当该试剂中的myoseverin部分与目标蛋白专一性结合后 溴乙酰基部分可以与蛋白质中的活性基团形成共价键 标记后 细胞萃取液用链亲和素包衣的磁珠处理 由于生物素与链亲和素的专一性作用 从而将目标蛋白质提取出来 99 2 正向化学遗传学实例 monastrol的发现 1 1 4 二氢吡啶化合物库的构建在1893年 Biginelli报道了一种多功能二氢嘧啶合成反应 该反应采用醛 酮酯和脲作为反应物 在强酸条件下的质子溶剂中多组分缩合生成在杂环的5 位含有酯基的二氢嘧啶酮衍生物 该反应已经广泛地应用于杂环化合物的合成中 其中的二氢嘧啶骨架由于具有药用性能被称为 Biginelli化合物 包括抗病毒 抗肿瘤 抗菌及抗炎活性 当用取代的硫脲替代脲 并用固相合成方法 即可构建一类新的二氢嘧啶化合物库 100 2 高通量筛选 由于核仁素 nucleolin 在细胞进入有丝分裂初期将被磷酸化 如果有丝分裂过程被抑制 就会使细胞停滞在有丝分裂初期 磷酸化的核仁素 phosphonucleolin 将在细胞中富积 以此为标志 ThomasU Mayer等采用细胞印迹技术 从16320个1 4 二氢嘧啶化合物中筛选出139种可穿透细胞以及对哺乳动物细胞的有丝分裂有抑制作用的化合物 101 接着 他们用体外筛选的方法排除了其中53个与微管蛋白有作用的化合物 因为已知的抑制微管蛋白的化合物较多 没有太高的研究价值 余下的86种化合物再次加入到哺乳动物细胞中 将细胞染色后 在显微镜下观察微管 绿色 和染色质 蓝色 的分布变化 得到5种针对有丝分裂的专一性抑制剂 102 在Monastrol存在下 能够使染色体只和纺锤体的一极相连 中心粒复制但不能分离 形成Monoastral纺锤体 如将药物加至体外无细胞体系 纺锤体两极会向对方移动直至融合在一起 103 3 靶点鉴定 由图可知monastrol的作用与纺锤体的组装有关 纺锤体又称有丝分裂器 mitoticapparatus 它是在有丝分裂期间 从中心粒形成的各种微管 包括动粒粒微管 极微管 星体微管等 它们的功能是将遗传物质均等分配到两个子细胞 在动粒中 ATP分子水解可以提供能量 驱动微管上的动力蛋白马达分子向两极移动 结果是将染色体拉向两极形成纺锤体 那么monastrol究竟作用于其中的哪种蛋白呢 Klein等检测了有无微管存在下的ATP酶活性 发现monastrol及其类似物可以抑制ATP酶活性 表明 其作用可能与有丝分裂中的驱动蛋白质有关 为了寻找与monastrol结合的目标蛋白 他们用NHS 活化的Sepharose4FastFlow设计合成了纯化蛋白质的亲和层析介质 104 利用亲和层析树脂和未衍生化的树脂对细胞提取液进行分离 经过电泳分析 再通过专一性的抗Eg5等抗体对电泳分离出的蛋白进行免疫化学检测和MALDI TOF TOF质谱分析 确定该蛋白为有丝分裂驱动蛋白Eg5 说明Eg5不仅与中心粒分离 而且与维持微管在纺锤体中区的交联都有密切关系 105 monastrol与人驱动蛋白KSP的动力结构域结合的晶体结构 106 3 正向化学遗传学实例 黑素细胞的调节剂melanogenin 哺乳动物毛皮的颜色主要是由皮肤与毛发中的真黑色素 褐与黑 与伪黑色素 红与黄 的相对数量与分布情况所决定的 哺乳动物的黑色素合成有一个复杂的调控系统 在黑素细胞的每一个发育水平都有几个不同的基因来调控 反之 同一个基因的产物在不同的发育阶段可能起不同的作用 有研究证实 黑素生物合成受两个基因家族的调控 酪氨酸酶基因家族 Pmel17基因家族 目前有较多的Pmel17基因家族基因与黑素瘤的报道 而对黑素合成的调节还不十分清楚 认为可能与酪氨酸酶基因家族有关 107 由于黑色素的形成主要发生在黑色素细胞内 对黑色素细胞内的黑色素形成机理的研究表明 黑色素的形成主要是由黑色素细胞内的四种酶 酪氨酸酶 多巴异构酶 TRP 2 过氧化物酶 5 6 二羟基吲哚 2 羧酸即DHICA氧化酶 TRP 1 等酶单独或协同作用的结果 根据黑素细胞发育 黑素体迁移 信号蛋白及转录因子以及黑色素合成所涉及到的蛋白 目前 黑色素生物合成的化学调控主要集中在以下几个方面 以达到刺激黑色素合成或抑制黑色素合成以及色素沉积的目的 108 109 110 111 112 靶点验证 Prohibitin phb 基因是一种有效的肿瘤抑制基因 广泛分布于不同种属的各种生物细胞中 它所编码的产物Prohibitin PHB 蛋白结构保守 既存在于线粒体内膜上 发挥分子伴侣作用 也存在于细胞核内 具有负性转录调控作用 因而对细胞代谢 生长 分化 衰老以及凋亡等诸多方面发挥着重要的调控作用 可能与某些肿瘤和退行性疾病的发生有关 113 黑色素生物合成过程的活性调控 动物身体及组织器官内累积的天然有色颗粒 例如昆虫 鱼类 鸟类及兽类等 有着各式各样的颜色 包括保护色和警戒色 这都是由于这类色素本身的化学作用 以及皮肤和外部的羽 毛 鳞等对光的反射及干扰等物理作用形成的 114 为什么有的动物具有如此有趣的保护色 为什么有的动物还会变幻颜色 它的秘密在哪里 在动物皮毛的皮质层锭状细胞壁上 有天然的色素 它们是棕色和黑色两种色素 色素存在的状态不一样 颗粒状的颜色深 扩散状的颜色浅 根据色素的不同状态 棕色色素就能使皮毛显现出黄 棕 棕黄等颜色 而黑色素就能使皮毛显现出黑色和灰色 如果两种色素都存在 要看哪一种发达 棕色素发达皮毛是棕色 黑色素发达皮毛是土黄色 两种色素都没有 皮毛是白色 115 皮肤的构造 116 117 118 酪氨酸酶抑制剂 119 天然植物提取液 银杏提取液 内含白果酸 白果酚丁酸 辛酸等 用于化妆品有在增白养颜 抗衰老等效果 甘草提取液 内含多种黄酮类化合物 它能抑制酪氨酸酶的活性 是一种快速 高效的美白化妆品添加剂 绿茶提取液 含有茶多酚类化合物 并具有保湿 抗炎 洗涤 护发 减肥等药理作用 当归 川芎 沙渗 柴胡 防风提取液等 120 调控小鼠毛颜色 121 三 反向化学遗传学 化学遗传学也可以利用已知的靶蛋白来寻找与其相互作用的小分子 这一过程与传统遗传学中的反向筛选法相类似 所以又被为反向化学遗传学或反向化学基因组学 反向遗传学是从分析某一个特定的基因出发 以发现该基因在产生突变后所引起的形态学的变化为目的 122 这个过程通常分三步来实现 第一 选择一个感兴趣的基因 第二 培养该基因变异的细胞或生物体 通常可以通过基因敲除 knock out 或者过度表达 overexpression 的方法来实现 第三 比较变异细胞或生物体的表型与野生型的细胞或生物体在表型上的差异 从而确定该基因在细胞或生物体内的功能 123 反向化学遗传学筛选的第一步就是确定一个感兴趣的蛋白作为靶蛋白 然后根据该蛋白结构合成一个化合物库 库中的分子在结构 电性和疏水性等方面要与靶蛋白在空间和理化性质相匹配 这样的合成设计被称之为 目标导向合成 target orientedsynthesis 利用这样的筛选模型 人们就可以从合成的化合物库中找出一些能调节该蛋白功能的化合物 如果以靶蛋白为药物靶点 那么反向化学遗传学筛选出的小分子最终就可能是一个潜在的药物先导化台物 因此 这类方法在药物设计中应用很广泛 如受体激动剂和拮抗剂 酶的激活剂和抑制剂等 124 125 1 反向化学遗传学实例 purvalanol的发现 1 2 6 9 三取代的嘌呤库的构建见实例 myoseverin的发现 由于嘌呤碱基不但是构成核酸的基本组成成分 而且许多辅酶 如烟酰胺二磷酸腺苷 NAD 黄素二磷酸腺苷以及辅酶A都含有腺苷成分 生物体内的三磷酸腺苷 ATP 不但为机体的活动提供能量 也直接参与众多合成反应来调控细胞的生化反应过程 如蛋白激酶催化的蛋白质磷酸化反应 多取代嘌呤具有与ATP相似的结构 可以与ATP竞争酶的活性中心的结合部位 从而达到抑制酶催化反应的目的 126 2 CDK 细胞周期蛋白依赖性激酶 抑制剂的筛选 在细胞周期中涉及到多种细胞周期蛋白依赖性激酶 CDK 它们参与周期各个时期生化反应的调控作用