【毕业学位论文】（Word原稿）牛防御素BNBD5的cDNA克隆及毕赤酵母表达动物遗传育种与繁殖硕士论文

级 ： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 牛防御素 隆及毕赤酵母表达 in in I 摘 要 防御素是进化中的古老分子，在先天性免疫系统的宿主防御机制中起重要作用，在细菌、霉菌、植物、无脊椎动物和脊椎动物中，可以激活机体的第一道防御屏障，启动先天性免疫反应和获得性免疫反应。 研究发现一些 如 奶牛感染乳房炎时可在乳腺中诱导表达，表明在乳房炎发生时 有研究发现乳房炎能增加乳腺中 表达量约 13 倍， 本实验室已经构建了具有高消减效率的奶牛乳房炎抗性相关库，并将 因初步确定为抗乳房炎的候选基因。因此， 牛防御素可以作为抗乳房炎的候选基因进行进一步 深入 研究 。 牛防御素 牛的嗜中性粒细胞中分离出来，其前体肽编码 64 个氨基酸，分子量为 7228有抑制 性，属分泌型蛋白。 本实验以患乳房炎的荷斯坦奶牛为实验材 料，提取血液白细胞总 据 注册的牛防御素 列设计引物，采用 术扩增出 因的 将其克隆到 体中进行序列测定，将测序鉴定正确的克隆质粒命名为计 5端带有 和 酶切位点的引物，利用 术分别从含有因 的 组质粒中扩增 因编码区，大小为 195然后插入到 体的 和 位点，这个载体具有 泌信号肽可将重组蛋白分泌到培养基 上清中， 而且具有 性标记利于抗生素筛选。用 将重组表达质粒 性化后采用 电转化和化学转化 法转 入毕赤酵母宿主菌 入到毕赤酵母染色体的高效启动子 下游。用高浓度的 生素筛选高拷贝转化子。以重组毕赤酵母的菌液为模板，进行 定。将阳性重组酵母转化子每 24h 添加 1%甲醇进行诱导表达，泳结果表明 产物 分子量约为 右，基本与 白相符。 以上结果表明，本研究成 功扩增出牛防御素 因的编码区， ，并 成功构建了牛防御素 毕赤酵母表达载体 首次采用毕赤酵母表达系统进行了牛防御素 表达。本论文的研究为进一步研究 白的抑菌活性，纯化蛋白、制备抗体等下游工作奠定了基础。 关键词 : 克隆 , 毕赤酵母 , 表达 , 牛 an as an in of of in be to in of in of It 3 of as of be of (4 228it is a NA of I to of to to to be at of is , a by ,by of OX in of of CR as by % 4h. on in In of is of 录 第一章 文献综述 . 7 物防御素 . 7 御素的来源与分布 . 7 御素的染色体定位 . 8 御素的分子结构特征 . 9 御素 的进化关系 . 10 御素的表达调控 . 10 御素的生理功能及作用机制 . 11 御素的应用前景 . 15 斯德毕赤酵母表达系统研究进展 . 17 斯德毕赤酵母表达系统简介 . 17 合蛋白的表达 . 18 用的转化方法 . 21 响外源蛋白表达的因素 . 21 泌蛋白的转录后调控 . 22 高外源基因表达产物的质量 . 23 用 . 23 研究的意义 . 24 第二章 牛防御素 因的克隆 . 26 验材料 . 26 验动物的来源及采集方法 . 26 要仪器设备 . 26 要试剂 . 27 剂配制 . 27 验方法 . 29 血液白细胞总 提取 . 29 纯化 . 29 转录 . 30 一链的检测 . 30 因的 增及扩增产物的琼脂糖电泳 . 31 因扩增产物的回收 . 31 隆质粒的构建 . 32 粒的制备 . 32 检测 . 33 验结果 . 34 血液白细胞总 . 34 转录检测 . 34 增产物 . 34 粒提取图 . 34 粒测序结果 . 35 第三章 牛防御素 毕赤酵母表达系统的建立 . 36 验材料 . 36 要试剂 . 36 制性内切酶 . 36 赤酵母表达系统所用溶液 . 36 验方法 . 38 因片段的亚克隆 . 38 组毕赤酵母表达载体 构建 . 39 达载体 鉴定 . 41 因在毕赤酵母系统中的表达 . 41 白的 析 . 44 验结果 . 45 防御素 毕赤酵母表达载体的构建 . 45 组质粒 序列测定 . 47 组质粒的双酶切鉴定 . 47 组质粒的 定 . 47 组酵母菌基因组 提取 . 47 组酵母菌株阳性转化子的筛选 . 48 组酵母菌株诱导表达生长曲线 . 48 析 . 48 第四章 讨论 . 50 究牛防御素 意义 . 50 赤酵母表达 . 50 赤酵母分泌型表达载体 选择 . 50 组酵母表达质粒的转化方法 . 51 组酵母表达菌株的选择 . 51 赤酵母表达 白 . 51 V 泳 . 51 泳方法 . 51 超低分子量蛋白电泳结果影响因素 . 52 第五章 结 论 . 53 参考文献 . 54 附 录 . 59 附录 1 B， C 载体示意图 . 59 附录 2 牛防御素 白 . 60 附录 3 牛 . 61 附录 4 测序结果峰图 . 61 码区测序结果峰图 . 61 组质粒测序结果峰图 . 61 序结果峰图 . 62 致 谢 . 63 作 者 简 历 . 64 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 基酸 苄青霉素 嗜中性粒细胞 bp 基对 补 C 突状细胞 氧核糖核酸 氧核糖核苷三磷酸 E 肠埃希氏杆菌 G） 氨酸 油醛磷酸脱氢酶 二胺四乙酸 羊 防御素 氨酸 嗜中性粒细胞肽 肾细胞 抗菌肽 密度值 放阅读框 合酶链式反应 P 赤酵母 嗜中性粒细胞肽 鼠嗜中性粒细胞肽 at 鼠防御素 河猴 河猴骨髓 核糖核酸酶 A 转录聚合酶链反应 羊 二 烷基磺酸钠 43中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 7 第一章 文献综述 物防御素 御素的来源与分布 （ 1） 前已发现的 鼠、大鼠、仓鼠、兔、猪、猕猴的嗜 中性粒细胞、兔的齿槽巨噬细胞以及人和啮齿动物的小肠潘氏细胞中。 人类中已发现的 胞浆嗜苯胺蓝体 小粒中浓度很高，也存在于单核细胞和淋巴细胞中。 码 90100个氨基酸的前提肽， 集到 胞浆嗜苯胺蓝体 粒细胞，作为噬中性粒细胞在骨髓中存在， 骨髓中加工，随后释放到 潘氏细胞颗粒中。 （ 2） 泛分布于人、鼠、牛、羊、猪的多种器官上皮细胞内。 哺乳动物防御素的名称、分布及生物活性见表 人 人类已知的 要表达于上皮组织中。 995年从肾衰患者血液透析液中分离获得，组成型表达于呼吸上皮，尿道组织，鼻泪管、乳腺、肾脏、泌尿生殖道和其他上皮细胞中，也可在齿龈、颌下腺、腮腺、房水和 玻璃体等部位表达。 等于 1997年首先发现的 ,命名为 2001年， 腔黏膜、鼻黏膜、被感染的上皮细胞和单核巨噬细胞中表达。 可在成年人的心脏、骨骼肌、胎盘等中表达，还可在肿瘤组织中显著表达。 肤和扁桃体中分布最多，而在呼吸道、消化道和泌尿生殖道分布较少。 2001年，窦也有相当高的水平，在子宫、中性粒细胞、甲状腺、肺和肾脏中只有低水平表达，在其他组织中无法检测到。 2002年， 8种新的人 并通过采用计算机方法得到确认。 现他们各自的产物 附睾中特异性表达。克隆了这些新基因中的 于 20号染色体），表明他们首先在男性生殖道表达。 且发现 牛 1991年 名为后来在牛舌粘膜上皮发现了舌抗菌肽 ( 吸道、胃肠道、结膜和泌尿生殖道。来源于小肠的 有来中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 8 源于牛的中性粒细胞的 13。 猪 、肝脏、肾、淋巴结、膀胱、脑、睾丸、肌肉、皮肤、骨髓、心脏等器官的组织细胞中。绵羊体内发现有两种 ,即 远端回肠）均有分布 ,而 羊体内也发现两种 2005年从水牛的回肠末端克隆和纯化出 转录成 54后转染大肠杆菌 列分析表明与已报道的牛肠防御素 (同源性，与牛舌抗菌肽 (同源性为 与牛气管抗菌肽同源性为 与山羊防御素 源性为 。推断出氨基酸序列编码 64个氨基酸前体肽。核苷酸和氨基酸序列同源性表明所克隆出的序列与牛舌抗菌肽接近。 （ 3） 与 它的分子结构呈环状 ,并因此得名。 一些品种的小猪和猩猩中有表达。 表 乳动物防御素的名称、分布及其生物活性 he of 类 名 称 分 布 生物活性 4 6 4 19 7 人嗜中性粒细胞 兔嗜中性粒细胞 兔肾 脏 大鼠嗜中性粒细胞 大鼠潘氏细胞 小鼠潘氏细胞 猕猴嗜中性粒细胞 抗格兰氏阳性、阴性细菌、真菌、衣壳病毒等 气管、牛舌、气管、肠道泌尿生殖道 格兰氏阳性、阴性细菌、真菌等 远端小肠和结肠 13 牛嗜中性粒细胞 绵羊胃肠道 山羊呼吸道 ,舌 ,胃肠 道 消化道 ,呼吸道 ,泌尿生殖道 , 淋巴器官 ,皮肤 ,心脏 ,骨髓 6 小鼠气管 ,肺 ,肾脏 ,骨骼肌 大鼠气管 ,肺 ,肾脏 4 人肾脏 ,皮肤 ,气管 ,肺 ,食道 河猴嗜中性粒细胞、单核细胞 抗格兰氏阳性、阴性细菌，主要抗格兰氏阳性细菌 御素的染色体定位 2002年， 8种新的人 并通过采用计算机方法得到确认。人类这些新基因定位于 8号染色体接近已知的 和 他的定位于 6号和 20号染色体 ， 许多新基因现在仍在确认中。 人的 国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 9 就同源性而言 ,已证明一些脊椎动物的防御素和昆虫防御素之间的亲缘关系要比两个脊椎动物防御素的亲缘关系近。已经证实鸡 , 山羊 , 绵羊防御素与牛的 些宿主防御素在进化上保守。 明它们可能来自于共同的祖先 ,经过型的变异 ,再经过种间变异才发展到今天的情形。表 表 乳动物防御素基因的染色体定位 he of 种 名 称 染色体定位 人 13 27p(因簇 ) 小鼠 6 8p 大鼠 2 4 16p 26p 猪 防御素的分子结构特征 和 防御素是根据六个保守的半胱氨酸的线性空间和二硫键结构划分的。 尽管他们的共价结构不同，但是 和 防御素的三级结构相似。 和 防御素， 和 防御素来源于成熟的 防御素基因，具有成环的骨架。 经发现三种）是 防御素的类似物，由一个终止密码子从 防御素的三个半胱氨酸碳骨架的第 4 个残基处截断，从截短的 防御素前体切掉一个 9 个氨基酸的片断，然后从头到尾进行剪切，直到其他的相同的或者相似的九肽出现。 9 35 个氨基酸组成 ,富含精氨酸 ,具有游离的氨基酸残基。 6 个保守的半胱氨酸形成 3 对分子内二硫键。分子内二硫键连接方式为 中接 N 端和 C 端，形成分子内大环。 3 95 个氨基酸残基组成，信号序列为 19 个氨基酸，前区序列长 40 45 个氨基酸残基。成熟肽组成前肽分子的羧基端，终止密码子紧随成熟肽序列之后。骨髓源性防御素由个外显子和个内含子组成，第一个外显子编码 端非翻译区，第二个外显子编码信号序列前区序列，第三个外显子编码成熟肽和 端未翻译区。而来源于小肠潘氏细胞中的 但是他们具有一个共同的紧密的结构由三个二硫键 13合而成。虽然，这个家族在结构上也具有微小的不同。但猜测这种共同的折叠结构对于这种生物活性肽具有重要作用，对于其与相关的受体作用时保持分子大小和形式有重要意义。事实上， 就暗示着一般的三级结构也许会被用作产生新的一些具有抗菌活性的分子的模板。 1）由 38 42 个氨基酸残基组成；（ 2）六个半胱氨酸残基配对形成三个二硫键，连接方式为： 1233）最后的两个连续的半胱氨 酸（在 n 1 时）以 形式存在于 4）序列中部有一个保守的脯氨酸和一个甘氨酸，这是 5）与 第一章 文献综述 10 防御素先由信号肽合成前片断 , 然后再形成成熟肽。 个外显子和 1 个内含子 ,第 1 个外显子编码 5端非翻译序列及信号肽和部分前片段，第 2个外显子编码剩余部分前片段、成熟肽和 3端非翻译序列。 终止密码子一般在成熟肽序列末端。包括一个信号序列、一个短的前体肽和一个成熟的 002）。 有 36 45 个氨基酸残基 。 通过反向高效液相色谱 (从猕猴的白细胞中分离出一种成环状结构的新型防御素。它由 18 个氨基酸残基组成，包括 1 个苏氨酸 ( 1 个缬氨酸 ( 1 个亮氨酸 (1 1 个苯丙氨酸 ( 1 个异亮氨酸 ( 2 个甘氨酸 ( 5 个精氨酸 ( 6 个半胱氨酸 ( 个半胱氨