基因操作指南

病毒及基因治疗实验室操作指南（分子生物学部分）菌种保存700l 菌液加入等体积60%甘油，20或-70保存。甘油菌复苏、培养方法一:挑取甘油菌一环，接种在含有相应浓度抗生素的LB固体培养基上（活化菌种），37培养过夜（约1216小时）。选取单独菌落转接在含有相应抗生素的LB液体培养基中，37振摇过夜（约1216小时）。方法二:直接吸取1020l 甘油菌，接种在含有相应抗生素的LB液体培养基中，37振摇过夜（约1216小时）。小规模制备质粒DNA（QIA Miniprep Kit Protocol）适于从15ml 菌液中制备20g、小于10Kb的高拷贝质粒。（1） 溶液EB放置于37孵箱内，预热；（2） 用Ep管收集菌液，10,000 rpm ，离心1min，弃上清；（3） 加入250l 溶液P1（含RNase），重悬细菌；（4） 加入250l 溶液P2，轻轻颠倒46次混匀，室温下静止23分钟（不可超过5分钟，以免过度消化）；（5） 加入350l溶液N3，迅速颠倒46次混匀，1,3000 rpm 离心10分钟；（6） 上清入QIAprep柱，1,3000 rpm离心3060秒，滤液弃之；（7） 加入500l 溶液PB洗柱，1,3000rpm 离心3060秒；（8） 加入750l 溶液PE洗柱，1,3000rpm 离心3060秒，弃滤液，再次离心1分钟，以去除残存的PE；（9） 换新Ep管，加入37预热的溶液EB，37孵箱内静置1分钟（若质粒较大可适当延长时间），1,3000 rpm 离心1分钟，-20或-70冻存备用。手工方法小规模制备质粒DNA（1） 将菌液装于Ep管内，用台式离心机10,000rpm离心1min，回收细菌；（2） 加溶液I 200l（溶液I成分：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA），振荡，重悬细菌；（3） 加溶液II 200l（溶液II成分：0.2N NaOH，1%SDS），盖严管盖，颠倒45次，混匀，静置34分钟。在PH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，再将PH调至中性，在有高浓度溶液存在的环境下，染色体DNA之间发生交联，形成不溶性网状结构，大部分基因组DNA和蛋白质在去垢剂的作用下形成沉淀）；（4） 加溶液III 200l（溶液III成分：5mM KAc 60ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml），迅速颠倒56次，冰浴10分钟，1,3000rpm，离心10分钟，取上清；（5） 加等体积酚：氯仿：异戊醇（V/V=25:24:1），混匀呈白色悬浊液，1,3000rpm离心5分钟，取上层水相（注意：切勿将酚相与水相之间的白色物质吸起），移入新管；（6） 加入70%体积的异丙醇（约400l），1,3000rpm离心10分钟，弃上清；（7） 加入70%酒精1ml，充分混合，漂洗沉淀，1,3000rpm离心1分钟，弃上清；（8） 再次6,000rpm离心1分钟，将残存的酒精吸尽；（9） 将沉淀干燥至无色透明状，加入预热的EB溶液3050l，再加入RNase (工作浓度20g/ml)， 37孵箱内放置30分钟，-20保存备用。酶切反应(1)体系构成a) 反应体系应尽可能的小；b) 酶切缓冲液为整个反应体系的十分之一，本实验室所用酶多为NEB公司产品，具体的缓冲液选择方案，应参照该公司使用说明；c) 内切酶用量为反应体系的十至二十分之一（若为双酶切，则两种酶的总量占总反应体系的十至二十分之一），酶的用量过大可能反而不利于酶切（因为内切酶中含有甘油）；d) DNA总量不宜大于2-3g，否则在进行琼脂糖凝胶电泳时，会产生拖尾现象；（2）37水浴12小时（或过夜，以求酶切彻底）；（3）10l 电泳观察酶切是否完全；（4）65水浴15分钟，灭活内切酶；（5）-20保存备用。QIAquick 胶回收试剂盒使用说明（1） 切胶（尽可能地去除多余的胶），称重；（2） 加入缓冲液QG，300l/100mg胶，2%的胶应加大QG用量至600l/100mg；（3） 56水浴放置10分钟，每2-3分钟摇匀一次，使胶完全溶解，胶完全溶解颜色为黄色、匀质溶液；（4） 当DNA片段大小为500bp或4Kb时，应加入异丙醇100l/100mg胶，以提高产量，此步不离心。DNA片段在500bp4Kb时，加入异丙醇并不能提高产量；（5） 结合：将以上混合物转入QIAquick柱（柱容量750l），离心 1,3000rpm 1min；（6） 洗柱：加0.75ml缓冲液PE，1,3000rpm离心1分钟（注意：用于盐敏感操作时，如平端连接、直接测序等，加入PE后应静置25分钟）；（7） 弃离心液，再次1,3000rpm离心1分钟，以去除残余的乙醇；（8） 将QIAquick柱置于一新的1.5ml Ep管上，滴3050l经预热的缓冲液EB或水于QIAquick柱滤膜中央，静置1分钟，1,4000rpm离心1分钟，所得片段直接用于连接或20保存备用。连接反应（1） 体系构成（适用于粘端连接）a) 总反应体系为20l；b) 载体与目的片段摩尔数比为1:35；c) T4 Ligase Buffer 2l（占总反应体系的1/10）；d) T4 Ligase 1l（占总反应体系的1/20）；e) 载体用量应为0.1g左右，不宜过高。（2） 反应条件：16水浴放置1216小时（过夜）。（3） 反应产物直接用于转化或20保存备用。感受态细胞的制备（1） 甘油菌种1020l加入5ml LB液体培养基(无抗生素)中，37振摇46小时，至菌液呈稍微浑浊状（中对数期）；（2） 菌液冰浴10分钟，分装至两个Ep管内，4 4,0006,000 rpm离心35分钟，收菌；（3） 弃上清，轻轻重悬细菌于800l冰预冷的0.1M CaCl2中，冰浴10分钟，4 4,0006,000 rpm离心35分钟，收菌；（4） 再将细菌轻轻重悬于50l冰预冷的0.1M CaCl2中，冰浴，1224小时可用。注意： 若用0.1M CaCl2的10%甘油溶液重悬细菌，则可将该感受态细胞保存于-80深低温冰箱内36个月，而转化效率不会有明显的下降。PCR（聚合酶链反应）（1） 反应体系共25l，其中：a）模板为：菌液3l、病毒液5l或抽提的质粒DNA 0.51l；b）引物各0.5l；c）dNTP 0.5l；d）10Buffer 2.5l；e）若Buffer中不含MgCl2，则应加PCR专用的MgCl2溶液1.5l；f）Taq 酶0.5l；g）加入Milli Q 水，补齐至25l。（2） PCR参数：a）95 5 min；2035个循环b）94 30Sec；c）50 30Sec；d）72 90 Sec； e）72 链延伸 10min； f）4 保存 g）降温幅度为0.75/Sec。注意：以上反应条件只适用于一般的PCR，若结果不理想，应适当优化。大量制备质粒DNA（传统碱裂解法、PEG8000纯化）适用于从100250ml菌液中制备100250g高拷贝质粒（1） 涂板，挑取单克隆菌落，加入LB选择性培养基中，37振摇8小时，取适量菌液（1/5001/1,000）加入LB选择性培养基中（高拷贝质粒用100250ml，低拷贝用500ml），37 振摇1216小时；（2） 收获菌液（用50ml离心管）：4 5,000rpm离心10min，弃上清，再次离心2min吸除残留的培养液；（注意：次步可将离心沉淀后的菌斑20冻存1224小时，留待以后操作）；（3） 以10ml溶液I重悬细菌；（4） 加10ml溶液II，轻轻旋转，颠倒46次（不可过重，以免机械剪切基因组DNA），室温放置5min（不可超过5min，避免过度消化）；（5） 加入冰预冷的溶液III 10ml，迅速颠倒46次混匀，冰上放置20min，以促进沉淀形成；（6） 4 1,3000rpm（2,000g以上）离心30min，离心前应再次混匀样品；（7） 上清入新管，4 1,3000rpm（2,000g以上）再次离心15min，充分去除沉淀；（8） 上清入新管，加入60%体积的异丙醇（室温，以避免增加盐沉淀），混匀，室温放置10min，4 1,5000rpm离心30min（离心前应于管底作好标记），小心、缓慢地倒出上清，切勿将管底的DNA沉淀一并弃去；（9） 清洗：70%乙醇20ml清洗沉淀物，4 1,5000g离心10min，小心、缓慢地倒出上清，充分凉干，溶于0.1TE溶液3ml中；（10） 加入等体积（3ml）冰预冷的5M LiCl溶液，充分混匀，4 10,000rpm 离心10min；（11） 上清入新管，加入等体积(3ml)异丙醇沉淀，室温条件下，以1,000rpm离心10min,弃尽上清，以70%酒精清洗后，凉干，溶于0.1TE溶液5001,000l中，分装Ep/500l；（12） 加入RNase（20g/ml)，室温放置30min；（13） 加入含13%（w/v）PEG8000的1.6M NaCl 溶液500l，充分混匀，室温静置20min，4 12,000rpm离心5min，回收沉淀的质粒DNA；（14） 弃上清，以400l 0.1TE溶液溶解质粒DNA，用等体积的酚：氯仿（200l：200l）和氯仿（400l）各抽提一次，水相入新管（氯仿中加入异戊醇可起到去除泡沫的作用，有利于防止吸出水相与酚相之间的白色物质）；（15） 加入1/10体积（40l）3M的醋酸钾溶液，充分混合，加入2倍体积（800l）的冰预冷的无水乙醇，冰上放置10min，4 12,000rpm离心5min，回收质粒DNA；（16） 弃上清，加入4预冷的70%酒精200l，稍加振荡，4 12,000rpm 离心5min，重复该步骤3次；（17） 吸除上清，敞开管口，室温凉干；（18） 以适量LoTE(pH8.0)溶解沉淀；（19） 紫外分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳，酶切鉴定。注意：每个需弃去上清的步骤都应小心地将其装入另一个新管内，以便于当实验不成功时查找原因及补救。病毒DNA-QIAGEN试剂盒抽提指南（1） 取200l含病毒的细胞悬液入1.5ml离心管，或107培养细胞以PBS悬浮，不够200l时以PBS调节；（2） 加20l QIAGEN蛋白酶K(PK)储备液和200l缓冲液AL，Vortex混匀；（3） 56孵育10min；（4） 4,000rpm短暂离心，去除管壁及管盖上的液体；（5） 加200l无水乙醇，Vortex混匀15sec，再次4,000rpm短暂离心，去除管壁上的液体；（6） 溶液入QIAGEN柱，8,000rpm离心1min；（7） 弃滤液，加入500l缓冲液AW1，8,000rpm离心1min；（8） 弃滤液，加入500l缓冲液AW2，14,000rpm离心3min；（9） 弃滤液，14,000rpm再次离心1min，弃2ml收集管；（10） 置QIAGEN柱于一洁净的1.5ml Ep管中，于滤膜中央滴加56预热的缓冲液AE 50l，室温条件下静止1min（必要时于56热浴5min）；（11） 14,000rpm 离心1min，弃QIAGEN柱。转 化 （1） 感受态细胞50l，加入25l连接产物，轻弹Ep管底部混合，冰浴3060分钟；（2） 42热休克90秒，勿摇动试管，再冰浴2分钟；（3） 加入LB液体培养基（无抗生素）200l，37温和振摇4560分钟；（4） 铺相应抗性的LB平板（平板要37预热），平放20分钟，37倒置培养1014小时。Linker的合成引物各10l（25m）加入PCR管中，混匀，置于PCR仪内，按以下程序进行合成：（1） 96变性5min；（2） 以0.01/sec的速度降温至72，停留5min；（3） 以0.01/sec的速度降温至55，停留5min；（4） 以0.01/sec的速度降温至4，备用。Linker的酶促磷酸化 反应体系：合成的非磷酸化Linker 10l10激酶缓冲液2.0l37温育1小时，产物可直接用于连接反应。10Mm ATP溶液2.0lT4 PNK1.0l100BSA溶液4.0l(40g)Milli Q H2O5.0lQIAGEN中样和大样质粒提取试剂盒操作步骤 （1） 取甘油菌10l，接种于LB含抗生素的选择性液体培养基中。高拷贝质粒接种于25ml（中样）或100ml（大样）培养基中，低拷贝质粒接种于100ml（中样）或500ml（大样）培养基中，37振摇过夜，约1216小时；（2） 用50ml离心管收集菌液，4离心6,000g15min，弃上清；（3） 加4ml（中样）或10ml（大样）溶液P1（含RNase）重悬细菌，振荡混匀；（4） 加4ml（中样）或10ml（大样）溶液P2，轻轻颠倒46次混匀，室温孵育5min；（5） 加4ml（中样）或10ml（大样）预冷的溶液P3，迅速轻轻颠倒46次混匀，冰浴15min或20min；（6） 4离心20,000g30min，将含有质粒DNA的上清移入新管；（7） 4再次离心20,000g15min，上清移入新管；（8） 以4ml（中样）或10ml（大样）溶液QBT分别平衡QIAGEN-tip 100或QIAGEN-tip 500柱，让液体自然流尽；（9） 将含有质粒