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YVO4:Eu荧光纳米粒子的制备及和生物分子的链接研究作 者 姓 名：李某指 导 教 师： 张某 教授单 位 名 称：某学院专 业 名 称：某专业东 北 大 学2009年6月Synthesis of Fluorescence YVO4:Eu Nanoparticles and Its Links with Biological Molecules by LiSupervisor: vice Professor ZhangNortheastern UniversityJune 2009毕业设计（论文）任务书毕业设计（论文）题目： YVO4:Eu荧光纳米粒子的制备及和生物分子的链接研究设计(论文)的基本内容：1.优化水溶性YVO4:Eu荧光纳米粒子的制备条件。2.采用离心、透析、凝胶色谱分离纯化合成粒子溶液。3. 用YVO4:Eu荧光纳米粒子标记亲和素。4.用制备的荧光粒子标记胰蛋白酶并进行定量检测。毕业设计（论文）专题部分：题目：设计或论文专题的基本内容：学生接受毕业设计（论文）题目日期第 1周指导教师签字： 2009年3月5日- i -东北大学毕业设计（论文） 摘要YVO4:Eu荧光纳米粒子的制备及和生物分子的链接研究摘要随着科学技术的发展，用纳米材料作为荧光标记物的研究取得了令人瞩目的成果。稀土荧光标记物因其荧光发射强度大、半峰宽窄和荧光寿命长等特点，广泛应用于生物芯片技术及细胞和生物成像等方面。此外，将稀土荧光纳米粒子应用于生物分析可以显著的提高检测的灵敏度，因此具有很好的应用前景。本实验采用水相法合成YVO4:Eu荧光纳米粒子，考察了反应溶液pH值和溶液浓度对合成粒子荧光性能的影响，确定的最佳实验条件为：反应溶液pH值为9.0，粒子的最佳使用浓度为2.010-4 molL-1。对合成的YVO4:Eu粒子进行离心、透析和凝胶色谱分离纯化。其中，以甲醇作为离心液纯化时，粒子的荧光强度增加最大，增加率为78.22 %。测定了合成粒子的量子产率，数值为7.5 %，表明粒子的荧光性能良好。在pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，用YVO4:Eu纳米粒子通过静电作用成功标记了亲和素，标记亲和素保留了原有的反应活性，可以和生物素发生特异反应。以滤膜为载体，用合成粒子通过静电作用成功标记了胰蛋白酶，当胰蛋白酶浓度在0.510.0 mgmL-1时，YVO4:Eu- trypsin固态复合物的荧光强度和胰蛋白酶的浓度成正比，线性方程为I=62.65c+72.06，相关系数R为0.9981。实验结果表明，合成的YVO4:Eu荧光纳米粒子可以作为通用的荧光标记物用于生物分子的快速、灵敏检测。关键词：YVO4:Eu，荧光，纳米粒子，标记，亲和素，胰蛋白酶- ii -Synthesis of Fluorescence YVO4:Eu Nanoparticles and Its Links with Biological MoleculesAbstractWith the development of technology and science, the study of nanomaterials which is used for labeling has made remarkable achievements. Rare earth luminescent labelings have the advantages of high fluorescence emission intensity, narrow half emission peaks and long fluorescence lifetime, used in the areas of biochip technology、cellular and biological imaging. whats more, using of these special nanoparticles as biological analytical markers can improve the detection sensitivity of biological molecules, so they have a broad prospect in application.Here, the YVO4:Eu fluorescent nanoparticles were synthesized by a water bath. The effect of experimental conditions, such as the pH values and the best concentration of YVO4:Eu nanoparticles solution, on fluorescent characters of YVO4:Eu nanoparticles were studied. The results showed that the best conditions to synthesize YVO4:Eu nanoparticles were as follows: The pH values of intermixture of rare earth ions，sodium citrate and sodium metavanadate solution were 9.0.The best suitable concentration of YVO4:Eu used for experimentation was 2.010-4 molL-1 .The YVO4:Eu fluorescent nanoparticles were purificated via centrifuge, dialysis and GPC for improving the fluorescence intensity of YVO4:Eu. Methanol used as Purification on Relative Increase of FL Intensity of YVO4:Eu is 78.22 %. In the phosphate-buffered solution of pH 7.4, the YVO4:Eu nanoparticles can label avidin by electrostatic interaction successfully. Moreover, avidin still kept their activity that they reacted with D-biotin specifically. Velum as carrier, the YVO4:Eu nanoparticles can couple with Trypsin by electrostatic interaction，and the margins of fluorescence intensity between YVO4:Eu-Trypsin and YVO4:Eu solution were proportional to the concentration of trypsin which was in range of 0.510.0 mgmL-1. The linear equation was I=62.65c+72.06, with the correlation coefficient of 0.9981.The experimental results showed that the synthesized YVO4:Eu nanoparticles can be used -iii-as a common fluorescent markers for the detection of biological molecules.Key words：YVO4: Eu , fluorescent , nanoparticles, label, avidin, trypsin-iv-东北大学毕业设计（论文） 目录目录毕业设计（论文）任务书i摘要iiAbstractiii目录v第一章 绪论11.1 稀土纳米荧光材料概述11.2 稀土纳米荧光材料的制备21.2.1 沉淀法31.2.2 水热法31.2.3 醇盐水解法41.2.4 微乳液法41.3 荧光纳米材料在生物分析中的应用51.3.1基于纳米粒子的超灵敏检测方法51.3.2在生物分离、制药以及药物靶向性输送中的应用51.3.3和生物分子的链接及在免疫分析中的应用61.4 凝胶色谱的工作原理及应用61.5 本论文的研究意义和内容7第二章 YVO4:Eu荧光纳米粒子的合成92.1 仪器及试剂92.2 实验方法92.2.1主要试剂的配制92.2.2 YVO4:Eu粒子的合成102.2.3 YVO4:Eu粒子溶液的纯化102.2.4荧光测定102.3 结果与讨论102.3.1反应原料pH对YVO4:Eu粒子荧光性能的影响102.3.2 YVO4:Eu粒子溶液的浓度对荧光强度的影响122.3.3 YVO4:Eu粒子溶液的纯化132.3.4 YVO4:Eu粒子的量子产率182.4 本章小结19第三章 YVO4:Eu荧光纳米粒子和生物分子的链接213.1 用YVO4:Eu荧光纳米粒子标记亲和素及和生物素的特异反应213.1.1实验仪器和试剂213.1.2实验方法213.1.3结果和讨论223.2 YVO4:Eu荧光纳米粒子测定胰蛋白酶253.2.1实验仪器和试剂253.2.2实验方法253.2.3结果与讨论253.3 本章小结28第四章 结 论29参考文献31致 谢35文献翻译及原文37- vi -东北大学毕业设计（论文） 第一章 绪论第一章 绪论纳米材料是指晶粒和晶界等显微构造能达到纳米级尺度、由有限分子组装起来、介于宏观物质和微观原子分子之间的一个介观层次1，具体地讲是指由极细晶粒组成，特征维度尺寸在纳米量级(1100 nm)的固态材料(包括粉体、块体、薄膜和纤维等) 2。 由于极细的晶粒，大量处于晶界和晶粒内缺陷的中心原子以及其本身具有的量子尺寸效应3、小尺寸效应4、表面效应和宏观量子隧道效应5等，纳米材料与同组成的微米晶体(体相)材料相比，在催化、光学、磁性、力学等方面具有许多奇异的性能6，它们的优越性在某些方面是常规材料无可比拟的。1.1稀土纳米荧光材料概述纳米发光材料是指基质的粒子为纳米级的发光材料，它包括纯的纳米半导体发光材料，稀土离子和过渡金属离子掺杂的纳米氧化物、硫化物、复合氧化物和各种无机盐发光材料8。基于本论文的研究内容，下面主要对稀土纳米发光材料的发展及现状进行讨论。1.2稀土纳米荧光材料的制备根据其反应原料所处状态的不同，合成方法可以分为固相法、液相法、气相法。固相法主要有低温粉碎法、超声波粉碎法、热分解法、爆炸法。气相法主要有真空蒸发法、气相化学反应法、高温等离子体法、油面蒸发法。在以上方法中，以液相法应用较多，这一方法又可分为液相物理法和液相化学法。主要的液相化学法有如下几种：1.2.1 沉淀法沉淀法是在金属离子溶液中加入沉淀剂，如氨水、氢氧化钠、尿素、草酸、碳酸氢铵等，生成沉淀，将沉淀过滤、洗涤后溶于有机溶剂将其分散，然后蒸发干燥。沉淀法主要有氢氧化物沉淀法、均相沉淀法、草酸盐沉淀法和络合-沉淀法。1995年Martin L等15用均相沉淀法合成了La2O3颗粒。详细讨论了起始金属离子浓度、沉淀剂浓度、溶液的pH和焙烧温度对颗粒形貌的影响。实验结果表明，合成的La2O3颗粒为1 m左右的球形。1.2.2 水热法管航敏等20报道了用水热法制备BaO-Nd2O3-TiO2(BNT)系纳米粉体。在KOH碱性溶液中，以TiCl4，BaCl2和Nd(NO)3为反应物，先制备出BaO-Nd2O3-TiO2(BNT)凝胶前驱体，再经低温水热处理，得到BNT系纳米粉体。结果表明，用该法获得的BNT系纳米粉体为立方相结构，稀土元素掺杂均匀，产物粒径小，分散性好。1.5 本论文的研究意义和内容稀土化合物荧光材料因种类繁多、性能优异而得到广泛的应用。2003年，Jun Feng等32首先在美国分析化学发表论文，将Eu2O3纳米颗粒用于生物分子的标记和检测。2007年，国内北京大学Kang Juan等33在Talanta上发表了YVO4:Eu纳米颗粒水热法制备和应用的研究报道。我们研究小组选择了稀土荧光纳米材料的合成及在生物分析中应用的研究课题，选题具有前瞻性和先进性。- 2 -东北大学毕业设计（论文） 第二章 YVO4:Eu纳米粒子的合成第二章YVO4:Eu荧光纳米粒子的合成2.1仪器及试剂仪器：LS-55荧光分光光度计(美国Perkin Elmer公司)；V-2100双光束紫外可见分光光度计(北京瑞丽分析仪器有限公司)；试剂：Y2O3(中国医药集团上海试剂公司， 高纯试剂)；Eu2O3(中国医药集团上海试剂公司， 高纯试剂)；丙酮(沈阳富源精细化工厂，分析纯)；甲醇(沈阳富源精细化工厂，分析纯)；乙醇(沈阳富源精细化工厂，分析纯)；丁醇(沈阳富源精细化工厂，分析纯)。2.2实验方法2.2.1主要试剂的配制(1) 0.1000 molL-1Y(NO3)3溶液：准确称取2.8226 g 三氧化二钇 (Y2O3)，置于干净的烧杯中，加入10 mL 1:1的硝酸加热溶解，将多余的硝酸蒸发除去，加水溶解后转移至250 mL容量瓶中定容，溶液pH值为1.0。 (2) 0.1000 molL-1 Eu(NO3)3溶液：准确称取1.7596 g三氧化二铕 (Eu2O3)，置于干净的烧杯中，加入10 mL 1:1的硝酸加热溶解，将多余的硝酸蒸干，加水溶解后转移至100 mL容量瓶中定容，溶液pH值为1.0。 2.3结果与讨论2.3.1反应溶液pH对YVO4:Eu粒子荧光性能的影响配制反应原料稀土硝酸盐溶液的pH值为1.0，柠檬酸钠溶液pH值为6.5 (直接用二次水溶解定容)，偏钒酸钠的pH值为12.7。将以上三种溶液混合均匀，通过加入HCl或者氨水调整混合溶液的pH值，水浴恒温加热合成YVO4:Eu粒子并测定其荧光激发和发射光谱，见图2.1。图2.1不同pH值反应溶液合成YVO4:Eu粒子的激发（AD）和发射光谱（ad）Fig. 2.1 Fluoresence excitation（AD） and emisstion spectra（ad） of YVO4:Eu nanoparticle solution synthesized at different pH values 由图2.1可见，反应溶液的pH值对合成粒子的荧光强度影响很大，当溶液的pH=9时，合成粒子的荧光强度最大。分析原因，当pH9时，钒酸根会形成多钒酸根，不利于YVO4:Eu纳米粒子的生成。当pH太高时，会生成稀土氢氧化物，因此荧光强度降低。另外，我们还试验向已合成YVO4:Eu粒子的溶液中加入酸或碱，改变溶液的pH值分别为7、8、9、10，测定溶液的荧光强度，结果见表2.1。表2.1合成后改变溶液pH值对YVO4:Eu粒子荧光强度的影响Table 2.1 Fluoresence Intensity of YVO4:Eu nanoparticle solution with different pH valuesSynthesized by same pH values合成后调整溶液pH值 7.0 8.0 9.0 10.0 荧光强度 209.43 224.50 239.11 241.12表2.1中数据表明，合成后调整溶液pH值对YVO4:Eu粒子的荧光强度影响不大。以上实验说明，溶液的pH值影响YVO4:Eu晶体的发育，并进一步影响到粒子的荧光性能。一旦YVO4:Eu晶体生成之后，其溶液介质环境pH值的改变对粒子的荧光性能影响较小。这是因为，铕离子的激发能量主要来源于钒酸根的吸收。当反应溶液浓度较高时，钒酸根会以多聚体存在，不能够有效的将能量传递给铕离子，所以荧光强度相对较低；当浓度较低时，钒酸根就会以VO43- 单体存在，更有利于将能量传递给铕离子，使荧光强度增强。但是当浓度过低时，钒酸根的浓度也较低，此时传给铕离子的能量有限，因此荧光强度降低。2.4 本章小结1. 对合成YVO4:Eu粒子时反应溶液的pH值进行了考察，当稀土离子、柠檬酸钠和偏钒酸钠混合后，将溶液pH值调至9.0，此时合成粒子的荧光强度最大。将合成的YVO4:Eu粒子原液稀释，荧光强度随随稀释倍数的增加先增大后降低，在稀释150倍时，荧光强度最强。2.对合成的YVO4:Eu粒子溶液进行离心、透析和凝胶色谱分离纯化。三种纯化方式均使粒子溶液的荧光强度增大，其中，用甲醇进行离心纯化时，荧光强度增加最大，增大率为78.22 %。3. 测定了最佳条件下合成YVO4:Eu粒子的荧光量子产率，数值为7.5 %- 13 -东北大学毕业设计（论文） 第四章 结论第三章 结 论东北大学毕业设计（论文） 参考文献参考文献1.张立德，牟季美.纳米材料科学M，沈阳：辽宁科技出版社，1994，23-24.2.郭畅.机械力固相化学反应合成稀土纳米Y2O3：Eu3+荧光材料研究J,中国实验诊断学，2004，8(4)：436-438.3.曹茂盛.功能性硫化镉纳米荧光探针荧光猝灭法测定核酸J，分析化学，2003，31(1)：83-86.4.Ball P, Garwin L. 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