固定化酵母细胞技术的实验改进.doc

固定化酵母细胞技术的实验改进陆敏超【摘要】充足的实验课前准备与重新设计工作对学生实验的科学性与可行性极其重要，本文结合学生在固定化酵母细胞实验具体操作过程中出现的问题的分析，从实验材料、操作程序等方面对实验进行改进与创新。【关键词】 固定化细胞技术 酵母细胞 实验改进 高中生物一、 前言生物学是一门以实验为基础的自然科学。生物学实验是学生获取生物知识的最有效手段之一，是学生获得感性知识的重要源泉，是实施素质教育的良好切入点。课程标准所倡导的探究性学习活动多数是通过实验来进行的，利用实验开展生物教学是验证理论知识的手段，也是培养学生的观察、操作和创新能力的重要途径。新课程标准在“课程资源的开发利用”中指：“应高度重视学校生物学实验室建设，积极营造良好的实验、实践环境，同时也应鼓励学生和教师充分利用身边廉价的器具和材料，设计富有创造性的实验和实践活动。”提倡新课程理念与校本研究结合促使教育资源合理配置，教师不仅要科学的设计实验、完善实验设备配置与管理，还要提出加强和改进的意见，在指导学生实验时鼓励学生大胆创新，改进教材中实验操作。从实验设想的酝酿到实验方案的设计，从实验结果的分析到实验报告的完成，每一步都蕴藏着创新的火花。在遵循科学性和可操作性原则的基础上引导学生开发新的探究实验，大胆放手让学生对已设置的实验进行操作，积极的改进实验。高中生物新教材中增添了许多实验内容，主旨在于通过加强实验培养学生的动手能力、科技创新能力以及探索科学知识的方法技巧。在教学实践过程中发现教材中部分实验存在设计缺陷、操作不太合理、实验材料及实验器材陈旧等问题，由于目前生物实验材料、方法、操作过程限制过多导致探索创新的空间不足,受到时间或实验条件的限制导致高中生物实验无法正常开展等。这些问题说明教材中的部分实验有待改进与创新。酵母细胞的固定化实验是人民教育出版社高中生物选修1生物技术实践模块中的课题。固定后的微生物细胞可以作为固体催化剂在多步酶促反应中发挥连续催化作用，避免复杂的细胞破碎、酶的提取和纯化过程，同时又有催化反应结束后能被回收和重复利用等优点。但教材介绍的方法同样存在不足。实验需要注重研究性与实验设计的科学性，通过实验改进，不仅解决实验材料、药品短缺的问题，节省了实验时间和实验经费，更重视的是还可以提高学生实验的可行性和科学性。二、固定化酵母细胞技术的实验改进1. 用最适温度促使酵母细胞的活化将在缺水的状态下处于休眠状态的干酵母重新恢复正常生活状态的活化有多种方法。酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该准备体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。本实验将1g干酵母和10mL蒸馏水置于50mL烧杯中搅拌均匀使之活化。教材介绍的方法活化酵母细胞需1小时左右，时间比较长，必须在课前由教师或学生提前做好准备。在适合的条件下缩短活化所需时间甚至不活化对有限的实验课时间分配来说是非常重要。酵母细胞的活化是受温度影响，酵母细胞的代谢类型属兼性厌氧型的自养微生物，在有氧条件下代谢较为旺盛，在有氧条件明显比在无氧的条件下活化快。根据这一原理经实验探究结果表明在保持酵母活性的前提下在30有氧的环境中酵母细胞活化所需时间最短，需要8-9min，所用时间明显少于教材介绍的方法活化酵母细胞需1h。针对没有进行活化的实验组与经过活化的对照组制备成固定化酵母细胞的发酵情况对比表明：酵母细胞在固定化前活化与否对发酵效果没有明显的差异。但酵母细胞活化后体积会增大，对凝胶珠的形状有影响，也会让学生错失观察酵母活化的变化与过程。所以在本实验中固定前的酵母细胞应该进行活化。在活化酵母期间，可配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液，称取无水CaCl20.83g放入200ml的烧杯中，加入150ml蒸馏水，搅拌使其充分溶解。2. 巧妙选择固定化细胞载体与海藻酸钠的浓度教材中并未提及固定化细胞载体的原理，利用酵母细胞活化期间对基本原理进行补充。海藻酸钠遇到钙离子可迅速发生离子交换生成凝胶，海藻酸钠溶液滴人含有钙离子的水溶液中可产生海藻酸钙胶球，使海藻酸钠转变为不溶于水的海藻酸钙凝胶，由此将酵母细胞包埋在其中。固定化细胞载体很多种，教材中介绍的固定化细胞载体为天然高分子凝胶载体海藻酸钙,无生物毒性,传质性好，但强度低且在厌氧条件下易被生物分解。用有机合成高分子凝胶载体聚乙烯醇( PVA) 和海藻酸钠制备成的复合载体PVA-海藻酸盐凝胶, 这种新配方传质性好且有较好的强度，实验效果更好。但实验室多配备有海藻酸钠，是应用最广泛载体材料。海藻酸钠溶液浓度会影响凝胶体的颜色和形状，浓度过高混合液的粘稠度大很难形成凝胶珠，常形成条状或蝌蚪状；浓度过低包埋的酵母菌数目少，影响用后续发酵实验的效果。配置海藻酸钠溶液的关键是水分的控制。如果严格按照教材的的剂量来配制和实验要求直至完全溶解后定容，但在烧杯中定容精确度低。在融化过程加热会导致水分蒸发、溶液长时间在空气中暴露、搅拌过程中没及时添加蒸馏水等都会造成海藻酸钠浓度过高。为了避免海藻酸钠溶液长时间暴露在空气中导致水分蒸发，影响海藻酸钠浓度，与酵母细胞混合均匀后可一次性吸到50ml兽用注射器针管中。通过配制不同浓度的海藻酸钠进行了试验比较，海藻酸钠浓度为0.05g/ ml的配方效果较好,配置的量25ml较为适宜。3. 用水浴加热法加速对海藻酸钠的溶解海藻酸钠的加热溶化是操作中关键环节，关系到实验的成败。现常用的溶解方法有三种：第一种是教材中所介绍的的是小火或者间断加热，使用该方法的缺点是耗时长，操作繁琐，难控制火候，容易出现焦糊现象。第二种用微波炉在800W功率下加热1.5 min，耗时最短，效果较好，但多数实验室未配备微波炉。第三种是进行水浴加热，用玻棒连续搅拌至海藻酸钠完全溶解。这种方法由于受热均匀就不会出现焦糊的现象，且水分散失较少，不影响到海藻酸钠的浓度，可行性最强。通过40-100梯度实验对照表明，海藻酸钠完全溶解所用时间与温度成负相关，用沸水浴加热的方法将海藻酸钠完全溶解平均用时2min，时间最短，但沸水加热有水滴溅出，存在完全隐患，改用90水浴加热较为适宜。4. 滴凝胶珠的方法改进将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至40左右，即可加入酵母细胞充分搅拌混匀。温度过高会烫死酵母细胞，温度过低影响混合速度。通过用注射器、胶头滴管、玻璃棒、漏斗等器材滴凝胶对比表明，注射器所滴出的凝胶效果最好。因为注射器管处于封闭状态可避免水分在空气中暴露蒸发影响海藻酸钠浓度。规格为50ml的金属外套兽用注射器针使用效果最好，这种规格的注射器的容量大便于可一次吸入，注射器金属外套可固定于铁架台上，便于调整高度和操作。滴凝胶珠过程中要对针头距CaCl2溶液液面的高度进行调节，保持一定高度让凝胶珠在下落过程中有足够的时间回缩成球形，但不能过高，否则在滴落过程中有溶液溅出，高度应控制在20-25cm左右较为适宜。刚形成的凝胶珠应在溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构，期间可以检验凝胶珠的质量是否合格。 5. 用简易自动发酵瓶进行固定化酵母细胞的发酵取一个500ml的烧杯，用一层纱布包住烧杯口，将浸泡在CaCl2溶液中的凝胶珠倒入纱布过滤后，然后直接用蒸馏水冲洗。然后将凝胶珠转移至装有150ml质量分数为10%的葡萄糖溶液的简易自动发酵瓶中进行发酵。简易自动发酵瓶的制作方法如下：用250ml葡萄糖注射液空玻璃瓶或者氯化钠注射液空玻璃瓶，清洗干净。装葡萄糖和固定化好的酵母后，取一个稍微比瓶口大的跳棋子，涂少许甘油后置于瓶口即可。该装置取材方便，严密性较好，可实现自动排气与密封。当瓶内发酵后产生的二氧化碳气体使瓶内的压强增加到一定值是会自动推动跳棋子排出，避免瓶内气压多大将瓶盖冲出或造成发酵瓶胀破，放气好了会自动落入将瓶口密封，避免氧气进入和其他微生物污染，这样既可满足发酵条件又可减少人工放气操作的麻烦。还可以从排除的气体闻出是否有酒味，通过透明的玻璃瓶观察试验现象、检查试验效果。最后收集固定化酵母细胞进行多次发酵，认同固定化细胞技术的优势。三、结语学生们通过对酵母细胞固定化实验的改进探究，观察体会并认同了固定化酶有利于产物的纯化和可反复利用等优点，达成教学目标。在实验教学中积极地与同学配合，严谨的实验，共同分析和解决实验过程中遇到的问题，倡导了新课程标准的理念，培养了各方面的能力，尤其是批判