苹果醋清除DPP H自由基活性成分的研究.doc

苹果醋清除DPP H自由基活性成分的研究张雾红 ，张永茂，黄玉龙，韩舜愈（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州 730070；2.甘肃省农业科学院农产品贮藏加下研究所，甘肃兰州 730070) 摘要:以苹果、酵母菌和醋酸菌为试验材料，采用小同的发酵下艺，对4种苹果醋样品进行抗氧化活性成分分析和DPPH自由基清除率的测定,研究其主要活性成分含量与DPPH自由基清除率之间的相关性。结果表明:苹果醋具有较高的抗氧化活性成分和较强的抗氧化能力，其中固态发酵苹果醋中总酚、总黄酮含量分别达到2.14，2. 19 mg/mL;当加入质量浓度200 g/mL苹果醋时，DPPH自由基清除率达92.37%，总酚、总黄酮含量和DPPH自由基清除率之间有较高的相关性，相关系数分别为0. 875 8,0.872 3。 关键词:苹果醋: DPPH自由基:活性成分DPPH free radicals scavenging activity by apple cider vinegarZHANG Ji-hong, ZHANG Yong-mao, HUANG Yu-long, HAN Shun-yu(1.College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;2.Agricultural Product Storage and Processing Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070,China) Abstract: Antioxidant activity component and DPPH free radicals scavenging active were studied by four kinds of apple cider vinegar samples of the different fermentation process. The results showed that apple cider vinegar had a higher antioxidant activity; the contents of total phenol, flavones were 2. 14mg/mL,2.19mg/mL in solid-state fermentation apple cider vinegar, respectively. DPPH free radicals scavenging reached 92.37%when the concentration of apple cider vinegar was 200g/mL. There were significant relationships between the contents of total phenol, total flavones and DPPH free radicals scavenging. The correlation coefficients were 0.8758 and 0.8723.Key words: apple cider vinegar; DPPH free radicals; active ingredient 苹果醋(apple cider vinegar)是以苹果为主要原料，经二次发酵(酒精发酵、醋酸发酵)制成的具有酯香和果香味的醋，含有丰富的营养成分，具有独特的药理作用.己有研究表明，苹果醋具有抗菌、抗疲劳、调节血糖、调节血压、促进食欲、促进钙吸收、预防骨质疏松、动脉硬化等作用1-2。日前关于食醋的抗氧化性研究有所报道，日木学者对日木黑醋研究表明，体外试验乙酸乙酯萃取物具有较高的抗氧化活性3，徐清萍等研究报道，镇江香醋中的抗氧化活性成分有酚类、黄酮、氨基酸、有机酸、蛋白黑素，总酚含量、总黄酮含量、DPPH自由基洁除活性可作为不同种食醋的鉴别指标之一4-5。近年来，随着人们对苹果醋关注度的提高，关于其发酵工艺和风味物质的研究较多，而关于苹果醋中的抗氧化性能研究尚末见报道。苹果醋中含有天然抗氧化剂酚类、黄酮类、VC、氨基酸等物质6。为探求它们的含量与其抗氧化性之间的相关性，本试验以不同工艺制作的苹果醋为样品测定了苹果醋中总酚、总黄酮含量及对DPPH自由基的清除作用，初步了解了苹果醋中的抗氧化物质及抗氧化性能，以期为苹果醋产品的进一步开发研究提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与仪器试验用苹果为甘肃天水红富士； 酵母菌(CICC菌株编号1383、1751)、醋酸菌(CICC菌株编号20064、20056)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；1,1-二苯基-2-三硝基苯册(DPPH)购自日木Wako工业株式会社；福林酚试剂购自北京拜尔迪公司；芦丁(标品)、抗坏血酸、2,6-二氯酚靛酚钠盐等试剂均为国产分析纯。 Cary100型紫外可见分光光度计购自美国瓦里安公司；HHS型电热恒温水浴锅购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；BS224S型电子分析天购自德国赛多利斯公司;HA-3158型榨汁机。1.2 试验方法1.2.1 苹果醋样品的制备 分别以天水红富士鲜榨果汁、浓缩果汁及汁、渣混合物为原料，调整糖度为12.2进行不同菌种的酒精发酵和醋酸发酵。酒精发酵温度27，接种量8%，醋酸发酵温度32，接种量10%，发酵15d,得4种苹果醋样品，样品色泽淡黄无差异，取上清液，滤纸过滤后备用。样品见表1(总酸含量以苹果酸计)。表1 苹果醋样品Tab.1 The samples of apple cider vinegar 样品 原料 发酵方式 菌 种 总酸含量（g(100mL)）苹果醋1 鲜榨果汁 液态 酵母菌1383 酵母菌20064 3.86苹果醋2 鲜榨果汁 液态 酵母菌1383 酵母菌20064 3.58 苹果错3 鲜榨果汁 液态 酵母菌1751 酵母菌20056 3.64苹果醋4 果汁、渣 固态 酵母菌1383 酵母菌20064 4.031.2.2总酚测定 采用Folin-ciocalteu法测定总酚含量7。精确称取没食子酸10mg，用蒸馏水定容至100mL，质量浓度为0.1mg/mL，准确吸取此溶液0.50,0.75,1.00,1.25,1.50,1.75mL分别置于25mL具塞试管中,分别加1.25mL福林-酚试剂，再分别加入3.75mL 20%的Na2CO3溶液,定容至25mL,于30反应2h，以不加样品为空白对照。在其最大吸收波长765 nm下测吸光度，绘制标准曲线，得回归方程为:y=0.0992x一0.1142， R2 =0.9995。 样品含量测定:精确吸取适量浓度的供试样品溶液3份,每份1mL置于25 mL容量瓶中,按上述试验方法分别测吸光度值(A)，计算其含量。1.2.3总黄酮测定 精确称取芦丁标品20mg，用蒸馏水定容至100 mL，质量浓度为0.2 mg/mL，准确吸取此溶液0.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0,12.0 mL，分别置于50mL容量瓶中，各加入体积分数70%的乙醇至20mL,加5% Na2CO3溶液2.0mL，摇匀放置6min；加10%Al(NO3)3溶液2.0mL，摇匀放置6min；加1.0mol/LNaOH溶液4.0Ml,加水至容量瓶刻度，摇匀放置15min,以不加芦丁对照品溶液为空白。在扫描确定波长510nm下测吸光度，绘制标准曲线。得回归方程为:y=0.0112x0.010 7, R2=0.9999。 样品含量测定:精确吸取适量浓度的供试样品溶液3份，每份1mL置于50 mL容量瓶中,按上述试验方法分别测吸光度值(A)，计算其含量。1.2.4 抗氧化性测定1.2.4.1 DPPH自由基标准曲线制作准确称取50mg DPPH，用无水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶中，得0.5 mmol/L DPPH母液mL,取DPPH母液40mL,用无水乙醇定容至100mL,得0.2 mmol/L DPPH溶液,用乙醇稀释至0.02 ,0.04,0.06,0.08,0.10 mmol/L，在扫描确定波长517nm处分别测定吸光度。以含量对吸光度(A)进行直线回归，得回归方程y=10. 218x+0.0011, R2=0.9999。1.2.4.2苹果醋清除DPPH自由基活性的测定分别取0,50,100,150,200,400,600g/mL苹果醋,定容至2mL,再加0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL,摇匀，30 min后用无水乙醇作参比于517 nm处分别测定吸光度，同时用溶剂乙醇作参比测定其吸光度A，按照下列公式计算DPPH自由基清除率，清除率越大说明抗氧化能力越强。 DPPH剩余率(%)= CDPPH./C。 清除率(%)=1DPPH剩余率式中，CDPPH.为t时刻体系中DPPH的浓度；C。为DPPH的初始浓度，此处为空白溶剂参比值。1.2.4.3 DPPH自由基的EC50值DPPH自由基在初始浓度50%时所需抗氧化剂的最小量(EC50)，根据不同浓度抗氧化剂的剩余率用OriginPro8.0作曲线求出。2结果与分析2.1苹果醋的抗氧化活性成分苹果醋功能性成分主要是有机酸、酚类、黄酮类等物质，有机酸主要以醋酸为主通过参与机体代谢发挥调节功能，多酚类物质大多具有数量不等的酚羟基，可以作为氢供体，使自由基还原，从而达到清除目的，黄酮类物质清除自由基的机理在于阻止自由基在体内产生的阶段，与脂质过氧反应即阻止脂质过氧化过程，多酚类、黄酮类物质作为天然有效的自由基清除剂（清除羟基自由基、超氧自由基等）都具有抗氧化性。苹果醋中的多酚、黄酮类物质来源于苹果原料，其含量的高低受酿造过程影响，故不同种类苹果醋中的总酚、总黄酮含量存在差异（表2）。由表2可以看出不同种类苹果醋中抗氧化物质成分含量差异较大，其中苹果醋4中的总酚、总黄酮含量较高，苹果醋2中的总酚黄酮含量较少。说明苹果醋酿造过程中原料的处理方式，发酵状态及菌种选择都对产品中天然抗氧化活性成分总酚、总黄酮含量有较大影响。2.2苹果醋与DPPH自由基清除活性的关系DPPH自由基是一种稳定的有机自由基,在可见光区最大吸收峰为517nm，其乙醇溶液呈深紫色，当与苹果醋中天然自由基清除剂接触时，由于与其单电子配对使其吸收逐渐消失，其褪色程度与接受的电子数成定量关系。因而可用分光光度法进行定量分析，检测自由基清除情况，从而评价苹果醋的抗氧化能力。苹果醋抗氧化能力用DPPH自由基清除率来表示，清除率越大，抗氧化能力越强。由图1可以看出，不同种类的苹果醋都具有较强的抗氧化能力，但对DPPH自由基的清除作用有明显差异。随着苹果醋加入量的增加，对DPPH自由基的清除率也增大，说明在一定范围内苹果醋清除自由基的能力与其质量浓度呈明显的量效关系,当加入质量浓度为25g/mL的苹果醋时，各个样品清除率差异不大，当加入质量浓度为200g/mL的苹果醋时，清除率差异明显加大，苹果醋4对DPPH自由基清除率相对较大，苹果醋2对DPPH自由基清除率相对较小。2.3苹果醋清除DPPH自由基的EC50值比较将反应平衡时所对应的苹果醋与DPPH自由基浓度比值作曲线，可得DPPH自由基在初始浓度50%时所需抗氧化剂的最小量（EC50）。以1/ EC50表示苹果醋清除自由基能力（antiradical power, APR）,APR值越大则抗氧化能力越强(表3)。由表3可以看出，不同种类苹果醋抗氧化能力有明显差异，其抗氧化能力大小顺序为苹果醋4苹果醋3苹果醋1苹果醋2，说明发酵过程对苹果醋的抗氧化能力影响较大，其中发酵状态对苹果醋抗氧化能力的影响大于原料差异和菌种差异。2.4 不同种类苹果醋抗氧化活性成分含量与DPPH自由基清除活性的关系以上种苹果醋在相同浓度下测其总酚含量、黄酮含量与DPPH自由基清除率的相关性（图2、图3）。由图2和图3可以看出，不同苹果醋样品对DPPH自由基清除率与样品中含有的总酚、总黄酮浓度呈正相关性，样品中总酚、总黄酮含量越高，对DPPH自由基清除活性越强不同苹果醋样品对DPPH自由基清除率与苹果醋中总酚、总黄酮含量相关性曲线线性回归方程分别为：17.424x13.603，16.985x13.104，相关系数分别为0.8785、0.8723，说明苹果醋的抗氧化能力与总酚含量和总黄酮含量有较高的相关性，总酚含量和总黄酮含量可以作为苹果醋的抗氧化活性评价指标。3结论通过对不同苹果醋中总酚、总黄酮含量和DPPH自由基清除率的测定表明，苹果醋中含有较高的抗氧化活性成分多酚、黄酮类化合物，对DPPH自由基有较高的清除作用，其抗氧化能力与总酚、总黄酮含量之间存在较高的相关性，总酚、总黄酮含量可作为苹果醋抗氧化能力的评价指标。不同种类苹果醋的抗氧化能力有明显差异，抗氧化能力大小顺序为：苹果醋4苹果醋3苹果醋1苹果醋2，说明原料、菌种、发酵状态对其影响较大，其中固态发酵对苹果醋抗氧化能力的影响大于液态发酵，原料差异对苹果醋抗氧化能力的影响大于菌种差异，由此可见，通过原料和酿造工艺的控制可调整苹果醋的抗氧化能力，多酚、黄酮类化合物含量及它们对DPPH自由基清除活性可作为苹果醋的质量检测指标，可为苹果醋产品质量提高和抗氧化能力研究提供理论依据。参考文献李素云，杨留枝 苹果醋饮料研究的现状及发展前景调查研究，2007，10（11）：810 Takashi Fushimi, Kenji Tayama, Masahiro Fukaya,etal .Acetic acid feeding enhances glycogen repletion in liver and skeletal muscle of rats J.The Journal of Nutrition,2001,131(7):19731977 Shimoji Y,Tamura Y,