【毕业学位论文】（Word原稿）活性调节细胞骨架蛋白在大鼠岛叶癫痫模型海马中的表达及意义-癫痫的临床与实验研究外科学

分类号： 单位代码： 10752 密 级：公 开 学 号： 2008190 宁夏医科大学 硕士研究生学位论文 活性调节细胞骨架蛋白在大鼠岛叶 癫痫 模型海马中的表达 及意义 of in by 位 申 请 人 ： 指导教 师 ： 申请学位门类级 别 ： 医 学 专业名 称 ： 外 科 学 研究方 向 ： 癫痫的临床与实验研究 所在学 院 ： 临 床 学 院 论 文 完 成 日 期 ： 二一一年三月 宁夏医 科大学 研究生 学院 he of in by s 011 宁夏医科大学学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名 论文导师签名 年 月 日 年 月 日 宁夏医科大学 关于学位论文使 用授权的声明 宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。 （保密论文在解密后应遵守此规定） 论文作者签名 论文导师签名 年 月 日 年 月 日宁夏医科大学硕士研究生学位论文 中文摘要 活性调节细胞骨架蛋白在大鼠 岛叶 癫痫 模型海马中的表达 及意义 摘 要 目的 电刺激 粒细胞皮质 ，建立慢性电点燃模型， 观察 齿状回的 表达变化 ，探讨 叶癫痫 中 的作用。为进一步研究岛叶癫痫的发病机制提供理论依据。 方法 1. 大鼠岛叶慢性电点燃癫痫模型的建立 : 健康雄性 鼠 40 只 ，随 机分成两 组 ，点燃组 、 假手术组 。 点燃组 35只， 假手术组 5只 。 两 组均在 左侧 岛叶 颗粒细胞皮质 植入双极电极， 点燃组先测定大鼠的后放阈，从测定后放阈的第二天起 每日 2次刺激， 刺激时间间隔 1h， 刺激参数：强度为后放阈 率 60 宽 1 续时间 1 s。 假手术组 不进行任何刺激。 点燃成功后 1个月给予同样的刺激参数，观察模型的稳定情况。 刺激大鼠 岛叶 癫痫模型 中的表达 ：健康雄性 鼠，随机分为点燃组和假手术组 、单一电刺激组 、空白组 。 除空白组 7只外，其余 每组 随机分为 3 h、 6 h 两 个亚组，每 个 亚组大鼠 7只。 点燃组、假手术 组、单一电刺激组 均在 左侧 岛叶 颗粒细胞皮质 植入双极电极， 点燃组 每日 2 次刺激， 刺激时间间隔 1h， 刺激参数：强度为后放阈 ，频率 60 宽 1 续时间 1 s。假手术组 不进行任何刺激。 单一电刺激组：只 刺激两次 。 无痛 处死大鼠， 取 脑组织 标本应用 免疫组化染色法、 逆转录聚合酶链反应（ 、原位杂交组织化学方法 、免疫印迹染色法 研究 电点燃大鼠岛叶模型 蛋白 在海马中的表达 变化 及意义 。 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 中文摘要 结果 激大鼠左侧岛叶 颗粒细胞皮质 成功建立 了 慢性电点燃癫痫模型 ： 其中一只电极脱落，三只电极未准确植入到 大鼠 岛叶，剩余 31只大鼠均点燃成功，点燃成功率 31/35） 。 安静状态下 自由活动的大鼠以及癫痫发作时大鼠岛叶皮层的脑电变化都被记录到 ， 正常大鼠脑电频率较低，通常在 10率低、能量也低，大鼠级发作时的脑电频率增高到 30且能量也大大增强。 通过一段时间的点燃 ，大鼠都 可达到 级 ，点燃大鼠一个月后给予同样的刺激参数均能达到 级 发作。 2 正常 大鼠海马组织中存在 蛋白， 点燃 成功后 3 h 蛋白 在海马颗粒细胞层明显增加，并且进入了齿状回的树突区（分子层） （ 。 单一电刺激组和假手术组中 蛋白与空白组相比无统计学差异 （ P。 结论 鼠 岛叶 颗粒细胞皮质 成功建立了慢性癫痫 模型，进一步证实了岛叶 可以作为一个独立的癫痫起源灶， 岛叶本身具有 致癫潜能。 能 在岛叶癫痫中 起着重要作用 ； 触可塑性变化， 可能是其发生、发展过程中 可塑性变化的重要分子基础。 关键词 ： 岛叶， 癫痫 ， 突触可塑性 ，活性调节细胞骨架蛋白 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 英文摘要 he of in by at to we to rc in to rc in to of . at 40 in in .5 of to 0 s. to of a to of rc in 49 in to a to n=7) ,in is h,6h n=7). .5 of to 0 s. to A 夏医科大学硕士研究生学位论文 英文摘要 IV to in to rc in of . is at of 3 in 1 31/35） a EG in 0is 0 Hz,is a of of a in of h in of rc no P in a is an is at of by 2. an be in in of 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 英文摘要 V 缩略语表 缩 略 语 表 英文缩写 英文全称 中文全称 叶癫痫 治性癫痫 痫 持续状态 放电 阈值 密度 电图 早基因 性调节细胞骨架蛋白 时程增强 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 目录 目 录 中文摘要 英文摘要 缩略语表 前 言 1 第一部分 大鼠岛叶慢性电点燃癫痫模型的建立 3 材料和方法 3 结果 6 第二部分 活性调节细胞骨架蛋白在电刺激大鼠 岛叶 癫痫模型中的表达 8 材料和方法 8 结果 26 讨 论 31 参考文献 36 小 结 42 综 述 43 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 前言 1 前 言 癫痫 反复发作导致患者生活自理能力以及认知功能下降，严重危害 着 人类的健康 。癫痫还加重了人类的经济负担，在全球所有疾病的负担中，癫痫占据了 1。 癫痫人群 中有四分之一 的 是 难治性癫痫， 目前 的 研究认为岛叶可能在其中起着关键作用 2， 但国内 外 目前 尚缺乏关于岛叶起源 癫 痫的 系统研究报道，相关文献主要集中于对岛叶功能及手术治疗岛叶占位性病变的研究。 鉴于 岛叶 在颞叶癫痫中的作用， 目前已 引起了 学者的 重视 3。 突触可塑性是指突触在 形态和功能上的改变 。 最近几年，国内外学者对 突触可塑性与 癫痫发病机制 之间的关系进行了广泛 的研究。在 药物 点燃动物模型中， 海马环路 的 不同 部位发生苔藓纤维出芽、突触重组等是其 最显著的病理变化 4，但在电点燃模型中，早期研究显示：点燃不引起神经胶质增生、坏死，神经变性及苔藓纤维发芽等形态学改变 5。最近， 5应用电点燃大鼠杏仁核诱导出现慢性 癫痫发作模型，发现海马 藓纤维发芽 和突触重组现象。 苔藓纤维发芽和突触重组 在颞叶癫痫的发生、发展、维持，以及对颞叶癫痫认知功能损害都起到关键作用 6。虽然近年来在此方面己有很多研究报道，但仍不清楚是何种“因素”或者“物质”启动并维持了癫痫的反复、自主性发作。 即早基因 (一类 原癌基因， 在神经元活性刺激作用下迅速而短暂 产生 的基因，广泛应用于对海马各亚区的功能学研究 7。 在癫痫研究中，可将 过对其表达的时程 和区域的研究，来确定癫痫活动启动区及播散情况。 为 转录因子 和效应 子 ，转录因子能影响靶基因的 转录 ，而 应子能直接 调节细胞功能 。 研究显示： 在癫痫形成 的 过程中， 神经 元的 出芽和新 突触 的 形成，与突触 可塑性密切相关。 活 性 调 节 细 胞 骨 架 蛋 白 (一即早基因效应子，于 1995年被 拷贝基因，编码单一的蛋白，在脊椎动物中高度保守并且在不同物种中诱导产生不同行为方式，与其他任何基因家族都没有宁夏医科大学硕士研究生学位论文 前言 2 共同区域，其 032编码 396期研究预测它是细胞内蛋白，并且指出是与血红蛋白有较弱的同源性 。 生化研究显示 外，细胞内分布的 动蛋白聚合有空间的延伸性，这表明 生物学作用有依赖 性 。 生 ，且其蛋白产物能 移动、积聚于被激活神经元的突触，特定蓄积于突触活性位点。这一独特特性使 态可塑性，以及记忆巩固中起到核心作用 8,但具体作用机制尚不清楚。 本实验采用 电刺激 立慢性电点燃模型， 观察大鼠癫痫发作时的脑电变化、行为学改变，以及 探讨 的作用。为岛叶癫痫的 产生及发展 提供理论依据。 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料和方法 3 第一部分 大鼠岛叶慢性电点燃癫痫模型的建立 材料 和 方法 1材料 6龄体重在 225间的 成年 D)大鼠，由宁夏医科大学实验动物中心 提供。实验大鼠 在 光 线适中 、 12/12h 昼夜 循环、 安静 、 温湿度适中、 单笼、自由进食水条件下饲养。 将 机分为 点燃组、假手术组 ， 点燃组 35只 大鼠 ，假手术组 5只 大鼠 。 各组大鼠体重 差异无统计学意义 （ P ， 两组均在左侧岛叶 颗粒细胞皮质 植入双极电极。点燃组先测定大鼠的后放阈，从测定后放阈的第二天起 每日 2次刺激， 刺激时间间隔 1h， 刺激参数：强度为后放阈 ，频率 60 宽 1 续时间 1 s；假手术组不进行任何刺激。点燃成功后 1个月给予同样的刺激参数。 戊巴比妥钠： 由 宁夏医科大学颅脑重点实验室 提供 青霉素： 鲁南制药集团股份有限公司 ， 规格： 80万单位 无水乙醇：天津市瑞金特化学品有限公司 75%乙 醇：天津市瑞金特化学品有限公司 自凝牙托粉：上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂 自凝牙托水：上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂 生物胶： 立体定位仪： 物电子刺激器： 性颅骨钻： Y O 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料和方法 4 漆包镍铬电极：直径 上海鼎阜金属材料有限公司 普通电子天平 :余姚市金诺天平仪器有限公司 密电子天平：梅特勒 海）有限公司 冷光四孔手术无影灯：广东汕头医疗器械厂 2实验方法 埋植与固定 (见图 1) 图 1 岛叶部位 电极与螺钉安放位置示意图 以镍铬漆包线和微电子元件作为材料自制双极刺激电极， 腔注射戊巴比妥钠 (50mg/醉大鼠，剪掉大鼠头顶的毛发，然后把大鼠头部固定在脑立体定向仪上，门齿低于耳杆平面 伏消毒拟作皮肤切口及周围皮肤，正中切口长度约 1.5 充分 暴露颅骨和 前后囟 ，无水乙醇脱脂。 在脑区相应部位 安放 4 个 螺钉。 立体定位： 按照 鼠图谱（ 1987）确定左侧 岛叶 颗粒细胞层 皮质位置 （前囟前 开 膜下 右额（前囟前 开 膜下 左侧小脑（前囟后 12开 膜下 。立体定位仪辅助下，小型牙科钻钻透颅骨， 双极电极 垂直颅骨表面，插入岛叶皮质内，硬膜下 作为刺激电极； 右额处的单极电极用来记录皮层脑电；左侧小脑处的单极电极用来作为参考电极，完毕 ，生物胶固定于颅骨 。 最后用 自凝牙托粉和自凝牙托水 将其固定在颅骨表面 ，待其凝固后，撤掉定位仪， 观察大鼠 各项 生命体征 ， 待其苏醒后，宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料和方法 5 放回鼠笼， 单笼饲养； 为防止感染， 术毕连续 3 万 U/d。 立 点燃模型 测定后放阈值（ 9： 术后恢复两周，测定大鼠岛叶 100刺激器给予持续电流刺激， 参数如下： 脉冲为双向方波，波宽 1.0 率 60 续 1 s。 测定大鼠 许 大鼠自由活动 ， 开始刺激时刺激强度为 100 A，以后每隔 900 A，直到 3该大鼠 岛叶 的 后放阈值的测定保证以高于后放阈的刺激强度点燃大鼠。然后就用后放阈值的 日两次， 刺激时间间隔大于 1 h， 直到大鼠出现癫痫发作 10。 行为学观察 大鼠点燃过程中行为学观察，根据 评分标准进行发作级别评分。11： 0级：无任何反应； 级：面部阵挛，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼、湿狗样抖动等； 级：级加节律性点头 和（或）甩头 ； 级：级加前肢阵挛； 级：级加后肢站立； 级：级加双侧前、后肢强直、身体背屈强直、跌倒，持续站立和倾 倒，失平衡和四肢抽动。 动物连续出现 5次 级发作定义为点燃成功 12。 脑电图描记 从试验开始刺激至结束， 用 录并分析 每个 大鼠 的 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 结果 6 结 果 1后放阈 (后放阈为 刚刚能使神经元产生后发放的电流 强度。因癫痫是一组 大 脑神经元同步异常大量的放电并向全脑扩散为突出特点的电生理疾病，因此后放阈能否产生涉及到模型的成功与否，本实验记录到大鼠脑电后放阈 （ 见图 2B） 与正常脑电图 （ 见图 2A） A B A： 正常大鼠脑电图表现为节律规整的波形，无痫样放电 B： 后放阈：岛叶模型组测定后放阈时的脑电图出现典型的慢波节律增多，并有棘波或尖波出现，并与湿狗样抖动等动作同步。 部场电位（ V） 图 2 电同步记录系统记录大鼠脑电图 2点燃发作：本实验测量全部来自于自由活动大鼠， 其中一只电极脱落，三只电极未准确植入到大鼠岛叶 颗粒细胞皮质 ，剩余 31只大鼠均点燃成功，点燃成功率 31/35） 。电刺激大鼠岛叶后放阈为 (611士 112) A 。点燃速度为 (.8)d。 点燃大鼠的脑电图显示慢波节律增多，间断出现尖波、棘波（图 3），并与湿狗样抖动动作同步。 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 结果 7 级发作时 大鼠 脑电图 部场电位（ V） 图 3 电同步记录系统记录点燃大鼠脑电图 3脑电频率场电位： 安静状态下 自由活动的大鼠以及癫痫发作时大鼠岛叶皮层的脑电变化都被记录到 ， 正常大鼠脑电频率较低，通常在 10内，频率低、能量也低 （图 4A） ，大鼠级发作时的脑电频率增高到 30且能量也大大增强 （图 4B） 。 点燃大鼠级发作时导致大脑神经元异常和过度超同步 化放电，使其脑电频率 及 脑电能量 明显增加。 A B 图 4 电同步记录系统记录大鼠脑电频率场电位 A:正常脑电频率， 主要集中在 5 6 B：点燃大鼠 级发作时的脑电频率 ， 主要集中在 28 30. 岛叶癫痫模型的稳定性：已点燃成功的大鼠一个月后给予同样的刺激参数均能达到 级 发作。 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料和方法 8 第二部分 材料和 方法 1材料 625宁夏医科大学实 验动物中心提供。 实验大鼠在光线适中 、 12/12h 昼夜 循环、 安静 、 温湿度适中、 单笼、自由进食水条件下饲养。 将 鼠 随机分为 点燃组、单一电刺激组、假手术组和空白组，每组分两个亚组 (n=7)， 各组大鼠体重 差异无统计学意义 （ P 空白对照组：不安置电极，在别的大鼠刺激时抓取 两 次。 点燃 组 在 左侧 岛叶 颗粒细胞皮质 安放双极电极，每日 两 次刺激大鼠直至达到点燃状态 ，刺激时间间隔大于 1 h。 假手术组 仅插入电极，不予电刺激，在别的大鼠刺激时抓取 两 次 。单一电刺激组插入电极，测定后放阈后， 第 2 天 后放阈刺激 1 次，然后饲养 1 周，期间不再给予任何刺激。第 10 天进行第 2 次 后放阈刺激 1 次 。 戊巴比妥钠： 由 宁夏医科大学颅脑重点实验室 提供 乙醚：由 宁夏医科大学颅脑重点实验室 提供 青霉素： 鲁南制药集团股份有限公司 ， 规格： 80万单位 无水乙醇： 天津市瑞金特化学品有限公司 75%乙 醇： 天津市瑞金特化学品有限公司 自凝牙托粉：上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂 自凝牙托水：上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂 生物胶： 多聚甲醛：天津市福晨化学试剂厂 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料和方法 9 磷酸 氢二钠 ：天津市 元立化工 有限公司 磷酸二氢钠： 天津市 元立化工 有限公司 柠檬酸 : 上海试剂一厂 柠檬酸三钠 : 北京化工厂 蔗糖：天津市凯通化学试剂有限公司 冲液：西安百灵克科技有限公司 氯化钠注射液：宁夏启元国药有限公司 盐酸 ： 北京化工厂 氢氧化钠：成都市科龙化工试剂厂 异戊烷：天津市光复精细化工研究所 N 聚赖氨酸 )：北京博奥森生物技术有限公司 原位杂交用多聚赖氨酸：武汉博士得生物工程有限公司 中性树胶：天津市光复精细化工 研究所 冰醋酸 由宁夏医科大学颅脑重点实验室提供 。 氯仿 由宁夏医科大学颅脑重点实验室提供 。 异丙醇 由宁夏医科大学颅脑重点实验室提供 。 75%乙醇（提取 由宁夏医科大学颅脑重点实验室提供 。 海试剂 天根生化科技（北京）有限公司 盐酸胍 ：金华市中坚精细化工厂 汉博士得生物工程有限公司 原位杂交专用盖玻片：武汉博士得生物工程有限公司 原位杂交专用 汉博 士得生物工程有限公司 武汉博士得生物工程有限公司 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料和方法 10 汉博士得生物工程有限公司 汉博士得生物工程有限公司 司 剂盒： 司 琼脂糖：西班牙 6上样缓冲液 : 天根生化科技（北京）有限公司 溴化乙锭： 宁夏医科大学颅脑重点实验室提供 丙烯酰胺： 宁夏医科大学颅脑重点实验室提供 十二烷基硫酸钠： 宁夏医科大学颅脑重点实验室提供 甘氨酸： 宁夏医科大学颅脑重点实验室提供 过硫酸铵： 宁夏医科大学颅脑重点实验室提供 宁夏医科大学颅脑重点实验室提供 抗 ： 司 肌动蛋白 一抗 : 司 羊抗兔二 抗 ： 北京博奥森生物技术有限公司 蛋白定量试剂盒： 全式金（北京） 公司 5上样缓冲液 ： 中杉生物试剂公司 蛋白 全式金（北京） 公司 立体定位仪： 物 电子刺激器： 性颅骨钻： Y O 漆包镍铬电极：直径 上海鼎阜金属材料有限公司 普通电子天平 :余姚市金诺天平仪器有限公司 密电子天平：梅特勒 海）有限公司 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料和方法 11 京德天佑科技发展有限公司 青岛海尔股份有限公司 实验室 特勒 海）有限公司 数显恒温磁力搅拌器： 78州国华电器有限公司 磁力搅拌器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司 冷光四孔手术无影灯：广东汕头医疗器械厂 冰冻切片机： 动磨刀机 海医械模具厂 自动 去离子 水 机 ： 上海 电热恒温鼓 风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司 电热恒温水热箱： 微镜： 台式高速冷冻 离心机： 式高速 离心机： 国 美国 京市六一仪器厂 凝胶成像仪： 波炉： 6 北京六一仪器厂 31 北京六 一仪器厂 40 北京六一仪器厂 2 制作模型 见图 1） 以镍铬漆包线和微电子元件作为材料自制双极刺激电极， 腔注射戊巴比妥钠 (50mg/醉大鼠，剪掉大鼠头顶的毛发，然后把大鼠头部固定在脑立体定向仪上，门齿低于耳杆平面 伏消毒拟作皮肤宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料和方法 12 切口及周围皮肤，正中切口长度约 1.5 充分 暴露颅骨和 前后囟 ，无水乙醇脱脂。 在脑区相应部位 安放 4 个 螺钉。 立体定位： 按照 鼠图谱（ 1987）确定左侧 岛叶 颗粒细胞层皮质位置 （前囟前 开 膜下 右额（前囟前 开 膜下 左侧小脑（前囟后 12开 膜下 。立体定位仪辅助下，小型牙科钻钻透颅骨， 双极电极 垂直颅骨表面，插入岛叶皮质内，硬膜下 作为刺激电极； 右额处的单极电极用来记录皮层脑电；左侧小脑处的单极电极用来作为参考电极，完毕 ，生物胶固定于颅骨 。 最后用 自凝牙托粉和自凝牙托水 将其固定在颅骨表面 ，待其凝固后，撤掉定位仪， 观察大鼠 各项生命体征 ， 待其苏醒后，放回鼠 笼， 单笼饲养； 为防止感染， 术毕连续 3 万 U/d。 立 点燃模型 测定后放阈值（ 9：点燃组及单一电刺激组大鼠 术后恢复两周，测定大鼠岛叶 100刺激器给予持续电流刺激， 参数如下： 脉冲为双向方波，波宽 1.0 率 60 续 1 s。测定大鼠 许 大鼠自由活动 ， 开始刺激时刺激强度为 100 A，以后每隔900 A，直到 3该大鼠 岛叶 的 后放阈值的测定保证以高于后放阈的刺激强度点燃大鼠。 点燃 ： 每天按后放阈 强度刺激 2 次， 刺激时间为 1 s，刺激间隔 1 h，连续刺激至少 6 d， 直至出现 5 次 级发作，视为点燃成功 。 单一电刺激 ：测定大鼠后放阈后第 2 天 后放阈刺激 1 次，然后饲养 1周，期间不再给予任何刺激。第 10 天进行第 2 次 后放阈刺激 1 次， 以最后 1 次刺激为准， 然后 按时间点 无痛处死大鼠。 为学观察 大鼠点燃过程中行为学观察，根据 评分标准进行发作级别评分。11： 0级：无任何反应 ； 宁夏医科大学硕士研究生学位论文 材料和方法 13 级：面部阵挛，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼、湿狗样抖动等； 级：级加节律性点头 和（或）甩头 ； 级：级加前肢阵挛； 级：级加后肢站立； 级：级加双侧前、后肢强直、身体背屈强直、跌倒，持续站立和倾倒，失平衡和四肢抽动。 动物连续出现 5次 级发作定义为点燃成功 12。 本 采集 鼠