HTRF技术原理和应用介绍.doc

上海优宁维生物科技股份有限公司Cisbio-HTRF技术原理和应用简介HTRF（均相时间分辨荧光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是一种用来检测纯液相体系中待测物的技术。该技术基于荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence)）两大技术，开通的一款高通量药物筛选利器。荧光共振能量转移（FRET）利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体（Donor）和能量受体（Acceptor）。Donor被外来光源激发（例如氙灯或激光），如果它与Acceptor比较接近，可以将能量共振转移到在Acceptor上，使其受到激发，发出特定波长的发射光。将Donor和Acceptor分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将Donor和Acceptor拉到足够近的距离，产生能量转移，由于Acceptor的发射光来自能量转移，所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。 时间分辨荧光（TRF）TRF利用稀土元素中镧系元素的独特性质，它们与普通荧光的主要区别是荧光的持续时间不同。普通荧光的半衰期为纳秒级。镧系元素的半衰期为毫秒级，有6个数量级的差别。所以，在检测室，TRF有一个时间延迟-50us，经过这个时间延迟，普通荧光的信号几乎为零，所以，TRF的背景非常低，反映样品实际情况。HTRF的能量受体（技术创新点）HTRF的能量供体是铕(Eu)和钛(Tb)的穴状化合物。在这个穴状化合物里，Eu和Tb被永久地嵌合在一个笼子里，结构非常稳定，这个结构由J.M.Lehns教授发明的，并由此在1987年获得了诺贝尔奖。HTRF的能量受体HTRF的能量受体也有二种，XL665和d2.它们的光学性质相同，分子量不同，前者分子量为10KD，实际上就是别藻蓝蛋白（APC）。我们将APC的亚基偶联在一起，使其不能解离，提高了稳定性，后者分子量为1KD，在某些实验中有独特的优势。HTRF的操作步骤HTRF操作步骤非常简单，只需要将实验所需试剂加进去，然后孵育，检测即可。HTRF实验数据分析HTRF采用了比值法来处理数据，可以去除溶液通透率、细胞大小、细胞数量不同引起的误差。HTRF应用范围G蛋白偶联受体研究激酶活性检测生物标志物检测受体第二信使检测受体配体结合胞内信号分子检测胞外激酶活性检测胞内激酶活性检测基于抗体的夹心法和竞争法检测抗体检测生物/免疫过程分析免疫检查点检测抗体重链含量检测抗体轻链含量测定GST含量测定 CD16结合检测HIS含量测定 CD32结合检测CHO宿主蛋白含量测定 CD64结合检测PD1/PD-L1 CTLA4/B7-1LAG3/MHC II CD47 / SIRP alphaCTLA4/B7-2 Adenosin A2A相互作用分析蛋白修饰实验室服务蛋白-蛋白 / 蛋白-多肽蛋白-DNA / 蛋白-RNA蛋白甲基化 / 蛋白乙酰化蛋白泛素化 / 蛋白水解HTRF技术优势：1.操作简单，空板直接加样，加完即可检测，时间短（加样和孵育2h）！2.适合珍贵样本：整个实验体系只需20ul3.均相检测：无需包被，免洗ELISA，省时省力4.体系稳定：7天内可随时检测，信号基本不变5.数据客观真实：比值处理可有效去除背景荧光，假阳性率和价