内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛及脑损伤中的作用教学教案

内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛及脑损伤中的作用教学教案 内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛及脑损伤中的作用汇报人张金卉导师孙保亮研究的目的及意义SAH后脑血管痉挛、炎症反应及神经功能预后的改善是一个非常复杂的病理、生理、临床过程。 虽然进行了大量研究，为止其发生机制仍未完全明了。 研究小鼠体内内源性调节性T细对SAH后脑血管痉挛、炎症反应及神经功能预后的改善仍将是今后一个时期的热点。 随着研究的逐渐深入，将会对内源性调节性T细胞移植SAH的临床治疗及神经功能预后带来深远的影响。 国内外相关文献The Kiicsof LymphocyteSubsets andMacrophages inSubarachnoid SpaceAfter Subarachnoid Hemorrhage inRats ithas beensuggested thathumoral immunityplays arole in the pathogenesisof cerebralvasospasm aftersubarachnoid hemorrhage,there hasbeen noquantitative assayfor cellularimmunity.We studiedthe kiicsof immune cells in the subarachnoid space aftersubarachnoid hemorrhageintherat.蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛分子机制的研究进展与NO代谢有关的CVS K通道活性的改变文氧合血红蛋白的作用本磷酸二酯酶一V的作用本NO和ET一1的平衡失调与NO代谢无关的CVS Ras蛋白的作用前列环素与血栓烷A2失衡自由基与脂质过氧化物增多血管加压素的作用ca代谢紊乱Statin-Induced T-Lymphocyte Modulationand NeuroprotectionFollowing ExperimentalSubarachnoidHemorrhageStatins infl uenceimmune systemactivities throughechanisms independentof theirlipidlowering properties.T cellscan besubdivided basedon cytokinesecretion patternsinto twosubsets:T-helper cellstype1(Th1)and type2(Th2).Independent laboratorystudies haveshown statinsto bepotent inducersof a Th2switch inimmunecellresponse andbe neuroprotectivein severalmodelsof centralnervous system(S)disease.This studywas thefi rstto evaluatethe immunemodulating effectsof statinsin subarachnoid hemorrhage(SAH).The present study elucidatedthe potentialrole ofa Th2immune switchin statinprovided neuroprotectionfollowing SAH.Matrix metalloproteinase-9concentration inthe cerebralextracellular fluidof patientsduring theacute phaseof aneurysmal subarachnoid hemorrhageElevated cerebralinterstitial pro-MMP-9relates toearly brain injury inaSAH patients.A largerprospective studyshould beperformed to confirm whetherpatients withprolonged elevationor asecond peakof cerebralpro-MMP-9would bemore likelyto developDCI andtoconfirmwhether MMP-9,a mediatorof neurovascularinjury,would beworth toconsider asa predictorof vasospasm.Trehalose treatmentsuppresses inflammation,oxidative stress,and vasospasminduced byexperimental subarachnoidhemorrhage Subarachnoidhemorrhage(SAH)frequently resultsin severalplications,including cerebralvasospasm,associated withhigh mortality.Although cerebralvasospasm isa majorcause ofbrain damagesafter SAH,other factorssuch asinflammatory responsesand oxidativestress alsocontribute tohigh mortalityafter SAH.Trehalose isa non-reducing disaharidein whichtwo glucoseunits arelinked by,-1,1-glycosidic bond,and hasbeen shownto inducetolerance toa varietyof stressorsin numerousorganisms.In thepresentstudy,we investigatedthe effectof trehaloseon cerebralvasospasm,inflammatory responses,and oxidativestress inducedby bloodin vitroand in vivo.trehalose hassuppressive effectson severalpathological ventsafter SAH,including vasospasm,inflammatory responses,and lipidperoxidation.Trehalose maybe anew therapeuticapproach fortreatment ofplications afterSAH.properties withinthe cerebrospinalfluid aftersubarachnoidhemorrhagein vivo and in vitro Tofunctionally characterizepro-inflammatory andvasoconstrictive properties of cerebrospinalfluid afteraneurysmalsubarachnoidhemorrhage(SAH)invivoand invitro.We functionallycharacterized inflammatoryand vasoactivepropertiesofpatientsCSF afterSAH invivoandinvitro.This pro-inflammatory milieuinthesubarachnoidspacemight playa pivotalrole inthe pathophysiologyof earlyand delayedbraininjuryas wellas vasospasmdevelopment following SAH.研究内容小鼠体内内源性调节性T细胞对蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管痉挛的影响小鼠体内内源性调节性T细胞移植SAH后神经功能预后的改善作用小鼠体内内源性调节性T细胞移植对SAH后炎症反应的影响每项研究内容均分4组 1、Tregs删除组 2、SAH模型组 3、假手术组 4、PBS腹腔注射组体重、窝别、喂养方法相同的小鼠随机分组每组1015只小鼠；每只小鼠编号后按计算机随机表分4组，双盲（研究者、负责资料收集和分析的人员也不了解分组情况）较好地避免了偏倚。 研究方法实验动物处理 1、Tregs删除腹腔注射0.25mg CD25特异性抗体小鼠加入肝素抗凝Hanks液洗涤、ELS裂解注射后第2天取外周血加入标记的抗细胞表面特异性抗原的抗体PBS洗两遍 2、SAH模型制作感觉有阻力时再继续前进3mm,总进入长度约为10mm(已刺破动脉壁）然后迅速将线栓拔出，动脉血灌入，造成蛛网膜下腔出血将制备的线栓通过切口经颈动脉插入颈内动脉，一直送至大脑前动脉与大脑中动脉的分叉处（类似大脑中动脉阻断的方法）首先制作线栓（5-0单丝尼龙线，头端磨成子弹头状，总长度15mm，直径0.2mm） 3、假手术遇到阻力即停止继续插入，并迅速退出线栓 4、PBS腹腔注射经腹腔注射与0.25mg CD25特异性抗体等体积的PBS。 一、内源性调节性T细胞对蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管痉挛的检测内容Text基底动脉形态学检测脑动脉匀浆液中一氧化氮合酶mRNA和蛋白含量；NO含量；cGMP含量局部脑血流量循环内皮细胞检测基底动脉形态学检测脑动脉匀浆液中一氧化氮合酶mRNA和蛋白含量；NO含量；cGMP含量局部脑血流量循环内皮细胞检测检测内容局部脑血流量（regional cerebralblood flow,rCBF）检测颅骨开窗，在立体定向仪控制下，在SAH前及SAH后12小时内（或6小时）用激光多普勒血流计动态测量动物顶叶皮层rCBF。 基底动脉形态学检测 1、立体显微镜下观察基底动脉（BA）、大脑中动脉（MCA）和大脑前动脉（ACA）并记录它们的直径 2、冰冻切片上显微镜下观察基底动脉形态学变化，用图像分析仪测定基底动脉内径、外径与管腔横截面积改用10明胶和墨水混合液灌注13.5mlmin)15s于SAH后2天、2周，经心脏灌注，10福尔马林灌注（5.5mlmin）min后循环内皮细胞检测于SAH后3天、2周取静脉血标本，用因子相关抗原免疫荧光染色检测循环内皮细胞（circulating endothelialcell,CEC），以反映血管内皮细胞的损伤。 于SAH后3天、2周，取动物脑底Willis动脉环及其相连的动脉制备匀浆液PCR、Western blot等检测脑动脉匀浆液中一氧化氮合酶（nitric oxidesynthase,NOS）mRNA和蛋白含量硝酸酶还原法测定NO含量放射免疫分析法测定cGMP含量 二、内源性调节性T细胞移植SAH后神经功能预后的改善作用运动评分共12分感觉评分（515分）认知功能障碍评估SAH后后神经功能预后的评估振动觉（13分）触觉（13分）视觉（13分）对刺激的触激反应（13分）嗅觉（13分）感觉评分运动评分平衡和协调能力（33分）随意活动（3分）运动评分攀爬能力（33分）肢体活动对称性（3分）?认知功能障碍评估在2次测试中的后一次测试中，将平台移去，让动物游泳30秒，计算动物到达目标象限（原来放置平台的位置）所花费的时间和游泳速度。 在术后3天和2周，对大鼠每天测试4次术后第2天在无平台情况下将大鼠放于Morris水迷宫进行驯化二次数据表示为动物找到沉水的平台所需要的时间（潜伏期）如树突状细胞、小胶质细胞及嗜中性粒细胞（Gr1抗体染中性粒细胞），染中心粒细胞时用GFAP（胶质细胞）、CD31（血管内皮细胞）MMP-9+血管长度（MMP-9与CD31双标记）检测Toll样受体TLR2和TLR4在基因和蛋白水平的表达检测其下游信号分子如TRAK 1、TRAF 6、NF-B、TNF-、IL-1、IL- 6、MCP-1等在蛋白水平的表达中性粒细胞计数、淋巴细胞等计数血液标本检测有关免疫和炎性细胞因子如TNF-、IL-1、IL- 6、IL- 10、TGF-、MCP-1等变化（其中IL-10和TGF-为Tregs所分泌的抗炎