游仆虫第一类肽链释放因子N、C结构域的结构与功能分析

游仆虫第一类肽链释放因子N、C结构域的结构与功能分析【摘要】：在蛋白质合成的过程中,当三个终止密码子UAA、UAG或UGA中的任意一个出现时,蛋白质合成即终止。终止密码子是由第一类肽链释放因子识别的。在真核生物中,eRF1可以识别三个终止密码子,并催化新生肽链与位于核糖体P-位点的tRNA之间的酯键水解,释放新生肽链。随后,eRF3促使eRF1从核糖体上脱离。绝大多数真核生物只有一种第一类肽链释放因子eRF1,真核生物的eRF1在蛋白质一级结构上极为相似,人的第一类肽链释放因子eRF1在晶体结构和溶液中都包含三个结构域(N,M和C结构域)。N结构域在核糖体A位点识别终止密码子,M结构域与肽酰转移酶中心相互作用,通过高度保守的GGQ模块对肽酰-tRNA的酯键进行亲核进攻,使酯键水解释放新生肽链,C结构域则是与第二类肽链释放因子eRF3结合的主要区域。两类肽链释放因子都是终止过程中的关键因子,在终止密码子的识别过程中eRF3与eRF1耦合成为翻译过程的校读因子,并有效地完成新生肽链的释放过程。有些生物偏离了遗传密码体系称为遗传密码变异生物(variantcodeorganisms),例如：纤毛虫中的游仆虫和赭纤虫都是遗传密码发生变异的生物,使用UAA和UAG作为终止密码子,而将UGA重新解码为有义密码子,UGA在八肋游仆虫(Euplotesoctocarinatus)中被重新解码为半胱氨酸,而在日本赭纤虫(Blepharismajaponicum)中UGA则被重新解码为色氨酸。遗传密码变异生物的eRF1与标准遗传编码生物(standardcodeorganisms)的eRF1高度同源,而局部的不同可能正是导致功能差异的原因。这些在标准遗传编码生物中高度保守,而在遗传密码变异生物中保守性降低的模体可能正是密码子识别的关键位点。与大多数真核生物不同,八肋游仆虫中有两种第一类肽链释放因子,分别为Eo-eRF1a和Eo-eRF1b。Eo-eRF1b基因的阅读框中有三个终止密码子UGA,将其突变为有义密码子才能在体外表达。本研究将Eo-eRF1b基因阅读框中的三个终止密码子UGA突变为半胱氨酸密码子,并分别对八肋游仆虫第一类肽链释放因子(Eo-eRF1a和Eo-eRF1b)以及日本赭纤虫第一类肽链释放因子(Bj-eRF1)的N、C结构域及全长蛋白进行了克隆、表达、纯化和鉴定。Eo-eRF3Cm6为八肋游仆虫第二类肽链释放因子Eo-eRF3的一种截短肽,本课题组前期工作已证明Eo-eRF3Cm6是八肋游仆虫第二类肽链释放因子Eo-eRF3与八肋游仆虫第一类肽链释放因子Eo-eRF1a相互作用的最短肽,本研究利用体外pulldown实验证明两种纤毛虫第一类肽链释放因子及其C结构域都可以与Eo-eRF3Cm6结合形成复合物。大多数蛋白都有发色基团,蛋白质内源荧光光谱的变化可以反映蛋白质构象的变化。本研究中的两种纤毛虫第一类肽链释放因子(Bj-eRF1、Eo-eRF1a和Eo-eRF1b)的N、C结构域上各含有一个高度保守的色氨酸,荧光光谱结果表明,N结构域上的色氨酸所处的微环境较为亲水,而C结构域上的色氨酸所处的微环境较为疏水。当与Eo-eRF3Cm6结合形成复合物,Eo-eRF1a、Eo-eRF1b和Bj-eRF1的最大发射波长发生蓝移(从340nm蓝移到330nm),表明第一类肽链释放因子的构象发生了变化。eRF1-eRF3相互作用的部位在eRF1C结构域上,Eo-eRF3Cm6与eRF1的C结构域结合后,Eo-eRF1a、Eo-eRF1b和Bj-eRF1的C结构域的最大发射波长没有发生蓝移。通过对荧光淬灭光谱的分析,结果表明：与Eo-eRF3Cm6结合以后,eRF1及其C结构域的淬灭常数和可淬灭分数都有不同程度的降低,表明其上色氨酸的微环境转为疏水。实验结果说明,与Eo-eRF3Cm6结合后,eRF1最大发射波长发生蓝移是由于eRF1上N、C结构域之间发生了相互作用。为了更深入地对eRF1-eRF3相互作用进行分析,我们对八肋游仆虫第一类肽链释放因子(Eo-eRF1a和Eo-eRF1b)以及日本赭纤虫第一类肽链释放因子(Bj-eRF1)的N、C结构域进行了基于同源建模的计算机模拟分析并对C结构域上与eRF1-eRF3相互作用的可能位点进行实验验证。对C结构域的模拟表明,Eo-eRF1a/bC结构域上高度保守的位点I290和D293(Bj-eRF1中为V294和D297)以及高度保守的GVEDT和GFGG模体直接参与eRF1-eRF3相互作用。本实验通过对eRF1上保守位点进行定点突变,用Eo-eRF3Cm6诱饵蛋白与突变蛋白进行体外pulldown和Westernblotting检测,实验结果可以评估突变位点对eRF1-eRF3相互作用的贡献,以及发生作用的主要方式。Bj-eRF1中的V294在其他物种中为Ile,当把V294回复突变为Ile,对Bj-eRF1与Eo-eRF3Cm6的相互作用影响不大,但是当该位点突变为Ala,Bj-eRF1、Eo-eRF1a和Eo-eRF1b与Eo-eRF3Cm6的结合能力都大为下降。因此Eo-eRF1a/bC结构域上1290(Bj-eRF1中为V294)是eRFIC与Eo-eRF3Cm6相互作用的关键位点,该位点上侧链残基的位阻作用对复合物的稳定是十分重要的。另一个保守位点是Asp(Eo-eRF1a/b中为D293,Bj-eRF1中为D297),计算机模拟的结果表明,在三个eRF1C/Eo-eRF3Cm6复合物中,Asp都是形成氢键的位点。对这个保守位点的定点突变表明,在复合物Eo-eRF1bC/Eo-eRF3Cm6以及Bj-eRF1C/Eo-eRF3Cm6中,保守位点D293上静电相互作用和氢键缔合对形成复合物的影响较大。但在Eo-eRF1aC/Eo-eRF3Cm6的复合物中,且该位点上静电相互作用与氢键缔合作用对形成复合物的影响比较小。当将这一位点突变为A1a时,突变蛋白与Eo-eRF3Cm6的结合能力也大大降低。此外,对模拟结果中Eo-eRF1a、Eo-eRF1b和Bj-eRF1的C结构域与Eo-eRF3Cm6相结合前后的体系的总静电相互作用能和非键相互作用能的变化进行分析,结果表明Eo-eRF1a/Eo-eRF3Cm6复合物中静电相互作用能比Eo-eRF1bC/Eo-eRF3Cm6复合物和Bj-eRF1C/Eo-eRF3Cm6复合物中静电相互作用能大。在不同的盐浓度下对复合物进行共振光散射光谱研究,结果表明Eo-eRF1a/Eo-eRF3Cm6复合物对盐浓度更为敏感。从上面的结果可以看出,在与Eo-eRF3Cm6相互作用的过程中Eo-eRF1b和Bj-eRF1C结构域的行为比较接近,而Eo-eRF1aC结构域则与前两者存在差异,表明在与Eo-eRF3Cm6相互作用的过程中Eo-eRF1a可能选择了不同于Eo-eRF1b的方式。对eRF1N结构域突变体的构象进行模拟,并结合其生物功能的变化对eRF1N结构域识别密码子的功能进行分析。尽管突变位点的静电作用能和氢键发生了明显的变化,但是与eRF1识别密码子功能的回复并没有明显的相关性。值得注意的是在TASNIKS模块和eRF1C结构域之间有一个构象灵活的loop(95-103),推测这个1oop可能与密码子的识别有关。【关键词】：第一类肽链释放因子eRF1-eRF3相互作用荧光光谱计算机模拟【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：Q753【目录】：中文摘要12-15ABSTRACT15-19第一章文献综述19-461.引言19-202.第一类肽链释放因子的结构与功能20-282.1.第一类肽链释放因子的结构20-222.1.1.第一类肽链释放因子的tRNA-mimicry模型202.1.2.第一类肽链释放因子的晶体结构20-222.2.第一类肽链释放因子的功能22-282.2.1.第一类肽链释放因子是如何解码的?22-242.2.2.第一类肽链释放因子是如何释放新生肽链的?24-262.2.3.第一类肽链释放因子与其它蛋白质因子的相互作用26-272.2.4.第一类肽链释放因子结构域间的相互作用及信号的传导27-283.研究材料纤毛虫28-304.研究方法30-344.1蛋白质荧光光谱30-324.1.1.荧光淬灭的机理30-314.1.2.荧光淬灭的应用31-324.2基于同源建模的计算机模拟32-344.2.1.同源建模32-334.2.2.分子动力学优化33-344.2.3.分子对接345.研究目的和意义34-36参考文献36-46第二章游仆虫第一类肽链释放因子eRF1N、C结构域的构建、表达和纯化46-631.引言46-472.材料与方法47-542.1.实验材料47-492.1.1.主要实验设备472.1.2.菌株和质粒472.1.3.寡聚核苷酸47-492.1.4.主要酶及生化试剂492.2.实验方法49-542.2.1.Eo-eRF1b阅读框内无义密码子的突变49-502.2.2.重组表达质粒的构建50-522.2.3.结构域蛋白的表达与纯化522.2.4.目的蛋白的Westernblotting分析52-532.2.5.两类肽链释放因子体外相互作用的pulldown分析53-543.实验结果54-593.1.Eo-eRF1b阅读框内无义密码子的突变54-553.2.重组表达质粒的构建553.3.重组蛋白的表达与纯化55-583.4.体外相互作用的pulldown分析58-593.5.小结594.讨论59-61参考文献61-63第三章游仆虫第一类肽链释放因子eRF1的荧光光谱分析63-871.引言632.材料与方法63-662.1.实验材料632.1.1.主要实验设备632.1.2.主要化学试剂及配制632.2.实验原理与方法63-663.实验结果66-823.1.游仆虫第一类肽链释放因子eRF1的荧光光谱分析66-733.1.1.发射波长的确定66-683.1.2.内源荧光强度的线形化68-693.1.3.溶液体系对荧光的影响69-713.1.4.蛋白质相互作用对纤毛虫第一类肽链释放因子eRF1荧光光谱的影响71-723.1.5.Bj-eRFl的N结构域聚合对荧光光谱的影响72-733.2.游仆虫第一类肽链释放因子eRF1的淬灭荧光光谱分析73-823.2.1.单重荧光淬灭73-793.2.2.双重荧光淬灭79-824.讨论82-85参考文献85-87第四章游仆虫第一类肽链释放因子C结构域分析87-1051.引言87-882.材料与方法88-892.1.实验材料882.1.1.主要实验设备882.1.2.菌株和质粒882.1.3.寡聚核苷酸882.1.4.主要酶及生化试剂882.2.实验方法88-892.2.1.eRF1C结构域的定点突变882.2.2.蛋白质同源建模88-892.2.3.3D模拟结构的优化策略892.2.4.共振光散射893.结果与讨论89-993.1.计算机模拟89-963.2.突变体的体外相互作用96-983.3.共振光散射98-994.讨论99-103参考文献103-105第五章游仆虫第一类肽链释放因子eRF1N结构域结构与功能的计算机模拟105-1191.引言105-1062.