Folin-酚试剂法测定蛋白质含量

Folin-酚试剂法测定蛋白质含量一、 实验目的 掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理、操作技术 掌握制作标准曲线的要领，并通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量。 提高在严格时间限定下的实验操作能力。二、 实验原理蛋白质分子中酪氨酸可以和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应，此法由folin在1921年开创。1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。第一步：双缩脲反应在碱性溶液中,双缩脲(H2NOCNHCONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的具有双缩脲结构的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。第二步：Folin-酚显色反应Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。蛋白质- Cu2+复合物中所含的带酚羟基的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比较即可求出样品中蛋白质的含量。三、 实验材料（一）样品健康人血清（300倍稀释，正常人血清蛋白质含量：6080 g/L）（二） 试剂牛血清白蛋白标准液（200g/ml），碱性硫酸铜溶液，Folin-酚试剂（三） 仪器与器材V-1100分光光度计，恒温水浴箱，移液管（2mL），洗耳球，试管6支，试管架，加样枪，加样枪架四、 实验步骤（一） 操作步骤 见表1-1 表1-1 folin-酚试剂法定量蛋白质实验步骤步骤操作1.反应体系取6支试管编号，按下表加入试剂，混匀试剂（ml） 空白管 标准管 样品管 1 2 3 4 5 6牛血清白蛋白标准液 - 0.2 0.4 0.6 0.8 -样品液 - - - - - 0.5蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.52.双缩脲反应向各管内分别加入碱性硫酸铜溶液2.0ml，摇匀，室温放置10min3.folin-酚反应向各管加入folin-酚试剂0.2ml，2s内迅速摇匀。40水浴10min后，冷却至室温4.比色测定用500ml波长比色，用1号管作空白对照，读取各管吸光度值，每管重复测三次，求平均值用于绘制标准曲线。（二） 注意事项1. 操作控制：folin-酚试剂加到碱性铜-蛋白质溶液中后，必须立即混匀，使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸被破坏之前2. 时间控制：因反应显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。第1值试管加入2.0ml碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1min后，第2支试管再加入2.0ml碱性硫酸铜，以此类推。余下试剂的加入步骤和检测中，每支试管间均需严格执行1min钟的时间间隔操作。五、 实验结果与分析1. 现象与图片记录 操作现象双缩脲反应：各管内分别加入碱性硫酸铜溶液2.0ml，摇匀，室温放置10min后溶液呈无色透明，无明显现象 folin-酚反应初：各管加入folin-酚试剂0.2ml，2s内迅速摇匀25号试管溶液变黄色，颜色逐渐加深，6号试管黄色深度介于2号和3号试管之间将各试管40水浴10min,冷却至室温25号试管溶液变蓝色，颜色逐渐加深，6号试管蓝色深度介于2号与3号试管之间2. 数据记录 按照表1-1记录各管在500nm波长测得的吸光度值表1-2 500nm波长吸光度值记录测定次数各管吸光度值A500 1 2 3 4 5 6120 0.127 0.275 0.336 0.465 0.1630 0.128 0.275 0.336 0.466 0.1643 0 0.128 0.276 0.336 0.467 0.165各管平均值 0 0.128 0.275 0.336 0.466 0.1643. 绘制标准曲线以A500为纵坐标，牛血清清蛋白标准液为横坐标，根据所得数据描点连线，所绘制曲线如下从图中可以看出线性方程:y=0.003x, 将样品溶液的吸光度（即y值）代入方程，求得样品浓度为55g/ml4. 结果计算血清蛋白浓度(g/ml)=样品蛋白质浓度2300 =55g/ml2300 =33000g/ml = 33g/L 本次实验中所测结果为33g/L，相比较正常范围（6080 g/L），结果明显偏低，故认为此次实验并未成功，问题分析如下5. 问题分析问题解析实验所测血清蛋白浓度偏低1. 洗涤试管后未等试管晾干直接进行实验，导致试管内残留的蒸馏水稀释了样品液2. 使用加样抢移取样品液时可能少量样品液残留于枪头3. Folin-酚反应时因实验室拥堵，器材使用受限，导致反应时间间隔控制不一致，样品液（在第6支试管内）反应时间相对偏过短6. 回顾与反思 Folin-酚试剂法的优缺点有哪些？优点：仪器配置要求较低，使用试剂量少，节约资源 灵敏度相比双缩脲试剂法高缺点：操作步骤多，耗时长 Folin-酚试剂专一性较低，干扰物质多，稳定性差 可能干