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分子信标技术 李舒艳200425038 分子信标简介分子信标的结构分子信标的工作原理分子信标的应用前景与展望 分子信标简介 tyagi和krammer于1996年首次建立 目的是在液相中定量测定靶标序列 基于荧光共振能量转移 fret 设计的一种新型荧光标记核酸探针特殊的发夹结构使得其具有背景信号低 灵敏度高 特异性识别性强的特点广泛应用于分子生物学和生物技术 分子信标的结构 经典分子信标结构包括 1 环状区 长度15 30个碱基的序列 能与目标分子特异结合 2 信标茎杆区 长度为5 8个碱基的互补序列 使得形成发夹结构 3 5端的荧光基团 徳克萨斯红 荧光素等染料 4 3端的猝灭基团 dabcyl 首例分子信标结构示意图 环状区 茎杆区 荧光基团 猝灭基团 分子信标工作原理 无靶标存在下 茎环结构使得荧光基团和猝灭基团相互靠近 发生fret 荧光猝灭 荧光背景极低 加入靶序列后 分子信标与完全互补靶序列形成刚性并且更加稳定的双链杂交体 使得荧光基团和猝灭基团距离增大 阻止了fret的发生 荧光恢复 影响分子信标的因素 荧光 猝灭基团间的距离的影响环境ph值的影响ph过高时 茎干区碱基对之间的稳定结合被破坏 分子信标变性 荧光基团与猝灭基团分开产生荧光 e fret效率r 荧光给体与受体之间的距离 温度对分子信标的影响 波长转移分子信标 表面固定分子信标 量子点分子信标 分子信标的应用 核酸的检测分析实时定量pcr测定靶标浓度活体内核酸的动态检测同时检测多个靶核苷酸检测双链dna研究dna 蛋白质的相互作用用于核酸酶的研究用于研究dna 蛋白质的相互作用用作生物芯片和生物传感器 双链dna检测 demidov v v 2001 pd looptechnology pnaopenersatwork expertrev mol diagn 1 343 351 pna与双链dna互补链结合时可以取代非互补链 使之解链以单链的形式存在 形成p 环结构 特定序列的dna或pna分子信标可以与双链dna的变性部分结合 分别形成pd 或pp 环型化合物 分子信标结构被破坏 出现荧光响应 最近的实验结果表明 利用茎 环结构的dna分子信标或无茎的pna分子信标可以实时检测pna与双链dna的结合位点 humanosteosarcomacellnucleus u2oscellline vitallyinjectedwithacy3 labelledprobespecificforchromosomaltelomericrepeatsequenes notethatsomespotsarerelativelylargesuggestingassociationorclusteringofmultipletelomeres molenaarcet el visualizingtelomeredynamicsinlivingmammaliancellsusingpnaprobes emboj2003 24 6631 6641 whitcombe设计的一种将 引物与分子信标相结合的蝎状引物荧光探针 在该探针中 引物与分子信标之间有一间隔臂 使 反应不能往分子信标方向延伸 在 过程中 非特异扩增产物不会产生荧光信号 而当特异性扩增产物生成时 分子信标将立即与其进行分子内杂交 同时发出荧光信号 workingmechanismofthefluorophore quencher labeledmab themabexistsatequilibriumbetweenanonstructuredrandomcoilandacompactintramolecularquadruplex additionofthrombin grayellipse shiftstheequilibriuminfavorofthequadruplexstructure whichdrawsthefluorophore f andquencher q closer leadingtofluorescencequenching theworkingmechanismofthedonor acceptor labeledmabissimilartothequench typemab thearrowsofthebackboneoftheoligonucleotidesindicatethe5 3polarityofdna chaoyongjamesyangetal chaoyongjamesyang mauriciopinto kirkschanze andweihongtan angew chem int ed 2005 44 2572 2576 前景与展望 近年来 分子信标技术得以飞速发展 已渗透到结构和分子生物学 基因和生