分析化验工理论培训讲义(分光光度法及色谱法部分).doc

紫外可见分光光度法1、概述：基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法。许多物质都是具有颜色的，当含有这些物质的溶液浓度改变时，溶液颜色的深浅度也就随着改变。溶液越浓颜色愈深，溶液越稀颜色愈浅。因此可以利用比较溶液颜色深浅的方法来确定溶液中有色物质的含量。最初人们发现溶液的颜色随着浓度的增加而加深，因此出现了“目视比色法”。以后人们又认识到溶液的颜色是由于对光的选择性吸收而产生的，可以利用滤光片和光电池客观的测量溶液的浓度，从而出现了“光电比色法”。随着测试仪器的发展，用分光光度计代替比色计，出现了“分光光度法”。“目视比色法”-“光电比色法”-“分光光度法”特点：灵敏度高：适于微量组分的测定，一般可测定10-6g级的物质。准确度较高：其相对误差一般在1%5%之内。适用范围广；方法简便，操作容易、分析速度快、仪器价格不昂贵，应用广泛。我们实验室多见。2、分光光度法的原理2.1、溶液颜色与光的关系光是一种电磁辐射，在同一介质中直线传播，而且具有恒定的速度（3*108m/s）。光具有一定的波长和频率，人们眼睛能感觉到的光是可见光，它只是电磁辐射中的一小部分，见P73 表13-1电磁波谱范围表。光谱名称波长跃迁类型分析方法r射线伦琴射线,X射线10-110nmK和L层电子X射线光谱法紫外光区域远紫外区10200nm中层电子真空紫外光度法近紫外区200380nm价电子紫外光度法可见线（紫）380780nm（红）价电子比色及可见光度法红外光区域近红外线0.782.5um分子振动近红外光谱法中红外线2.55.0um分子振动中红外光谱法远红外线5.01000um分子转动和低位振动远红外光谱法微波0.1100cm分子转动微波光谱法无线电波11000m核磁共振光谱法可见光：400760nm，人眼可察觉到的。当电磁波的波长小于400nm时称为紫外光，大于760nm的称为红外光，都是人们不能察觉到的。不同波长的可见光可使眼睛感觉到不同的颜色。日常所见的白光，如日光、白炽灯光，都是混合光，即通过光学棱镜时，可得到不同颜色的谱带即光谱，白光经色散后成为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七色光-“彩虹现象”，说明白光是由这七种颜色的光按一定比例混合而成的，所以叫复合光。将白光中不同颜色的光彼此分开，即可得到不同波长的单色光。如果只把白光中某一颜色的光分离出去，剩余的各种波长的混合光将不再是白光，而是呈现一定的颜色，这两种颜色称为“互补色”。换句话说，若两种适当颜色的光，按一定的强度比例混合后能得到白光，这两种颜色的光称为互补色光。光的互补关系示于图：补充说明：红色光对应的是可见光波长较大的区域：（我处上海菁华752、722顺时针是增大波长，逆时针转动波长可见七色光（记760400nm）。许多物质都是有颜色的，如CuSO4是蓝色的，含三价铁离子溶液是黄色的。物质呈现的颜色与光有着密切的关系。物质所以呈现不同的颜色，是由于物质对不同波长的光具有不同程度的透射或反射。由于色光的互补，所以物质呈现出所吸收光的互补色。CuSO4吸收黄色光，呈现蓝色；而三价铁离子溶液吸收蓝色，所以呈现黄色。物质吸收哪种颜色的光取决于物质的内部结构，也决定光的能量。物质对光的选择吸收特性可以用吸收曲线来描绘。P75从图中可以看出，物质在某一波长处对光吸收最强，称为最大吸收峰，对应的波长称为最大吸收波长（Max）；低于最高吸收峰称为次峰，曲线中的低谷称为波谷，其所对应的波长称为最小吸收波长。同一物质的浓度不同时，光吸收曲线形状相同，最大吸收波长不变，只是相应的吸光度大小不同。物质不同，其分子结构不同，则吸收光谱曲线不同，所以可根据吸收光谱曲线对物质进行定性鉴定和结构分析。怎么定量？2.2、光吸收定律看一下光通过溶液的情况：当一波长的光通过一均匀的有色溶液时，一部分光被反射，一部分光被吸收，一部分光透过溶液。I0=Ir+IA+It同种材质的吸收池，反射光的强度是不变的，由于反射所引起的误差互相抵消。因此上式简化为：I0=IA+It式中IA越大即说明对光的吸收得越强，也就是透过光It的强度越小，光减弱的越多。吸光光度分析法的实质是测量透过光强度的变化（It）。透过光强度的改变是与有色溶液浓度c和液层厚度b有关。也就是溶液浓度愈大，液层愈厚，透过的光愈少。光吸收定律：也称为朗伯比耳定律，一束平行的单色光通过有色溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度和透光液层厚度的乘积成正比。数学表达式：A=KCb两个定律合在一起，朗伯定律（液层厚度），比尔定律（溶液浓度）。透射比的概念：透射光强度It与入射光强度I0之比称为透射比，用T表示：透射比的倒数的对数为吸光度：2.3、摩尔吸收系数在光吸收定律中，比例常数K与溶液的性质、入射光波长有关。如果浓度C单位为moL/L，液层厚度单位为cm，则K称为摩尔吸收系数，用表示，A=Cb，单位为L/(molcm)，通过测量吸光度值，再经过计算求得。例题：用邻菲罗啉显色测铁，已知试液的浓度为8.910-6mol/L，吸收池厚度为1cm，在波长510nm处测得吸光度为0.099，计算邻菲罗啉铁配合物的摩尔吸光系数。解：A=Cb=A/Cb=0.099/8.910-61.0=1.1104L/(molcm)摩尔吸收系数表示物质对某一特定波长光的吸收能力。愈大表示该物质对某波长光的吸收能力愈强，测定的灵敏度也就愈高。因此进行测定时，为了提高分析的灵敏度，必须选择摩尔吸收系数大的有色化合物进行测定，并要选择具有最大值的波长。根据所测溶液浓度使用不同单位，还有其它吸收系数，如比吸收系数Ecm%（C用g/100mL,b用cm）。2.4、光吸收定律的适用范围2.4.1、光吸收定律只适用于单色光。而目前各种分光光度计得到的入射光实质上都是某一波段的复合光，通常选择物质的最大吸收波长的光为入射光，这样可以保证测定灵敏度高。2.4.2、光吸收定律只适用于稀溶液。它只适用于浓度小于0.01mol/L的稀溶液，溶液浓度较高，将会引起摩尔吸光系数改变，导致偏离比尔定律。因此控制0.01mol/L以下。2.4.3、光吸收定律也适用于波此不相互作用的多组分溶液，它们的吸光度具有加和性：即A总=A1+A2+.+An2.4.4、要严格控制显色反应条件，避免溶液发生化学变化。3、显色反应及影响因素分光光度分析有两种，一种是利用物质本身对紫外及可见光的吸收进行测定“直接法”，另一种是生成有色化合物即“显色”以后测定“间接法”。第一种方法因强度较弱所以直接用于定量分析的较少。加入显色剂使待测物质转化为在近紫外和可见光区有吸收的化合物来进行光度测定，是分光光度分析的主要方法。3.1、显色反应将无色的待测物质转变成有色物质的化学反应。显色反应通常是氧化还原反应，或者是配位反应。M + R - MR被测物 显色剂 有色化合物（无色）对显色反应的要求：A、选择性好，一种显色剂最好只与一种被测组分起显色反应，干扰少或容易消除干扰。B、灵敏度要高，要求生成的有色化合物摩尔吸光系数越大越好。C、生成的有色化合物组成要恒定，符合一定的化学式。D、生成的有色化合物要稳定。E、显色反应的条件要易于控制。如条件要求过于严，难于控制，再现性差。3.2、显色剂及其分类两类：无机显色剂，有机显色剂（主要）。3.2.1无机显色剂。许多无机试剂与金属离子发生显色反应，如Cu2+与NH3形成深兰色配合物，Fe3+与CNS-形成红色配合物等。但多数配合物组成不恒定，也不稳定，反应的灵敏度不高，选择性较差，目前应用的不多。尚有实际应用价值的无机显色剂有：a硫氰酸盐 常用于Fe、Mo、W、Nb等元素的测定；b钼酸铵 常用于Si、P、As、V等元素的测定；c过氧化氢 常用于Ti的测定。3.2.2有机显色剂。许多有机显色剂与金属离子生成稳定的配合物，具有鲜明而特征的颜色，反应灵敏度较高。其中不少配合物易溶于有机溶剂，可以萃取后再进行分光光度测定，以提高反应的灵敏度和选择性。有机显色剂的种类很多。而且不断新的衍生。P1003.3、影响显色反应的因素3.3.1、显色剂用量。为了保证显色反应完全，要加入过量的显色剂，但是显色剂过量太多，有时会引起副反应，或改变有色配合物的配位比，适宜用量通过实验测得、作A-R曲线（吸光度A显色剂用量R曲线）显色剂的用量只能在ab之间，一般取a与b的中间值。3.3.2、溶液酸度的影响M + R - MR被测物 显色剂 有色化合物溶液的酸度对光度测定有显著影响，它影响待测组分的吸收光谱、显色剂的形态、待测组分的化合状态及显色化合物的组成。具体表现在以下几个方面：3.3.2.1、对被测离子的有效浓度的影响。被测离子完全以离子状态存在时才有利于显色反应进行完全。但是，许多离子如Al3+、Fe3+及稀土元素离子等，易发生水解。当PH值大时，这些离子将生成氢氧化物沉淀而降低其有效浓度。所以从这种情况考虑，就要求显色的PH值要小。3.3.2.2、对显色剂的有效浓度的影响。（两类？）有机显色剂大多是有机弱酸或弱碱，它们的离解度是由溶液的PH值所决定的。而显色剂的离解程度直接影响显色反应的完全程度。3.3.2.3、对显色剂颜色的影响。许多有机显色剂往往又是一种酸碱指示剂，所以其颜色会随PH值的改变而变化。如显色剂PAR（4-(2-吡啶偶氮)-间苯二酚）（P100）是一种二元酸，它的颜色与PH值的关系：PH2.14.2时，黄色，PH47时，橙色，PH10，红色。PAR可用于多种金属离子的显色剂，都生成红色配合物，所以这种显色剂不能在碱性溶液中使用。否则，因显色剂本身颜色与金属配合物的颜色相同或相近，将无法进行分析。3.3.2.4、对配合物组成的影响。酸度不同时，显色化合物的组成和颜色可能不同。当一种离子与显色剂可以形成2种以上组成不同的配合物时，究竟形成何种配合物，往往取决于溶液的PH值。例如测量循环冷却水中铁含量的测定方法：磺基水杨酸与Fe3+在不同PH值时，形成组成不同、颜色也不同的配合物，以Sal代表水杨酸的阴离子：P103PH=1.82.5Fe(Sal)+紫红色PH=48Fe(Sal)2-紫红色PH=811.5Fe(Sal)33-黄色这是因为水杨酸是一弱酸，随着PH值增大，Sal2-亦增大，故易形成含Sal2-数目较多的配合物。总之，PH值对显色反应的影响很大，而且是多方面的。在实际工作中，确定显色反应PH值的方法是：首先应用理论知识作出原则性判断，然后，更主要的是通过实验作出“A-PH曲线”进而最后确定。类似前述（显色剂用量）。PH值的控制一般是加入适量的PH值缓冲溶液。3.3.3、溶液温度的影响温度是影响化学反应的重要因素之一，当然也影响显色反应。大多数显色反应在常温下进行，但有些反应必须在较高温度下才能进行或才能较快的进行。显色反应温度的确定，也可按照上述A-R、A-PH曲线类似作A-T 曲线来选择合适的温度。3.3.4、显色时间化学反应需要一定的时间才能完成，同时有些化学反应随着时间的延长，又有新的反应发生。所以在显色反应中，应该从两个方面来考虑时间的影响。一是显色反应完成所需的时间，称显色时间；另一是配合物保持稳定的时间，称稳定时间。显色时间是由显色反应的本质决定的，而且与温度有很大关系。一般显色反应大多数是瞬间完成的，但有些反应则需要较长时间才能完成。显色后的稳定时间是由配合物的性质决定的。由于空气中的氧或日光作用，或其他原因，往往使生成物发生化学变化而使溶液颜色减退，称为退色。各种配合物的稳定时间有很大悬殊，例如硅钼蓝可稳定数十小时，而用对苯二酚测钨的显色溶液，只能稳定20min。把握原则：测定吸光度或进行比色操作时时，应该在充分显色后，于稳定时间以内进行测定。综上所述：影响显色反应的因素是多方面的（量、酸、温、时）。而在一个具体的显色反应中，这些因素中可能有一个或数个是主要的，其他是次要的，应该具体问题具体分析，根据具体情况选择最适宜的显色反应条件。3.4、干扰离子的影响及消除3.4.1、影响-来自于哪些方面3.4.1.1、干扰离子本身有颜色。如Fe3+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Cr3+等离子，本身的颜色较深，干扰被测离子的测定。3.4.1.2、干扰离子本身无颜色，但能与显色剂反应生成稳定的配合物。若配合物有色则直接干扰测定；若配合物无色，也降低了显色剂的浓度，影响被测离子与显色剂的反应，从而产生误差。3.4.1.3、干扰离子与被测离子反应，生成配合物或沉淀。3.4.1.4、与试剂生成有色配合物。如用钼蓝法测硅时，磷也能生成磷钼蓝，使结果偏高。3.4.2、消除为了消除干扰离子的影响，可采取下面几种方法：3.4.2.1、控制溶液的酸度。前面讲过，溶液的酸度是影响显色反应的重要因素。当有干扰离子存在时，可以控制溶液的酸度，让被测离子与显色剂的反应进行完全，而让干扰离子与显色剂的反应不能进行。3.4.2.2、加入掩蔽剂与干扰离子形成更稳定的化合物，使干扰离子不再产生干扰。3.4.2.3、利用氧化还原反应改变干扰离子的价态，使干扰离子不再与显色剂反应以消除干扰。用铬天青S测定Al3+时，Fe3+有干扰，加入抗坏血酸将Fe3+还原为Fe2+后即可消除干扰。3.4.2.4、利用参比溶液消除某些有色干扰离子的影响。测定试样溶液的吸光度，先用参比溶液调节透光度为100%（吸光度为0），以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。溶剂参比：试样简单、共存其它成分对测定波长吸收弱被测溶液中无其它有色离子时，只考虑消除溶剂与吸收池等因素。往往用蒸馏水即可。试剂参比：如果显色剂或其它试剂有颜色而在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。试样参比（或称试液参比）：显色剂无色，被测溶液中有其它有色离子而在测定波长有吸收时，可采用不加显色剂的被测溶液作参比溶液。其他参比：显色剂有色，试样中存在有色干拢离子，可在一份试样中加入适当的掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，然后加入显色剂和其它试剂，以此作为参比溶液。3.4.2.5、选择适当的波长以消除干扰。通常把工作波长选在最大吸收波长处，但有时为了消除干扰，而把工作波长移至次要的吸收峰。即满足.又消除.。3.4.2.6、采用适当的分离方法。如果没有消除干扰的恰当方法，可以采用沉淀、萃取等分离方法。操作麻烦，万不得已。4、分光光度分析的定量方法分光光度分析的定量依据是光吸收定律，但具体的操作方法却有多种。4.1、目视比色法目视比色法简单、方便，在准确度要求不高的场合仍然适用。将试样和标样在相同条件下显色，在同样的比色管中观察颜色深度，当试样和标样的颜色相等时，被测试样的浓度与标样浓度相等。A标=K标C标b标A测=K测C测b测当被测与标准颜色一至时，A相等，同一种有色物，同样的入射光，所以K相等，而所用的液层厚度等，所以b相等。在应用目视比色法时，应注意以下几点：A、光源 目视比色法的光源是太阳光，在夜间或光线不足时用日光灯光源，尽量在阳光充足又不直射的条件下进行目视比色测定。B、比色管 比色管的质量直接影响目视比色的结果。要求各个比色管玻璃颜色要一致、各比色管的几何尺寸要一致，即直径相同，刻度的高度相等。C、人眼的观测误差 眼睛对光的波长（颜色）和光的强度（颜色深度）有一定的鉴别能力，但不能准确给出定量结果。再加上各人的差异，因此目视比色法的主观误差较大，准确度不高。可在试样的浓度附近多配几个标样，间隔小一些，来提高测定的准确度。主要用于合格不合格判断。配合格标样一个。.4.2、工作曲线法工作曲线法也称标准曲线法，适用于大量重复的样品分析，是工厂控制分析中应用最多的方法。根据光吸收定律（数学表达式：A=Kcb），对于一种有色化合物，K是一个定值，若把光程b也固定，那么吸光度A就和溶液的浓度C成正比，也就是说吸光度A和浓度c呈线性关系。选择配制一系列适当浓度的标准溶液，显色后分别测定其吸光度，把吸光度A对浓度c作图，即得工作曲线，也叫标准曲线。然后将被测组分在同样条件下显色，测得吸光度后在工作曲线上查得被测组分的浓度（或通过回归方程计算出被测组分的浓度）。我们处见不到，但要求会做，下去用座标纸自己绘一下。在实际使用时要注意以下几点：A、工作曲线一旦绘制好后，都要应用一段较长的时间，因此要求分光光度计的性能稳定，如更换试剂、比色皿或光源灯等，都可能引起工作曲线的变化，都应及时校正和检验工作曲线。B、光吸收定律只适用于稀溶液，工作曲线只在一定浓度范围内呈直线，所以工作曲线不能随意延长。如果试样的浓度超出了工作曲线的范围，应采用稀释的方法。使用回归方程要注意：最大A值。C、正常情况下工作曲线应是一条通过原点的直线（重画一条示范）。若工作曲线不通过原点，通常是由于标样与参比溶液的组成不同，即背景对光的吸收不同造成的。为避免这种现象，应选择与标样组成相近的参比溶液。D、从吸光度测量误差来考虑，不同的吸光度读数对测定带来不同的误差。分光光度计上的吸光度的标尺刻度是不均匀的，所以标尺上各个部位对应的浓度测量误差是不同的。一般来说，吸光度在0.20.8范围内（透射比为63%16%）时，浓度测量的相对误差较小，当吸光度A=0.43（透射比T=37.2%）时，浓度测量的相对误差最小。因此应选择适当的测量条件（调节溶液浓度，或不同厚度比色皿），让测得的吸光度值在这个范围，减少测量误差。E、选到合适的狭缝宽度。狭缝宽度直接影响测定的灵敏度和工作曲线的线性范围。狭缝宽度太大，灵敏度下降，工作曲线的线性范围变窄；狭缝宽度太小，使入射光强度太弱，也不利于测定。选择原则：在不减少吸光度时的最大狭缝宽度。我处不可调。4.3、直接比较法直接比较法的实质也是工作曲线法，是一种简化的工作曲线法（单点校正法）。配一个已知被测组分浓度的标样，测其吸光度值，在同样条件下再测定未知样品的吸光度，通过计算求出未知样品的浓度。操作时应注意配制标样的浓度要接近被测样品的浓度。As=KCsb Ax=KCxb由于溶液性质相同，比色皿厚度一样，所以：As/Ax=Cs/Cx Cx=CsAx/As4.4、标准加入法标准加入法也是工作曲线法的一种特殊应用。选择适当的显色条件，先测定浓度为Cx的未知样品吸光度Ax，再向未知样品中加入一定量的标样，配制成浓度为Cx+C1、Cx+C2.等一系列样品，显色后再测定吸光度为A1、A2.。最后在坐标纸上画图，以吸光度A为纵坐标，以浓度C为横坐标，分别画出C1、C2所对应的A1、A2等各点，连成直线后延长，与横轴的交点Cx的绝对值就是未知样品的浓度。应用标准加入法时要注意，加入的标样浓度要适当，使画出的曲线保持适当的角度，浓度过大或过小都会带来测量误差。总结：定量依据都是光吸收定律。5、分光光度仪器结构分光光度计虽然品种繁多，但根据使用的波长可分为可见分光光度计和紫外分光光度计两种。前者只适用于可见光部分，后者则适用于近紫外和可见光部分。分光光度计按其结构可分为单光束（参阅P88图13-13）、双光束（参阅P88图13-14）和双波长等三种。所谓单光束即是用一束光先后通过参比溶液与被测溶液，然后分别测量透射光的强度。单光束分光光度计构造简单，应用最广，其主要缺点是不能克服由于光源不稳定带来的测量误差。双光束分光光度计是把光源发出的一束光变成两束，同时通过参比溶液与被测溶液，然后同时测量透射光的强度。双光束分光光度计的最大优点则是克服了由于光源不稳定带来的测量误差。双波长分光光度计是最新型的分光光度计，其原理是：波长分别为1和2的两束单色光交替通过同一盛有试样溶液的吸收池，通过在1和2处测得的吸光度差A，由朗伯-比尔定律测定试样中的被测组分，即A=A2- A1=(2-1)Cb式中2和1分别表示在波长2和1处待测物质的摩尔吸光系数，b和c分别表示吸收池的光程(cm)和待测物的摩尔浓度。该法成败的关键是2(通常称测定波长)和1(通常称参比波长)的组合和选择。双波长分光光度法只使用一个吸收池，以样品溶液本身做参比，双波长法消除了传统单波长分光光度法中制备参比溶液及因样品池和参比池不匹配而引起的误差，可用于浑浊试样分析以及两组分或三组分混合物的同时测定而不必分离。不论是哪种分光光度计，都必须有光源、单色器、吸收池、检测器和测量系统等几个部分，新型的分光光度计还配有数据处理系统和打印绘图仪。P83 图13-9 单色器光学系统原理图5.1、光源光源的作用是供给符合要求的入射光，因此对光源部分提出了严格的要求。A、光源发出的波长要满足需要。如对可见分光光度计，要提供400760nm的光，对紫外可见分光光度计要提供200800nm的近紫外和可见光。B、光源的发光强度要足够。否则不能在检测器上产生足够的信号，影响信号的检测和灵敏度。C、光源的发光强度要稳定。在测量期间应保持光强度不变，否则由于光强度不稳，影响测定结果的重复性。在所用的各种光源中，最简单方便的要数太阳光第一，它的波长范围广，光线强度也足够，但只适用于目视比色法，而且受天气影响，在阴雨天气或夜间，还要靠人工光源。对于可见分光光度计，所用的光源为钨丝白炽灯（钨灯）。白炽灯发光的波长范围为3202500nm，能作可见部分和近红外部分的光源。白炽灯的发光强度与稳定性都与供电电压有密切关系。要增加发光强度，只要增大灯丝两端的电压即可。要保证发光强度的稳定性，必须保证供电电源的电压稳定，所以都由稳压电源供电。由于钨灯工作时放出大量的热，为延长钨灯的使用寿命，许多仪器在钨灯座上安装了散热片。钨灯光源的缺点是寿命短，由于是低电压大电流供电，钨丝的发热量很大，容易烧断。对于紫外可见分光光度计，它的光源除了钨丝白炽灯外，还要用氢灯或氘（dao）灯提供紫外部分的光源。5.2、单色器单色器的作用是把光源发出的连续光谱分解成单色光，并能准确方便地取出所需要的波长。这就是我们常说的分光，单色器的作用就是进行分光。如前所述，吸收定律只适用于单色光，如果不是单色光通过溶液的话，将会产生测定误差，所以单色器性能如何是衡量分光光度计性能的重要指标。标志单色器性能的指标是谱带宽度，波长的重复性等，显然谱带宽度越窄越好（要512nm就只分出512nm，要435nm，就只分出435nm），波长的重复性能越小越好。单色器是利用光的色散原理制成的。色散即是复合光变成各种波长单色光的过程，能使复合光变成各种单色光的器件称色散元件。单色器系统即是由色散元件，狭缝和透镜系统组成的，狭缝和透镜系统的作用是调节光的强度，控制光的方向并取出所需波长的单色光。最简单的单色器是滤光片，现在已经被淘汰了。第二种是棱镜单色器，棱镜由玻璃或石英制成，玻璃棱镜色散能力大，但吸收紫外光，只能用于350820nm的分析测定，在紫外区必须用石英棱镜。棱镜单色器的分光能力较差，加上手工调节，波长的重复性也比较差，在可见光区，波长的精度一般为35nm，现在新型的仪器已不用这种单色器了。比较新型的单色器是光栅单色器。光栅即是在一个平面上刻上许多刻痕，形状像“栅栏”一样，每毫米内的刻痕多达上千条。一束平行光射到光栅上，由于光栅的衍射作用（物理知识），反射出来的光就按波长顺序分开了。光栅的刻痕越密，对光的分辩率越高。光栅单色器的分辨率比棱镜单色器高，可达0.2nm.新型的分光光度计已不用手工调整波长，而是用微机控制，只要设定好波长，微机会自动调整至所需的波长。公司分析室的所用分光光度计有棱镜单色器的，也有光栅单色器的。5.3、吸收池吸收池是盛装被测溶液的装置，是单色器与信号检测器之间光路的连接部分。它的作用是让单色器出来的单色光全部进入被测溶液，并且让透过溶液的光全部进入信号检测器。因此要求吸收池的材质对所通过的光是完全透明，即不吸收或只有很少部分吸收。盛装液体样品的吸收池就是我们常说的“比色皿”。比色皿多是长方形，有两个平行的透光面，侧面和底面为毛玻璃。为测定易挥发的溶液，比色皿上部也有加盖玻璃片的。在可见光区用的比色皿，其透光面为光学玻璃（可见光区-光学玻璃），在紫外区用的比色皿，其透光面为石英玻璃（紫外光区-石英玻璃）。这两种比色皿外观一样，千万不要搞错。若是在紫外区用了光学玻璃比色皿，那是测不出吸光度的，因为普通玻璃吸收紫外线。比色皿有不同的规格，即不同的光程：0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0cm，被测溶液颜色深时选光程短的，颜色浅时选择光程长的，尽量把测量的吸光度调整至0.20.8。吸收池的配对：在实际工作中，我们采用如下的校准方法：在测定波长下，于干净的吸收池中装入测定用溶剂，以其中一个为参比，测定其它吸收池的吸光度，若测定的吸光度为零或两个吸收池的吸光度相等，即为配对吸收池，将吸收池磨砂面用铅笔编号（和测试方向）。若不能配对，可选出吸光度最小的吸收池为参比，测定其它吸收池的吸光度，求出修正值。测定样品时，将待测溶液装入校准过的吸收池中，将测得的吸光度值减去该吸收池的修正值即为测定的真实值。5.3.1正确使用比色皿。5.3.1.1要小心保护比色皿的透光面，拿取时手指应捏住毛玻璃面，不要接触透光面。5.3.1.2盛装溶液时，高度为比色皿的2/3处即可。5.3.1.3测试时如表面有残液，应先用滤纸轻触吸去液滴，再用擦镜纸折叠为四层轻轻擦拭至透明，避免硬的物品把透光面划伤。5.3.1.4凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液，不得长期盛放在比色皿中。比色皿在使用后，应立即用水冲洗干净。5.3.1.5不同仪器的比色皿不要混杂串用，以免引起测定误差。5.3.1.6比色皿换向后误差可达47左右，所以在精确测量时，要看准比色皿箭头标志（或自己确定的）。5.3.1.7吸收池（比色皿）的洗涤。根据污染情况，可以用冷的或温热的（4050）阴离子表面活性剂的碳酸钠溶液（2%）浸泡，可加热10min左右。也可用硝酸、重铬酸钾洗液、磷酸三钠、有机溶剂等洗涤。对于有色物质的污染可用HCL(3moL/L)-乙醇（1+1）溶液洗涤。然后用自来水、纯水充分洗净后倒立在纱布或滤纸上控水。不宜用超声波清洗。5.4、检测器吸光光度法要求对通过被测溶液前后的光辐射强度进行准确测量，为此要把光强度转变成电信号，以便于测量和记录，因此分光光度计上的检测器就是一个光电转换器。光电转换器有多种，常用的有：5.4.1、光电池 某些半导体材料在光的照射下会产生光电流，光电流的大小与光强度成正比，利用这种现象可作成光电池，应用最广的是硒光电池。光电流较大，不用放大，光电池的缺点是容易产生疲劳现象，因此不能长时间连续使用。5.4.2、光电管 光电管是一个抽成真空的二极管，其阳极为一金属丝，阴级为半导体材料，阳极与阴极间加有直流电压。当光线照射到阴极上时，阴极表面放出电子，电子在电场作用下流向阳极形成光电流。光电流的大小在一定条件下与照射的光强度成正比。光电管的阴极材料不同，它所响应的波长范围也不同，有的适用于可见光区，有的适用于紫外光区。光电管产生的电流很容易进行放大。光电管的响应灵敏度与波长范围都比硒光电池优越，根据使用不同的波长，选用不同材料阴极的光电管。5.4.3、光电倍增管 光电倍增管相当于一个多阴极的光电管。光线由光射入第一阴极，在阴极表面放出电子。这电子在电场作用下射向第二阴极，在阴极表面放出二次电子。经过几次这样的电子发射，光电流就被放大了许多倍，放大倍数可达108倍。因此光电倍增管的灵敏度很高，适用于微弱光强度的测量，目前应用最广泛。5.4.4、光导管与二极管阵列 光导管即光电二极管，有光照射时二极管导通，没有光照时就不通。二极管阵列就是在2001000nm的波长范围内，一个挨一个地排列上几百个光电二极管，这就扩大了光电管的响应范围。5.5、测量、记录、显示系统光电转换器产生和各种电信号，经过放大等处理后，用一定的方式显示出来，以便于计算和记录。信号显示器有许多种，随着电子技术的发展，这些信号处理系统将越来越先进。数显式、指针式。6、分光光度计的日常维护6.1、在不使用时不要开光源灯（灯寿命）。6.2、将波长调至540640nm检查光斑是否是一个小长方形，光路是否发生偏移。6.3、如果通电后钨灯不亮，或光亮度明显减弱或不稳定，应急时更换新灯。更换新灯时同时用无水乙醇擦拭镜面灰尘（灯泡、反光镜面等）。更换后要微调灯座使入射光正对狭缝。6.4、定期更换仪器内部的干燥剂筒（包），保持其干燥，发现硅胶变色时应立即更换新的或烘干后再用。6.5、吸收池的使用要规范、正确（前述），使用后立即洗涤干净控水备用。6.6、为确保仪器稳定工作，在电压波动较大时，要接一个稳压器。7、分光光度分析法的计算7.1某有色溶液在3.0cm的比色皿测得透光度为40.0%，求比色皿地方厚度为2.0cm时的透光度和吸光度各为多少？解：根据公式A=-lgT,求比色皿为3.0cm时A值：A=-lgT=-lg40%=-lg0.4=0.398又据A=KCbKC=A/b=0.398/3.0当b=2.0时A=KCb=0.398*2.0/3.0=0.265lgT=-A=-0.265 得：T=0.543*100%=54.3%7.2 用邻菲罗啉法测定铁，已知显色液中Fe2+的含量为50ug/100mL，用2.0cm的比色皿，在波长500nm测得吸光度为0.205，计算Fe2+-邻菲罗啉的摩尔吸光系数。（已知1molFe2+生成1molFe2+-邻菲罗啉配合物）。解：根据公式：A=Cb，所以=A/(Cb)根据定义，Fe2+的浓度单位应为mol/L表示，因此需要换算根据题意，Fe2+的浓度就是Fe2+-邻菲罗啉配合物的浓度，因此7.3 用分光光度法测定水中微量铁，取3.0ug/mL的铁标准液10.0mL，显色后稀释至50mL，测得吸光度As=0.460。另取水样25.0mL，显色后也稀释至50mL，测得吸光度Ax=0.410，求水样中的铁的含量（mg/L）？解：根据公式：A=KCb3.0ug/mL的铁标准液10.0mL，即30ug。0.460=30*KbKb=0.460/30样品：0.410=CKbC=0.410/Kb=0.410*30/0.460=26.74ug即25.0mL水样中含铁量26.74ugC=26.74/25=1.06（ug/mL）（mg/L）7.4 有一个含Ni量为0.12%的样品，用丁二酮肟（WO）法测定。已知丁二酮肟-Ni的摩尔吸光系数=1.3104，若配制100mL的试样，在波长470nm处，用1cm的比色皿测定，计算测得的相对误差最小时，应取试样多少克？（Ni=58.70）解：测量的相对误差最小时，吸光度应为0.43，根据光吸收定律A=Cb， 由此可求出测量误差最小时的浓度为：C=A/b=0.43/1.31041=3.3010-5mol/L设应取试样Xg则： 8、作业（不交）：化验员读本下册P140-8题第13页云南开远公司有限公司员工培训方案编号:KYGS/JL03-6.2.2-10培训单位质检部内部培训培训时间2008-12-25培训地点质检部教 员XZB教 材化验员读本学 时紫外可见分光光度法考核办法提高员工理论知识、正确操作、维护分光光度计培训内容1、紫外可见分光光度法概述2、分光光度法的原理3、显色反应及影响因素4、分光光度分析的定量方法5、分光光度仪器结构6、分光光度计的日常维护7、分光光度分析法的计算 填报人:XZB 填报日期:2008-12-29 云南开远公司有限公司培训教案编号:KYGS/JL03-6.2.2-09培训单位质检部内部培训培训时间2008-12-25培训地点质检部教 员XZB培训方式授课方式培训内容概要紫外可见分光光度法培训目的提高员工理论知识、正确操作、维护分光光度计培训详细内容1、紫外可见分光光度法概述2、分光光度法的原理3、显色反应及影响因素4、分光光度分析的定量方法5、分光光度仪器结构6、分光光度计的日常维护7、分光光度分析法的计算 二00八年十二月二十九日1、气相色谱分析1.1、色谱法的历史及其分类1.1.1、“色谱”一词的由来（P256）1.1.2、色谱分析法的分类（P258）1.1.3、色谱分析法的分离原理（P1-5）（分配系数，分配（吸附脱咐或溶解解吸，色谱柱，检测器）1.1.4、色谱分析法的特点气相色谱法是近50多年来迅速发展起来的新型分离、分析技术，主要用于低分子量、易挥发有机化合物（这类化合物约占有机物的15%20%）的分析，目前从基础理论、实验方法到仪器研制已发展成为一门趋于完善的分析技术。气相色谱法是先分离后检测，故对多组分混合物（如同系物异构体等）可同时得到每一组分的定性，定量结果，而且因为组分在气相中传质速度快，与固定液相互作用次数多，加之可供选择的固定液种类繁多，可供使用的检测器灵敏度高，选择性好，因此气相色谱分析的特点概括起来为：(P1-7)高效能（103106）高灵敏度（10-710-13），1ppm(10-6)0.1ppb(10-9),ppt(10-12),样品用量以ug计，有时仅需几ng的样品。分析速度快应用范围广（HF,O3,过氧化物等，标样，红外光谱，质谱）2、气相色谱基本理论2.1、色谱流出曲线及有关术语（P2-2 P261）2.1.1、色谱峰（流出曲线）：由电讯号强度对时间作图，所得到的曲线称为色谱流出曲线，曲线的突起部分称为色谱峰。正常色谱峰为对称正态分布曲线。也就是曲线有最高点，以此点的纵座标为中心，曲线对称地向两侧快速下降。一个组分的色谱峰可以用三个参数（或指标）说明：峰高或峰面积用于定量，峰的位置（用保留值表示）用于定性，峰宽用于衡量柱效率。色谱峰的峰高是指由基线至峰顶间的距离，用h表示。色谱谱的峰面积A，是指每个组分的流出曲线和基线间所包含的面积，对于峰形对称的色谱峰，可看成是一个近似等腰三角形的面积。峰高或峰面积的大小和每个组分在样品中的含量相关（峰高（或面积）组分含量），因此色谱峰的峰高或峰面积是气相色谱进行定量分析的重要依据。2.1.2、基线 在操作条件下，当色谱柱后没有组分流出时的流出曲线叫做基线，稳定的基线应该是一条平行于时间轴的直线。基线反映仪器的噪音值随时间的变化。保留值：定性参数（P261）2.1.3、保留时间（tR） 从进样开始至.2.1.4、死时间（tM）不被固定相溶解或吸附的组分的保留时间，叫做死时间，通常用空气或甲烷来测定死时间。2.1.5、调整保留时间（tR） 从保留时间中扣除死时间后的剩余时间，称为.tR=tR-tM2.1.6、保留体积（vR） 载气携带样品进入色谱柱，从进样开始，到某组分在柱后出现浓度极大点时，所通过色谱柱的载气体积，称为该组分的保留体积。单位用毫升表示。保留体积与保留时间的关系是：VR=tRF0式中F0为校正到柱温及柱出口压力下载汽的流速，单位是：毫升/分。2.1.7、色谱峰的宽窄（P262）在色谱图中色谱峰形的宽窄常用区域宽度表示，区域宽度是指色谱峰3个特征高度的峰宽：拐点宽度Wi（0.607h处峰宽）半峰宽度Wh/2（0.5h处峰宽）基线宽度Wb（从色谱峰曲线的左、右两拐点作切线，其在基线上的截距为基线宽度）上述Wi、Wh/2和Wb都表示了色谱峰的宽窄，最常用的是易于测量的Wh/2或Wb。2.1.8、色谱峰间的距离分离度P263在色谱分析中，最常遇到的是难分物质对的分离问题，但是，选择性反映不出效率高低，而柱效又反映不出难分物质对的直接分离效果。故在色谱分析中，需用一综合性指标，即能反映柱效能又能反映选择性的指标，做为色谱柱的总分离效能指标，这一指标就是分离度，用R表示，计算公式：分离度综合考虑了保留时间和基线宽度两方面的因素。通常：R=1.5，才认为两个相邻的峰完全分离；R=1.0，两个相邻峰恰好分离；R1.0，表明两个相邻峰不能分离开。2.2、塔板理论先介绍分配系数：分配系数也叫分配常数，是指在一定的温度、压力下，气液相间达到平衡时，组分分配在液相中的平均浓度与其分配在气相中的平均浓度之比值，也就是在平衡时，每毫升固定液中溶解某组分的克数与每毫升载气中所含某组分克数之比。最早由马丁等人提出的塔板理论，是用塔板的概念描述色谱柱中的分离过程，而板数的多少，就作为柱效能高低的一种量度。显然塔板概念是从蒸馏理论中借用来的，实际上色谱柱中并无塔板，但这种理论沿用至今。塔板理论亦称平衡理论，主要是把气液色谱过程看成是组分在固定液里的溶解平衡过程，或称分配平衡过程。在气液色谱体系中，固定相是由涂在载体表面上的一层液膜构成，亦称液相，流动相是流过固定液膜的载气，也叫气相。被分离的组分就在两相间反复多次进行分配组分在固定液中溶解，并迅速在两相间达到平衡。两个组份的分离，就是基于它们分配系数的不同，分配系数差别越大，则越容易分离。组分在色谱柱中的分配行为，可用类似于精馏塔的塔板理论加以描述。这种半经验的理论处理，基本上能与稳定体系的实验结果相一致。而由塔板理论计算出来的理论塔板数，可用于评价柱效能，并比较各种参数对分离的影响。塔板模型的基本假设：塔板模型的基本概念是设想有这样一根柱子，它是由若干小段组成。在每一小段内，一部分空间为涂在载体上的液相占据，另一部分空间充满着载气，载气占据的空间称为板体积。组份随载气进入色谱柱后，就在两相间进行分配。这个理论实际上是用层板过程的分解动作来说明气相色谱的分离过程，相当于用一系列分液漏斗的液液萃取过程，每一层塔片相当于一个分液漏斗。在塔板理论中，色谱峰的流出曲线方程式可表示为：P349通过该方程可以说明以下问题：A、流出曲线（即色谱峰）的形状：由流出曲线方程式计算的典型流出曲线形状与实际得到的色谱图的形状能较好地相符合，且当理论塔板数n103时，都趋于正态分布曲线。也就是说由色谱塔板理论导出的公式与实际色谱峰吻合，这是塔板理论解决的第一个色谱问题。B、浓度极大值（即峰高）的位置及其影响因素：由流出曲线可以看出，当t=tR或v=vR时，组分浓度有极大值（Cmax），此时上式表明，组分的最大浓度即峰高正比于进样量m和理论塔板数的平方根，反比于保留体积vR。这就是说，进样量越多，峰越高；保留体积越大，峰越低。当保留值、进样量一定时，柱效越大（n大）峰越高。另外，当进样量一定时，早流出的峰（vR小）峰形较高且窄，晚流出的峰（vR大）峰形较低且宽，这是塔板理论解决的第二个色谱问题。由塔板理论可导出计算理论塔板数n的公式：式中，tR为组分的保留时间；wh/2为半峰高处的峰宽；wb为基线宽度。当已知色谱柱长L时，可计算理论塔板的高度H示例：P2-17有效塔板数neff：用理论塔板数（或理论塔板高度）来表示柱效似乎很好了，但事实并非完全如此。这是由于死时间的存在，往往使计算出来的n值很大，色谱柱实际表现出来的效率却很差，特别是对流出色谱柱较早的那些组分更为突出，因此提出了用有效塔板数neff来做为柱效能指标。当以调整保留时间tR代替tR时，用上述公式可计算出有效理论塔板数Neff 和有效理论塔板高度Heff。必须注意的是，同一色谱柱对不同物质的柱效能是不一样的，当用这些指标表示柱效能时，必须说明是对什么物质而言。由塔板理论引入了评价色谱柱对某物质柱效高低的塔板数、塔板高度，并给出了计算方法，这是塔板理论解决的第三个色谱问题。塔板理论提出了用高斯分布曲线方程式来描述色谱峰的峰形，提出了计算理论塔板数和理论塔板高度的方法。至今这种描述色谱柱效率的方法已得到普遍的应用。2.3、速率理论P2-182.3.1、速率理论方程式P350P2-202.3.2、范氏方程的讨论和意义2.3.2.1、涡流扩散项（A）P351一般采用粒度为80100目或6080目的填充物较好。空心毛细管柱A项为0，根据此项的影响，我们在实际工作中应使用适当粒度且颗粒均匀的担体，同时填装柱子时应尽量均匀，这将是减少多径扩散提高柱效的有效方法。2.3.2.2、分子扩散项（B/u）P351根据此项影响，在实际工作中我们不要选择低的载气流速以避免组分在气相中滞留时间长，同时，对已定组分选用分子量较大的重载气如氩、氮等，而对已选定的载气则分子量较大的组分有较小的纵向扩散，柱效较好。2.3.2.3、传质阻力项（Cu）公式复杂，直接给出结论：降低固定液液膜厚度有利于液相传质，不使色谱峰扩展。但固定液过薄，将会减少