【毕业学位论文】（Word原稿）披碱草属野生种质资源遗传多样性研究草业科学硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 披碱草属 野生 种质资源遗传多样性 研究 . o.: . 摘 要 本研究对披碱草属 6个种， 101份种质材料进行 形态学 遗传多样性研究， 利用 26 个形态学性状对 披碱草属 进行 鉴定和评价， 采用 方差分析、 因子分析、主成份分析和 聚类分析 方法 对 其 进行统计分析； 同时利用微卫星（ 标记对其中 19 份材料进行 遗传多样性 研究。 主要结果如下： 1、 101份供试材料主要形态学性状的 因子 分析结果表明：抽穗 期 株高与完熟 期 株高、 叶片长与叶片宽、单株鲜重与单株干重均呈极显著正相关；主茎节数与节间长度呈极显著负相关；小穗数与分蘖数、完熟 期 株 高与单株种 子产 量均呈显著相关，穗长与小穗数没有明显的线性关系，上述 相关分析 结果清楚地描述了披碱草属牧草各形态学性状间的密切关系； 主成分分析表明， 前七个主成份占了 变异 ，可 概括出绝大部分的变异 ， 其中物候期因子、生长因子和形态因子是主要影响因子 ； 101份供试材料的 聚类分析 结果表明 ， 当遗传距离为 19时， 所有 供试材料大致分为三大 类，聚类分析结果很好印证了传统的分类系统， 101份种质材料存在 较大的形态学性状遗传多样性。 2、以改进的 过 微卫星标记 扩增 反应 体系的摸索，获得了适合于披碱草属牧草的 微卫星标记 扩增反应体系： 总体积为 20中含101U ， 1 引物， 100板 本研究得到的适合于披碱草属牧草 微卫星标记 扩增反应程序： 94 594 1 64 52 1 0三个循环降 低 2）， 72 1 94 1 52 1 72 1 27个循环； 72延伸 10 后 4保存 。 3、共筛选了 38对引物，其中 18 对引物有扩增条带，占总数的 其中具有多态性并且扩增效果较好的引物有 6对，占总数的 用筛选出的这 6对引物对供试的 19份材料进行微卫星分析， 6对引物共扩出 26条扩增带。 4、 利用微卫星分子标记数据，对 16 份披碱草居群遗传分化进行研究，结果表明：遗传变异出现在居群内，即居群间的遗传分化为 因此，披碱草的遗传多 样性主要存在于居群内； 利用微卫星标记获得的数据，对 19 份披碱草属种质材料进行聚类分析， 构建了亲缘关系树状图， 19份供试材料大致分为 五 类 。 5、 通过形态学和分子标记对 披碱草属 19份 种质材料进行综合分析评价，研究结果表明： 两种标记的相似系数为 同的标记 反映的遗传分化程度和多样性水平不同，其中以分子标记所反映的种群间的差异较大。 关键词： 披碱草属，形态学， 微卫星 , 遗传多样性，分子标记 of 01 of 9 of as 1、 By of of as No of . of of By of 01 . be of 2、 an NA of . . 20uL ,00 ng 1 10U in . as a 4 4 64 52 0 72 27 4 52 72 a 2 0 3、 of 4、 of of 6 y of 9 . be in . 5、 of on a a . in in of be of .， 录 第一章 引 言 1 碱草属研究进展 2 外披碱草属研究进展 2 4 义和重要性 遗传多样性（ 念 遗传多样性研究方法 8 其研究展望 11 11 12 13 第二章 披碱草属种质资源形态学性状遗传多样性研究 14 14 14 17 因子分析 18 25 28 第三章 19份披碱草属牧草微卫星分子标记研究 30 30 30 30 32 仿提取法 32 32 增反应体系的优化 34 34 35 果与分析 35 35 增反应 体系建立 36 增反应体系 38 39 39 第四章 讨 论 45 45 态学性状标记的优缺点 45 45 子标记和形态学性状标记结果的比较 46 第五章 结 论 49 参考文献 50 致谢 55 作者 简介 56 插图和附表清单 表 试材料 14 表 碱草属牧草形态学性状遗传多样性鉴定的项目及标准 17 表 MO s 检验 18 图 碎石图”） 19 表 21 表 22 表 成分）载荷矩阵 23 表 关矩阵 24 表 碱草种内单因素方差分析 26 表 差分析 2个田间性状比较 27 图 01份披碱草属种质材料聚类分析图 29 表 19份 )供试材料一览表 31 表 33 表 浓度的确定 33 表 33 表 34 表 34 表 12个 )的光密度值 36 图 36 图 37 图 浓度对扩增结果的影 响（ 37 图 3.4 37 图 38 表 对呈多态性微卫星引物一览表 38 图 U） 38 图 增结果 40 图 增结果 40 表 41 表 析） 42 表 碱草 15个居群在不同多态位点上遗传多样性的构成和遗传分化 43 图 9份披碱草属牧草的聚类分析（ 记） 44 图 9份披碱草属牧草的聚类结果（形态学标记） 46 图 9份披碱草属牧草的聚类结果（综合形态学和 记） 47 主要符号表 英文缩写 英文名称 中文含义 单重复序列，微卫星 机扩增多态 制性片段长度多态性 增片段长度多态性 in 光原位杂交法 列特征扩增区 位特异 链构象多态性 态性信息量 居群基因多样度 居群内基因多样度 因分化系数 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第 一章 引 言 遗传多样性作为生物多样性的重要组成部分，是物种多样性、生态多样性和景观多样性的基础。遗传多样性的表达是通过大量基因的组合来实现的，这些基因存在于牧草的个体之中，但在同一牧草中不同的种、甚至同一个种的不同个体上却表现出不同的特性，如生长 方式、对寄生物和病原菌的抗性、对寒和热、盐碱贫瘠、干旱和水涝等环境的抗逆性 以及产量生产力。只有充分了解牧草的遗传多样性，才能有目的地开展种质创新和品种改良工作，使遗传多样性 的 保护和利用以及人类社会持续发展有机地结合起来。当今，随着研究方法和实验技术的发展，遗传多样性研究从形态学水平、细胞学（染色体）水平逐渐发展到分子水平。形态标记、细胞学标记、等位酶分析、 态性分析以及基因组测序等方法，为我们研究遗传多样性提供了有效的工具。披碱草属牧草是优良的牧草，饲用价值极高，该属牧草还具有高产、优质、抗病、抗虫和抗逆等优良基因 ，是改良和育成新品种的巨大基因库。为了科学管理和利用野生披碱草属牧草，我国已经开展了野生披碱草属牧草的搜集、整理和鉴定等工作，而且在其分类学、形态学、生长发育、栽培技术、引种驯化及染色体核型研究等方面，也已有了大量的文献报道 （彭启乾等， 1982；杨瑞武， 2001；于卓等， 2004） ，但是我国披碱草属牧草的分类、保存及利用仍 需要进一步深入研究 。因此， 开展不同产地 披碱草属牧草 的 遗传 多样性研究，不仅对 披碱草 属种质资源 遗传 多样性保护具有重要意义， 而且 对从野生资源中筛选优良的栽培品种，以及新品种的培育都 具深刻 意义 ，同时，还为以后深入开展披碱草属牧草优良性状的基因标记、基因定位与克隆等工作奠定坚实的基础。对遗传距离较大的种进行杂交育种，可预期获得较大的杂种优势。 小麦族（ 禾本科 草中非常重要的一个类群，是现代麦类育种的重要种质资源。该族牧草中既包括了许多具有经济价值的多年生牧草：披碱草（ 老芒麦（ 冰草（ 赖草（ ，也包括世界 上重要的一年生粮食作物和工业用作物：小麦（ 大麦（ 黑麦（ 及人工创造的小黑麦（ 。可见 ,小麦族内物种丰富的遗传多样性是改良和育成新品种的巨大基因库。 披碱草属牧草是中生 旱中生、多年生牧草，叶扁平或内卷。穗状花序顶生，直立或下垂；小穗常 2)枚，同生于穗轴的每节或上、下两端每节也有单生者，含 3锥形，线形以至披针形，先端尖以至形成长芒，具 3)脉，脉上粗糙；外稃先端延 伸成长芒或短芒以至无芒，芒多少弯曲， 具有 因组。披碱草属 牧草 是优良的牧草，饲用价值极高，如披碱草、老芒麦等， 该属牧草还具有麦类作物缺乏的优质、抗病、抗虫和抗逆等优良基因，如老芒麦、垂穗披碱草（ E. 赤霉病和白粉病具有高抗的特征（李隆业，杨家秀1992；董玉琛 1992；万永芳 1995； et 有的物种抗大麦黄萎病 麦花叶病et 1984）和大麦锈病（ et 1997）， 是育成麦类作物新品种的宝贵资源。 披碱草属牧草大约有 150 个种广泛分布于北半球温带地区，而居世界第二大属的牧草0个种，仅占披碱草属牧草总量的 1/4。东亚和北美约各有总披碱草属牧草总量 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 的半数，仅有少数 种类分布至欧洲，我国是世界上该属牧草分布较多的国家之一。在我国，披碱草属牧草主要分布于长江以北的广大地区，而以黄河以北的干旱地区种类最多，密度 也 最大。从水平分布来看，其分布范围广阔，大致从东经 81至 132之间，横跨 50 多个经度，东起东北草甸草原，经内蒙古、华北地区，向西南成带状一直 延伸至青藏高原高寒草原区，在我国北方十四个省区范围内，形成一个连续的分布区，在西北地区多分布于高山草原地带。其水热条件大体保持温带半干旱至半湿润的指标：年平均气温为 10的积温在 1600 3200之间，降水量不多，为 150米，且 多集中在夏季，干旱度为 1随着气候及生境条件的不同，在我国不同地区，披碱草属牧草不仅分布密度不同，种类成分也有所不同。我国东北地区分布的主要有四个种，它们是披碱草、垂穗披碱草、圆柱披碱草和肥披碱草；华北地区主要有五个种，分别是披碱草、垂穗 披碱草、圆柱披碱草、肥披碱草、老芒麦；西北地区主要有六个种，它们是披碱草、老芒麦、圆柱披碱草、垂穗披碱草、紫 黑 披碱草、短芒披碱草；分布于西藏地区的主要有四个种，分别为披碱草、老芒麦、垂穗披碱草及紫 黑 披碱草。 1959 年，耿以礼教授提出我国披碱草属牧草有 9个种，其中有 1个种为引入种。随着新种的不断发现，二十世纪七十年代，据王朝品、杨锡麟等研究，我国共有 12 个种及 1 个变种，其中包括一个引入种。披碱草属牧草广泛分布于草地及高山草原地带，其中有很多种是很 有 价值的放牧场及刈草饲用牧草。在该属牧草中，除老芒麦早有栽培外， 1950年披碱草、肥披碱草已经被列入引入栽培牧草种类中，并推荐在我国华北及西北地区引种栽培，实际上，前苏联早在上世纪 20 30 年代就已经将该两种牧草引入栽培并对其 做了初步研究。但是，由于披碱草属牧草生长年限短，仅 2 4 年，而且草质粗糙，易于老化，这对在干旱地区种植是非常不利的，上世纪 60 年代开始，我国河北坝上地区的原察北牧草场首先将披碱草引入栽培，而后在内蒙古锡盟试种并推广。同时，垂穗披碱草在西北地区、短芒披碱草在四川首先得以引入，并逐步试种、推广栽培。目前，披碱草属牧草在我国已经广泛种植，具有一定的栽培面 积， 并 在发展畜牧业、改良沙漠化用地中起了较大的作用。 碱草属研究进展 国外披碱草属研究进展 自 1753 年林奈 立 披碱草属 (.)以来，经历了几次大的变动，而且每次分属的界限也具有很大的差异。按照历史上不同分类学家的处理，披碱草属曾经包含了 (（ 753； 881； 947； 951； 968）。该属也曾经被处理为只包含 20 30 个物种的 小属（ 934； et 近年来，从细胞学、细胞遗传学、形态解剖 学、数量遗传学、系统分类、同工酶和分子标记等方面对该属牧草进行 大量的研究（ 984； 992； 993； et 1995） ,分歧较大的分类处理是将披碱草属和鹅观草属合并为一属 （ 984； 984； 993； 996），还是将其划分为两个独立的属（ 976； et 1991）。基于形态 学的传统分类，披碱草属与鹅观草属的区别在于：披碱草属每一穗轴节上着生两个小穗，而鹅观草属的每个穗轴节上仅 着生一个小穗，近年来，应用细胞遗传学方法证实，这种观点是错中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 误的 ,传统的披碱草属中，含 色体组的物种，在每一穗轴节上既有单小穗的，如犬草 (E. 也有两个小穗的，如老芒麦 (E. 从细胞学的角度看，鹅观草属的模式种高加索鹅观草（ R. 有 色体组 ,而披碱草属的模式种老芒麦具有 色体组，构成了这两个属的主要差异。按 1984）和 1984）基于染色体组的分类处理，广义披碱草属包括形态上每穗轴节含 1至多个小 穗，颖呈披针形，每小穗含多枚小花、小花药，自花传粉的多年生物种 ,在这个属的定义下，披碱草属在全世界共有 150余种，包含有 色体组的物种，是小麦族中最大的属 ,其主要分布区在欧亚大陆、南北美洲及大洋洲，非洲北部也有少量分布。其垂直分布从海拔几米至 5200 米以上的喜马拉雅山区。近几年来，研究发现， E. E. 有 色体，但是缺少来自一点与赖草属（ 完全一致的，同时结合形态学数据认为， E. E. 分别命名为 . et 1997）。虽然国际上一直认为，披碱草属是小麦族中拥有 150 个种的大属（ 984），然而， 仍有 60个种的染色体组成尚不清楚，仍需进一步研究证实， 研究势在必行。 （ 1998），利用 子标记手段对披碱草属的 8 个种进行研究，结果表明仅有 3 个种（四倍体的E. 倍体的 E. . 正属于披碱草属（ et 1998）。披碱草属牧草都是异源多倍体或同源异源多倍体，而且该属牧草染色体在小麦族的其它属中也存在。众所周知，一直以来，披碱草属分类依据主要是形态学和细胞学数据，这显然是不够充分的。 Y、 H、 P 和 W 染色体 通常被用来描述披碱草属牧草的不同的染色体结构组成，需要强调的是，仅有那些至少含有一个 色体的种才归属于披碱草属。大多数四倍体披碱草属牧草具有 色体组成，其中 色体来自 H 染色体来自984； 992） ,而 述了六倍体披碱草属牧草的染色体组成（ et 1996），染色体，而 体则来自 984）。一直以来，披碱草属牧草的分类研究从未中断过，然而，仍有近 40%染色体组结构尚不清楚，而且还有众多披碱草属牧草已知的染色体组成仍待考究（ et 1998）。国外不仅仅对披碱草属牧草分类的研究起步早，而且研究的方法也日益先进，同时 系统学分类、遗传多样性的研究、育种以及品种改良上都取得了卓著成果。基于核型分析和分子水平的研究，地处南美的披碱草属牧草 在四倍体物种进化的过程中已经消失或者高度退化（ . et 1996）。 （ 1998），对 行了基因筛选，证实了微卫星的存在并合成微卫星引物序列对 E. 0种披碱草属牧草进行多态性检测、分析、评价，研究表明，供试材料存在丰富的多态性，认为微卫星是研究披碱草属种内及其种间遗传多样性非常有价值的分子标记方法（ un et 1998）；次年，他们又利用同工酶、 卫星三种分子标记 来研究犬草的遗传多样性，三种标记的研究结果是一致的，认为来自冰岛的披碱草属牧草遗传 多样性非常明显，同时认为在检测近缘种遗传多样性时， 子标记比同工酶标记更为有效， 其中 记适合于种间遗传多样性的研究，而微卫星标记则更适合种内遗传多样性的研究（ un et 1999）。可知，研究方法并不都是十全十美的，任何方法中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 都有利有弊，综合利用多种方法则可以互相取长补短，以达到较为理想的研究目的。 我国披碱草属研 究进展 在我国，许多禾草学者则接受狭义披碱草属概念， 约含 40 个种以上，我国 约有 12余种（耿以礼 1959， 1963；郭本兆 1987；蔡耿炳 1997）。 刘海学，李景欣 等（ 1996），对 加拿大披碱草 进行了 核型 分析 ， 认为 该物种体细胞染色体数目为 2n 28，核型公式为 2n 20M 8若尔盖高原的垂穗披碱草种群在长期的人为活动和区域气候的影响下， 形成 了明显的生物生态型和气候生态型分化。从其种群内分化出的变异类型的表现型可以明显看出有八种不同的类型 差 异，从其染色体组型分析结果发现染色体数存在着明显差别，最多达 42对（六倍体），最少 21 对（三倍体）（ 卞志高 1995） ； 栗茂腾 ， 蔡得田 等（ 2001）， 研究能自然产生 2认为： 2n 雄配子的无融合生殖披碱草减数分裂行为较为异常 ， 在间期细胞内经常有微核存在 ， 在前期 ， 有倒位环、多价染色体等异常现象 ， 在中期 ， 染色体有不等分裂的倾向 ， 在后期 和末期 ， 有染色体的单极分裂 (、 染色体走向一极的倾向和多极分裂等现象 ， 单极分裂的结果是不减数配子的产生。在减数分裂 中 ， 有高比例的二分孢子和三分孢子的形成 。对披碱草属体细胞染色体 形态进行观察并分析其核型，为披碱草属牧草分类及遗传育种提供了重要依据（王克平 1980）。但是，这在系统分类及其育种研究中是远远不够的，随着 子杂交、 国对于该属牧草的研究也逐步深入并取得了阶段性的进展。传统的育种方式主要集中在从分离群体后代中进行优化选择，而选择则是建立在表型基础上的。尽管应用现代遗传学和统计学方法能减少环境效应对于性状的干扰，但是环境对性状的影响是十分复杂而且难于避免。众所周知，生物遗传信 息的贮存库，即生物的一切遗传性状都是由 带的遗传信息所决定， 子标记，能直观地反映出亲本及杂交后代间的遗传差异，因而，在牧草遗传多样性鉴定、深入开展优良性状的基因标记、基因定位与克隆以及远缘杂种鉴定、杂种回交后育性恢复状况的分析 及 后代群体中目标性状植株的检测等方面都有实际应用价值。近几年来，科学家利用随机扩增多态性 术对小麦族披碱草属、鹅观草属和猬草属 3个属的模式种进行了基因组 态性分析。认为披碱草属、鹅观草属和猬草属 3 个 属的模式种间具有丰富的遗传多样性。结果表明， E. 内不同居群间的遗传差异较小，遗传距离在 E. 种间遗传差异明显，遗传距离在 间。 H. E. 亲缘关系较近， R. E. 亲缘关系较远（杨瑞武，周永红等 2001）。 相对国外 ， 我国 关于这方面的报道甚少，试验技术、试验方法以及研究思 路都有待于进一步改进和完善，以缩小与国际先进科研水平的差距。 就小麦族内多年生牧草的远缘杂交工作，在我国已经进行了十几年，并取得了卓越的成绩。我国对禾本科小麦族内多年生牧草的研究基本上还处于引种驯化阶段，在细胞学方面的研究已有一些，主要着眼于染色体计数和核型分析。 王照兰 ， 杜建才 等（ 1997），利用 披碱草与野大麦进行远缘杂交，正反交均获得杂交种子及 植株。杂种 不育 ， 从杂种表现方面分析， 第一章 引言 5 代分蘖增多，生长期延长，叶量丰富，具有明显的育种潜力 ； 同时，云锦凤等（ 1997），又采用将母本穗人工去雄后与相邻 种植的父本穗套袋的方法，获得了加拿大披碱草与老芒麦正反交的种间杂交种子，对加拿大披碱草与老芒麦种间杂交及 细胞学的研究，结果表明， 杂种仍是四倍体，加拿大披碱草和老芒麦所含的两个染色体组之间具有同源性，但也发生了结构变异 ，杂种 高度不育； 于卓 ,云锦凤 （ 1999）， 采用聚丙烯酰胺垂直板电泳技术对小麦族内的加拿大披碱草、野大麦及其杂种 道冰草及其杂种 回交 1代（ 的过氧化物酶（ 工酶做了比较研究。结果表明，每种牧草的 、 条位点相 同的酶带，为亲本的基带 ， 所有供试材料呈现 6 9 条酶带，亲本与其杂种后代的酶谱表型有一定差异 ， 工酶具多态性，可作遗传标记用于杂种鉴定和回交后代目标性状植株的检测 ， 加拿大披碱草 野大麦 能 并验证了这四种小麦族禾草传统形态学分类和染色体组分类是正确的；李造哲、马青枝等（ 2001），对披碱草和野大麦及其杂种 工酶做了比较分析，表明亲本披碱草和野大麦的 工酶谱可明显地分为 A、 B 两区，有 4 条相同位点的基带，从酶蛋白水平验 证了两亲本有较近的亲缘关系， 杂交种 谱主要表现 为 双亲酶带的互补类型，回交使野大麦的某些性状在 种进一步加强； 李造哲 ,云锦凤 等（ 2002）， 对披碱草和野大麦及其杂种研究结果表明： 杂种 小穗长、每小穗小花数、颖长、稃长也超过双亲的平均值 ， 体现出较强的杂种优势 ， 杂种 承了野大麦短根茎和每节 3枚小穗的特性 ， 正交、反交对 株颜色有明显影响 ， 对 他 性状 没有明显影响 ； 麦 ， 不同株系在外部形态上有较大变异 ， 第一颖的形状可作为亲本和杂种的特征性状 ， 以此作为鉴别杂种真伪的重要特征之一 ； 于卓 ， 宋永富 等（ 2002）， 研究加拿大披碱草与披碱草种间杂种 生长、形态、花粉育性和细胞学 ， 结果表明 ： 杂种 长势明显超过双亲 ， 平均株高 型呈双亲中间型 ， 株型偏向母本 ， 生育期偏向父本 ， 花粉可育率 自然结实率 为 0。杂种 五倍体 (2n=5x=35)， 其 后期有落后染色体和染色体桥等不规 则现象 。在 多年生小麦族中，种间杂交是个有前途的育种方法 (K. H. 996)。盛宝钦 ,段霞瑜 等（ 1998）， 对采自我国和由美、加、日、捷、斯、阿（阿富汗）和前苏联引入的18个种的披碱草，用我国小麦白粉病 11个生理小种的混合菌种进行接种，有 15个种接种成功。用 14 份发病披碱草上产生的白粉病菌分别回接小麦，也全部回接成功，说明国外的披碱草和我国的一样具同源性，都属于我国小麦白粉病的寄主范围，具中间寄主传播病菌的潜力 。 植物界存在着有性生殖、无性生殖和无融合生殖三大系统，其中无融合生殖是最缺乏研究而又 有特殊价值的一种生殖方式，它具有杂合基因型、一致表现型的特点。利用无融合生殖固定杂种优势、缩短育种周期是杂种优势利用的一条新途径。 A. 一种多年生牧草，原产于澳大利亚和新西兰，亦称为直立野麦、澳大利亚小麦草，它 是目前小麦族中发现的唯一的无融合生殖种。 自 1956 年以来，许多学者曾尝试普通小麦与 E. 交，孙其信、高建伟等（ 1997），对普通小麦与无融合生殖披碱草（ 间杂种 行研究及分子鉴定，这一属间杂种的获得为进一步开展 E. 融合生殖基因向小麦转移奠定了基础。研究结果表明， 记可作为一种小麦属间杂种快速、有效、简便的分子鉴定方法； 孙其信 ，高建伟等（ 2000）， 以普通小麦 ( 国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 6 .； 2n=6x=42， 母本 ， 以 E. 2n=6x=42 ,父本进行杂交 ， 经过幼胚拯救获得属间杂种 杂种 具有多年生习性 ， 其形态特征偏向于父本 ， 杂种 度雄性不育 ， 自交不结实 ， 对杂种根尖体细胞的细胞学 研究表明， 杂种 细胞染色体数 2n=9x=63( 其中 21条来自普通小麦 ， 42 条来自 E. 栗茂腾，蔡得田等（ 2002），进一步 对小麦 (无融合生殖披碱草 (染色体数目为 42的杂种后代 (株进行了 测结果表明 ：染色体数目为 42 条的 但 是在部分单株中出现了披碱草的特异带 ， 由此可以推测 ， 经过回交和自交后小麦草的部分染色体片段已经整合进了小麦的染色体 ， 在部分 株胚