【毕业学位论文】（Word原稿）Asia-Ⅰ型口蹄疫病毒P1-2A和3CD基因及IL-18基因重组腺病毒载体的构建预防兽医学硕士论文

I 密级 ： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 型口蹄疫病毒 3因 及因重组腺病毒 载体 的构建 1 1文缩略词 英文缩写 英文名称 中文名称 性磷酸酶 苄青霉素 禽成髓细胞瘤病毒 鼠肾细胞系 bp 碱基对 牛血清白蛋白 互补 细胞病变效应 d 天 碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 氧核糖核苷三磷酸 硫苏糖醇 溴化乙锭 二胺四乙酸 联免疫吸附试验 口蹄疫 口蹄疫病毒 h 小时 根过氧化物酶 0% 半数感染量 免疫球蛋白 G 异丙基硫代 卡那霉素 碱基 道尔顿 养基 毫升 子量 苷酸 光密度 放阅读框架 丙烯酰胺凝胶电泳 酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 pH pH 核糖核酸 核糖核酸酶 核糖核酸酶抑制剂 分钟转速 转录 二烷基硫酸钠 0% 数组织培养感染量 冲液 三羟甲基氨基甲烷 U 位 微升 非翻译区 5 543 要 口蹄疫（ 世界性重大 动物 疫病之一，被世界动物卫生组织和我国政府列为 A 类和一类传染病之首。为了给 防控 提供更安全 、 高效的防控产品，本研究通过细菌内同源重组法将 13因以及白介素基因（ 复制缺陷型人 5 型腺病毒载体重组，成功构建了重组腺病毒载体。为 口蹄疫病毒腺病 毒活载体疫苗的研究 积累了基础数据 。 1）克隆了 口蹄疫病毒 3因。 序列测定表明： 2247码749 个氨基酸； 3 2052括终止子 编码 683 个氨基酸。经与其它 毒株与 云南宝山毒株 的序列同源性相对较高， 因 核苷酸 序列 同源性分别为 与 株属于同一基因亚型。 2） 将目的基因 和 穿梭载体用相应的内切酶 酶切后 连接，将阳性的重组腺病毒穿梭质粒用 酶切线性化后与腺病毒骨架载体在 胞中进行同源重组，将鉴定为阳性的重组腺病毒质粒转化 用于转化 293 细胞包装成熟重组腺病毒。 正确的重组有二种方式即左右臂之间同源重组和起始点与右臂同源重组 ， 酶切可以切出 35 大片段和 b 小片段。本实验中切出 35 条带，为起始点与右臂同源重组。 3） 用 线性化的重组腺病毒转染 293 细胞，获得基因组结构均一的重组腺病毒。 将鉴定阳性的重组腺病毒 质粒 用 93细胞， 7天左右包装成成熟的重组腺病毒。用此重组腺病毒再次感染 293 细胞， 2后可见细胞病变（ 病变细胞涨大变圆、聚集，产生典型的腺病毒葡萄样病变。测定第 10 代 重组腺病毒的 毒价为 ）将重组腺病毒在豚鼠中进行 了 初步 免疫 效力试验。 将传代稳定，毒价高的重组腺病毒处理后用于免疫 豚鼠，定期采血，用 间接 测定血清抗体，结果表明在豚鼠体内有 体产生，但滴度不是很高， 用同型口蹄疫病毒攻击作保护性实验，结果 重组腺病毒免疫组的 3 只豚鼠中有 2 只得到了完全保护。 关键词 ： 口蹄疫 ，口蹄疫病毒 ， 白介素 病毒载体，同源重组，疫苗 V is of a It is as by IE we a CD MD as 1) We 1CD we 1247 49 3CD 052bp 83 we a to 2） we On of we we we is NA by a is it is in 3) d NA is to , to in PE be PE 4of A be 0th 4) we we to we to by we of 录 第一章 序言 . 1 研究背景 . 1 蹄疫与口蹄疫病毒 . 1 口蹄疫疫苗的研究概况 . 1 腺病毒载体发展与应用 . 5 生物活性 . 6 研究的目的、意义 . 6 研究内容 . 6 第二章 1 3因的克隆 . 7 材料和方法 . 7 病毒样品 . 7 质粒和菌株 . 7 主要试剂 . 7 主要仪器 . 8 1 粒的构建 . 8 果与分析 . 12 物的电泳结果 . 12 重组质粒的 酶切鉴定结果 . 12 重组质粒的序列分析 . 13 讨论 . 13 第三章 组腺病毒载体的构建 . 14 材料和方法 . 14 质粒和菌株 . 14 工具酶和其它试剂盒 . 14 仪器与设备 . 14 重组腺病毒穿梭质粒的构建 . 15 重组腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体的同源重组 . 18 结果 . 19 重组穿梭载体的 定 . 19 重组穿梭载体的酶切鉴定 . 19 重组腺病毒的 定 . 20 重组腺病毒的酶切鉴定 . 20 重组腺病毒的 测序 鉴定 . 21 讨论 . 22 第四章 转染 293 细胞包装腺病毒 . 23 材料 . 23 细胞 . 23 试剂 . 23 培养液 . 23 方法 . 23 293 细胞的培养 . 23 脂质体介导的转染 . 24 重组病毒的传代 . 24 测重组腺病毒 . 24 重组腺病毒的稳定性和滴度测定 . 24 结果 . 25 重组腺病毒转染的结果 . 25 测重组腺病毒 . 25 重组腺病毒的稳定性和滴度测定 . 25 讨论 . 26 第五章 重组腺病毒的豚鼠免疫试验 . 27 材料与方法 . 27 验动物及 分组 . 27 组腺病毒疫苗及灭活苗 . 27 毒用毒株 . 27 鼠免疫 . 27 清抗体的监测 . 27 毒试验 . 27 果与分析 . 28 接 测定血清抗体 . 28 鼠免疫试验 . 28 论 . 29 第六章 全文结论 . 30 参考文献 . 31 附录 . 31 致谢 . 48 作者简历 . 49 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 序言 1 第一章 序言 研究背景 蹄疫与口蹄疫病毒 口蹄疫（ 由口蹄疫病毒（ 起的牛、猪、羊等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。它不仅可使动物生产性能下降，造成巨大的直 接经济损失，而且还限制动物及动物产品的国际贸易，因此所造成的间接损失更大，同时还会影响一个国家的国际形象，素有 政治经济病 之称，被 为 16 种 A 类动物疫病的第一位。目前，国际上防控口蹄疫的模式主要有两种：经济发达的国家大多采用以扑杀为主的根除措施，发展中国家则均采取免疫接种与扑杀相结合，再辅以封锁、隔离、消毒、疫苗检测等综合措施。在口蹄疫疫苗的研发历程中，传统的灭活疫苗在口蹄疫的防控中发挥了巨大的作用，目前也是国内外防控口蹄疫的主要措施之一。但传统的病毒灭活疫苗存在很多缺点：如热不稳定性，免疫持续期短 等，一个特别严重的问题是，欧洲几次 爆发就是由于病毒灭活不完全或是由于活病毒从生产场地逃逸而造成的。因此，已经消灭了疫情的发达国家已限制使用灭活苗来预防、控制口蹄疫。因此，生产一种可产生与灭活苗具有相似的免疫保护性，且更加安全可靠的新型疫苗是人们共同的期望。 近年来，随着分子生物学技术的发展， 因工程疫苗不断涌现，如亚单位疫苗、合成 肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等。这些疫苗安全性好、生产成本低，而且可以根据需要制备同一病毒多个成分或多价病毒疫苗，因此具有广阔的发展前景 。特别是活载体疫苗具有较多优势，如免疫剂量较小，可在宿主体内复制并长期存在，可持续刺激机体产生相应抗体，大大延长免疫期限等。另外，活载体疫苗是将抗原蛋白的基因整合入载体基因组中改造成的，因此不存在散毒的危险。 口蹄疫病毒（ 于小 毒科，口蹄疫病毒属，该病毒有七个血清型，各型之间无交叉保护反应。 因组 长约 8500次为 5 3成，其中 5约 1300有 级结构、 C）区段和内部核糖体进入位点等； 6500 L 基因、 构蛋白基因、 结构蛋白基因以及起始密码子和终止密码子组成，其中 构蛋白基因编码 4 种主要的衣壳蛋白，既 成衣壳蛋白亚单位， 于病毒颗粒内部； 3约 172 A）以及A）和 之间的碱基组成。 口蹄疫 新型 疫苗的研究概况 1）亚单位疫苗 亚单位疫苗是将编码病原微生物的抗原基因导入受体菌或细胞，使其在受体中高效表达保护性中国农业科学院硕士学位论文 第一章 序言 2 抗原，以此抗原蛋白 制成的一类疫苗。由于亚单位疫苗只含有病原体的一部分，不会引起病原体所导致的动物发病，在安全性方面大大提高。早在 1979 年，研究者就发现抗空衣壳血清与抗病毒血清在中和试验中有相同的血清型特异性，而且 衣壳在豚鼠体内的免疫原性与完整病毒粒子相同。这说明病毒衣壳蛋白能够作为保护性抗原诱导免疫反应。据此，美国的 于 1981年首次克隆了 因，将其插入到原核表达载体 动子的下游，实现 因的原核表达，并通过间接 放射免疫试验证实了其表达产物具有抗原性，从而为 因工程亚单位疫苗的研制提供了理论依据。随后各国研究者相继研制口蹄疫亚单位疫苗。从而开创了研制新型疫苗的崭新阶段。口蹄疫亚单位疫苗经历了一个从原核表达系统到真核表达系统的发展过程。最初，研究者们主要把注意力集中在 白的主要抗原位点上，后来发现 白碳末端的基因带有其主要抗原位点、受体结合位点及型特异性序列。将连接有 因的、能够快速产生不同嵌合蛋白的酵母表达载体，转染酵母后发现 原表位能够在细胞表面提取，将此表达蛋白单剂量注入豚鼠后可诱导有效的中和抗体。利用包含有 构蛋 白前体基因或 3C 基因的表达载体，使其分别在大肠杆菌和 虫细胞中表达，它们表达的 白都能与同一特异单抗反应，但只有在昆虫中表达的 刺激豚鼠产生中和单抗。但由于昆虫细胞对溶液中存在的大量的蛋白比较敏感 ;需要高溶氧量维持生长；机械搅拌合气体冲击对细胞的损伤较大等缺点，限制了其工业化生产。 2）基因缺失疫苗 运用基因工程手段克隆 长 建感染性克隆，在 平上通过缺失与病毒力相关的基因，减弱其毒力但不丧失其免疫原性。基因缺失疫苗以其安全、毒力不易反强、可诱导对病毒多种抗原 的免疫应答、免疫力坚实、免疫期长等优点，受到许多研究者的青睐，而且研究证实，在使用基因缺失疫苗的同时，可以将缺失基因的表达产物制备成诊断试剂，从而把自然感染合疫苗免疫区分开。 毒同属小 毒，人们已通过 组技术，将 C）片段缩短，构成突变体，这种突变体对小鼠无害，而且在小鼠体内能产生高水平的抗体，保护小鼠免受强毒的攻击，因而研究人员试图借鉴 毒的经验，将 C）片段缩短，虽然缩短了 C）片段的 变体的毒力没有减弱 ，但这给人们某种启发，对 因组特定位点的缺失，极有可能构建 毒株。 X 射线晶体分析发现， 有一定立体构象，其表面由 成，在 一个高度可变区域内，有一高度保守的 环状（ ）氨基酸序列暴露于病毒粒子的表面，其中包含精氨酸 天门冬氨酸（ 列，构成病毒的细胞吸附位点。 人研究 因片段的主要抗原位点 合成肽晶体结构时发现，针对 抗可以产生一定程序的病毒凝集和很强的抑制病毒与细胞吸附作用。 也发现含有 列的感染性的 隆，制备 失或突变的病毒粒子就成为可能。 过取代病毒 列内的氨基酸构建 变株，使病毒不能吸附和感染细胞。以上的研究均证实 列是病毒吸附宿主细胞所必需的， 用 列取代野生型 码序列，构建了 失病毒。这种缺失 列的病毒粒子不吸附和感染细胞。利用该缺失病毒进行小鼠和猪的动物试验发现，野生型病毒对照组出现典型的 状，试验组无任何症状。通过免疫沉淀监测了这些动物在接种 28d 后的 血样，其中对照组显示很强的结构蛋白活性，没有测到非结构蛋白活性，证明了野生病毒在动物中能复制，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 序言 3 而所构建的病毒不能复制。用海福特牛对这种病毒所做的油苗作比较，证明在产生血清中和抗体、刺激机体产生免疫应答、动物保护等方面与灭活疫苗一致，有些优于灭活疫苗。 3）核酸疫苗 核酸疫苗又称基因疫苗，是将编码病原体免疫保护性抗原蛋白基因置于真表达元件的控制下，并将其导入动物机体内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，从而诱导宿主产生对抗原蛋白的免疫应答。最早有关核酸疫苗的研究是 1990 年将质粒接种小鼠肌肉开始 的。最初构建的口蹄疫核酸疫苗是一个包含有 长的基因组的质粒。但由于全长基因有一定的危险性，以后的研究者们开始着力于只表达 原表位的核酸疫苗的研究，但研究发现病毒表位诱导的免疫反应较弱而且持续时间短，因此，研究者们开始尝试将衣壳蛋白编码区于一些非编码区基因共同构建于同一载体中，以图诱导机体产生更强的免疫反应。 整的结构基因 非结构基因 2A、 3联起来，同时加入脑心肌炎病毒（ 部核糖体进入 (并通过免疫荧光和免疫斑点技术检 测到猪皮肤中，部分猪获得抵抗 毒的攻击。 了克服亚单位疫苗不能产生持久的免疫保护，通过基因免疫和亚单位疫苗联合免疫来增强其免疫效果，首先用含有 要免疫原性 质粒免疫鼠，接下来 肽偶合物（ 激，免疫的鼠产生高效价的抗体，并具有中和 性。 （ 2001）构建了一个含有 13C， 3D 的质粒 此质粒免疫猪后同时出现了抗 3续三次免疫后，动物体内可检测到中和抗体，且这些动物能够免受病毒攻击。 除此之外，许多研究者还致力于核酸疫苗和共刺激因子协同作用的研究，如 （ 2001）构建了一株编码 个抗原表位和宿主免疫球蛋白恒定区的质粒 果很好。 4）合成肽苗 合成肽苗即用根据免疫抗原表位的氨基酸序列合成的抗原决定基小肽制作的疫苗。一般是从蛋白质的一级结构并结合单克隆抗体的分析，推导出蛋白质免疫主要抗原表位的氨基酸顺序，然后合成或基因工程表达这一段肽作为抗原。 合成 毒 41 200段氨基酸组成的 40 个氨基酸肽（半胱氨酸 酸 脯氨酸 141半胱氨酸 在其中间加上两个脯氨酸和一个丝氨酸，使多肽折成立体构型，达到提高了单段肽（ 141半胱氨酸 豚鼠中的应答水平，并提出了 胱氨酸 提高保护应答的重要性。 用化学法合成了 因编码的 14000肽段基因片段，并在大肠杆菌体内得到了表达，用其免疫牛、猪等都获得了较好的免疫力。 别用 A、 O、 C 血清型 列的 141 200段组成的 40 个 成肽，用牛和豚鼠进行了试验，结果每个肽都产生了特异性高水平抗病毒中和抗体，在豚鼠中 O、A 型肽可抗各自病毒的攻击并获得完全保护， C 型较差。 5）蛋白质载体疫苗 细胞内增殖，其免疫应答依赖于 T 细胞，因而细胞因子免疫性在抗病毒防御方面起着特别重要的作用。鉴于此，人们利用载体基因蛋白或类病毒粒子的抗原提呈作用，刺激 T 细胞，增殖机体细胞免疫反应。 据 1 型 基酸序列，化合合成 140氨基酸肽与载体蛋白偶联，能诱导保护豚鼠 的中和抗体。 半乳糖苷酶 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 序言 4 因的 B 细胞和 T 细胞抗原表位单拷贝或多拷贝分子，用表达的融合蛋白接种豚鼠，能诱导高水平的中和抗体，刺激 T 细胞，产生细胞免疫应答，抵抗强毒的攻击。同年 用乙型肝炎病毒核心蛋白能自我包装成类病毒粒子，将 B 细胞和 T 细胞抗原表位连接到其蛋白的 在痘病毒中表达，其表达的融合 N 蛋白在豚鼠和猪中都可诱导高水平的中和抗体。 141 200联起来与猪 重链基因的末端融合， 用其表达产物免疫的猪，可以抵抗 50 攻击。由于蛋白质载体疫苗安全性高，免疫原性好，故具有诱人的应用潜力。 6）病毒活载体疫苗 利用基因操作技术将 保护性基因（ 入到另一种病毒基因组中的某些部位，使之高效表达重组蛋白。由于外源性基因 成为载体的一部分，并随着载体病毒增殖而不停地表达，因而这种活载体疫苗在机体不但不能产生针对载体的抗体，而且可以产生针对抗体，从而达到 一针防两病 的目的。另外，针对 血清型，而且型间无交叉保护作用，因而可将不同型 因插入到同一病毒活载体中，从而组成多价基因工程疫苗来预防、控制 其他相关疾病。 许多研究者试图利用不同活载体病毒的优势，研制有利于口蹄疫防制的新型疫苗。目前用于活载体疫苗中的活载体病毒有痘苗病毒，人的腺病毒，疱疹病毒，传染性牛鼻气管炎病毒。其中人的腺病毒是表达外源基因常用的载体，它可表达和提取外源蛋白，并能刺激有效的体液免疫和细胞免疫；外源基因的表达量较高；病毒的基因组以附着体的形式存在几个月，在此期间插入的外源基因可以很好的表达，从而达到免疫时间长的效果；腺病毒也可诱发粘膜免疫 ，从而阻碍病毒在家畜的呼吸道的复制，因此可通过粘膜来获得免疫保护。复制缺陷型的腺病毒不可能在动物个体间传播，从而保证不会出现传统疫苗存在的安全隐患。作为真核基因调控研究的模式系统之一，人类对腺病毒在分子水平上已有相当的认识；腺病毒又中等大小的基因组。适合用最少的病毒序列构建高容量载体；腺病毒可感染的宿主细胞广泛，并可感染非复制细胞；腺病毒相对稳定且易达到很高的滴度；在 苗研究中 将 构蛋白 因插入人的 复制缺陷型腺病毒，将此种疫苗对牛进行两次免疫，取得部分保护， 但未检测到中和抗体的产生。 将流行毒株 A(12)构基因和实验室毒株 A(24)3C 非结构基因同时插入腺病毒载体，通过在哺乳动物细胞种实现了同源重组从而获得重组体。一次免疫动物，免疫后 7、 14 和 42d 进行攻毒，检测到了中和抗体的产生并获得了全保护率。 （ 1999）构建了含有 壳蛋白和 3C 蛋白酶编码区的复制缺陷型 5 型腺病毒载体。分离了两个克隆一个是 有野生型 3C 蛋白酶编码区。此酶能将衣壳多聚蛋白前体加工成成熟的衣壳蛋白，另一种是 有一个点突变的 3C 蛋白酶编码区，可抑制前体蛋白的加工，用这两种病毒感染 293 细胞，都合成了 壳多聚蛋白前体，但只在 3染细胞中蛋白前体才被加工成结构蛋白，只有 生了中和抗体反应。加强免疫接种后可部分或完全保护病毒攻击。 构建表达 因的重组痘病毒，用该重组病毒接种豚鼠，产生针对 B 细胞和 T 细胞的免疫反应， 2000 年， 构建了表达3 5 毒株的 因重组痘病毒，用该重组 痘病毒接种 c 小鼠，用 测出高效价的抗 体，同时能保护同源病毒强毒的攻击；伪狂犬病病毒与牛传染性鼻气管炎病毒属于疱疹病毒，基因组约 150有许多病毒增殖和复制所非必需的基因，能容纳的外源基因中国农业科学院硕士学位论文 第一章 序言 5 多，是一种很好的病毒载体。 成功地将猪瘟病毒膜蛋白 因插入 因中得到表达，制成的疫苗使免疫猪获得了较好的免疫力，并可抵抗 毒和猪瘟 强毒 的攻击。 虽然，在新型疫苗的研究上有了很大的进展，但应用到实际中还需作很多的工作，希望一种高效、安全、低廉的新疫苗早日能 应用到口蹄疫的防治中。 腺病毒载体 的 发展与应用 迄今腺病毒载体已发展到了第三代。第一代腺病毒载体，去除了 3 基因表达盒，可以插入长达 6.5 外源 除 后的腺病毒复制缺陷，阻止了依赖 和 功能蛋白的转录与随后病毒 复制及病毒外壳蛋白的产生。 缺失的腺病毒 只能 在 反式提供 基因蛋白的细胞中 增殖，如需繁殖就必须依赖包装细胞系，目前己建立的腺病毒包装细胞系 有胞， 911 细胞， 胞。 不是病毒复制必须区，所以 的 去除 对病毒载体转 染基本无影响 ，但却加大了插入外源基因的容量。 在基因转染时去除了的 将由带有增强子和启动子的外源基因代替。第二代腺病毒载体是在 失的基础上进一步去除了 和 (或 )，减弱病毒蛋白的表达。第一代和第二代腺病毒载体的 缺失增强了病毒 复制、晚期结构蛋白的合成和可复制腺病毒 （ 的产生，在使用时会产生针对病毒包壳和转基因表达产物的免疫反应，基因表达受到抑制，表现为感染组织的炎症反应和外源基因表达消失 ， 在二次应用 时，强烈的免疫反应会使外源基因的表达迅速消失。这使腺病毒的应用受到很大的限制。更为 复杂 的腺病毒载体就是第三代腺病毒载体 ,在其构建时去除了某些病毒基因 ， 甚至是去除了全部的病毒基因 ， 所谓的 空壳 载体起先只保留了 包装信号，且在产生中需要辅助病毒和合适的互补包装细胞，更需要进一步的纯化。第三代腺病毒载体不仅继承了前述腺病毒载体的优点，还具有前两代载体没有的优点，如外源 装载容量大大提高，可达 37