【毕业学位论文】（Word原稿）水稻基因激活标签体系的建立及初步分析生物化学与分子生物学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 水稻基因激活标签体系的建立及初步分析 摘 要 随着水稻基因组全序列的测定完成 ,鉴定未知 基因的 功能已成为水稻功能基因组学研究的重点内容。功能基因组学研究最直接最有效的方法是构建饱和的基因突变群体 , 通过突变体分析鉴定基因功能。 鉴于近年来根癌农杆菌介导的水稻遗传转化方法日趋成熟，利用转基因的方法获得突变体被认为是水稻功能基因组学研究的主要途径之一。本研究利用 入突变技术创制水稻基因激活标签突变群体，并对该激活标签群体和以前创制的增强子捕获群体的再生植株的翼序列一系列分析及激活标签系的 析，探讨了激活标签载体 水稻功能基因组的研究中的重要作用。 本研究是中国高技术研究发展计划（ 863 计划）项目 “水稻突变体库的创制与功能基因组学研究” 的一部分。主要取得了以下主要研究进展： 1通过与合作 者的共同努力，建立了高效、快速的大规模根癌农杆菌介导的水稻 入突变遗传转化体系，从成熟胚诱导愈伤组织开始，约 90d 后即可得到转化植株。获得潮霉素抗性愈伤组织的效率超过 90%，由抗性愈伤组织分化再生植株的效率超过 80%， 5%的潮霉素抗性植株含有 入片段。提高转化效率的关键在于共培养温度从 28低至 1922 在选择培养 1015d 后及时选择继代培养 412d。利用上述程序构建了大规模的水稻基因激活标签突变体库（约 5 万份）。 2 本人利用 术对激活标签 个体系产生的再生植株 翼序列进行分离，分别获得 172 条和 493 条水 水稻基因组侧翼序列。通过对两个体系的侧翼序列的分离效率； 插入位点整合模式比较分析； 入位点的分布分析以及激活标签系 分析，结果表明： (1) 激活标签载体 得的再生植株获得 例分别为 (2) 通过侧翼序列的分析，两个载体的 基因区的分布相似，在基因区分布频率较高，基因间隔区及重复区则较少；在染色体上分布与 报道的 与 明显不相关。 (3) 通过激活标签系的 分析，与野生型比较，在检测的 11 个基因中有 6 个基因明显被激活表达，其 插入位点在距离基因上游或下游 ，表明该载体的 35。 总之，目前创立了大约 5 万分 活标签体系，对其再生株系研究表明，该标签突变群体具有激活标签突变体的一系列优点，是进行水稻功能基因研究的重要平台。 关键词 ：水稻，功能基因组学，基因激活标签体系， of in .) to of or a in To by on a is a As is to of of In to of of of of is 863) of a as as 1. By a . of be as 0of 0% 0%, 5% 8oC 922 12d 015d. A of 0,000 by 2. CR 172 93 in of as as of of (1) of is in of (2) by in in to in on is to of (3) 1 or to of 5S in In we a of 0,000 a of a .), 录 第一章 前 言 . 1 献综述 . 1 稻基因组学研究概述 . 1 工诱变突变体库的构建及其利用 . 3 入突变库的构建及其应用 . 4 签的原理与基因敲除 . 5 座子标签技术基本原理及应用 . 6 入突变技术的发展 . 8 稻 入突变技术研究进展 . 17 入位点侧翼序列的分离 . 18 研究的意义和技术路线 . 21 第二章 水稻基因激活标签体系的建立 . 22 V 料与方法 . 22 稻标签突变体库构建所用的载体 . 22 杆菌菌株 . 22 稻组织培养用相关培养基 . 22 癌农杆菌细胞的制备 . 23 稻愈伤组织诱导 . 24 稻愈伤组织的转化 . 24 伤组织筛选和植株再生 . 25 活标签载体再生植株的 交检测 . 25 果分析 . 28 稻遗传转化的效率及其影响因素 . 28 生植株的 交检测 . 29 论 . 30 第三章 水稻基因激活标签体系的初步分析 . 32 翼序列的分离及分析 . 32 料与方法 . 32 . 37 激活标签系统的 分析 . 34 料与方法 . 45 果分析 . 47 论 . 48 结论及创新点 . 50 参考文献 . 52 致 谢 . 63 作 者 简 历 . 64 中国农业科学院博士学位论文 第一章 前言 1 第一章 前 言 献综述 水稻 (.)作为世界上最重要的粮食作物之一，世界上水稻年种植面积 公顷，年生产量 6 亿吨。据估计，今后 20 年里，全球对于水稻的需求量将以每年 1%的速度递增，这就要求水稻平均产量要在现有的约 4 吨 /公顷的基础上大幅度提高。水稻已成为研究单子叶植物基因组的模式植物，与其他的禾本科作物基因组之间具有良好的共线性 (et 1995， et 1998)，进化上的关系密切。水稻基因组学的研究已取得重要进展，绘制具有高密度的遗传和物理图谱，两 个亚种 . . 全基因组草图已公布（ Yu et 2002; et 2002） ，而且水稻的遗传转化技术体系也比较成熟，因此，从水稻中分离鉴定与产量、品质、抗性和发育等农艺性状密切相关的基因，阐明它们作用的分子机理和表达调控网络并应用于育种实践，具有重要的意义 (et 2004)。 稻基因组学研究概述 最近十年以来，拟南芥 (水稻 (全长 列 (et 2002； et 2003) ，全基因组序列 (2000； et 2002； et 2002； et 2003) ，以及表达序列标签 (测定及分析 (et 2003； et 1999； Wu et 2002) 等工作进展迅速，积累了丰富的数据资料。研究人员已经可以利用这些序列信息来揭示大量基因的功能，拟南芥已成为基因组学研究的主要模式植物，但拟南芥是双子叶植物，与单子叶和和禾谷类作物的基因组共线性关系有限。而水稻做为单子叶的模式植物 (et 2001)，主要有以下几个优点：基因组小，仅 390et 2005)；分子生物学和发育生物学研究的基础良好，积累了大量的背景资料 (et 2005)；已经构建了精细的遗传和物理图谱 (et 2002; et 2002)；建立了较为成熟的遗传转化方法 (et 1997; et 2004)；水稻与小麦 (玉米 (大麦 (黑麦 (高粱 (禾本科作物的基因组具有良好的共线性关系，因此水稻基因组结构和功能分析的方法、技术和结果对这些作物的相关研究有重要的借鉴作用 (et 2002)。水稻和拟南芥 (因组序列测定和分析结果也表明，两种模式植物基因组之间的共线性关系有限，水稻中与拟南芥同源的基因仅占的 因此水稻基因组学研究具有不可替代的作用 (2000; et 2002; et 2002; et 2002)。 水稻结构基因组学的研究成果为功能基因组学研究打下了坚实的基础。 1997 年 ，国际水稻基因组测序计划 (始实施，以粳稻 (种日本晴 (模式材料，绘制高质量的基因组遗传和物理图谱，采用鸟枪法中国农业科学院博士学位论文 第一章 前言 2 (定 1 隆序列并根据它们在 物理图谱上的先后顺序进行拼接，所得到的数据 图 稻和拟南芥的基因和 比较 .1 of 时释放到 公共数据库中 (et 2000)。 2002 年 12 月完成基因组草图的绘制，精确度达到 并预测了超过 60,000 个遗传基因； 2004 年 8 月完成全部 12 序工作量的 370并公布了装配完成的 12 个染色体分子的 列； 2004年 12月序列测定工作全部完成 (et 2005)。 et 2002)同样选择日本晴为模式品种，结果表明水稻基因组含有 32,00050,000 个基因， 98%的玉米、小麦和大麦的已知蛋白可以在水稻基因组中找到编码其同源物的基因，对各类基因的数量及其在基因组中所占的比例也进行了估算。 日本水稻全长 定计划工作组于 2003 年公布了他们的 研究进展 (et 2003)：从日本晴中分离并测定了 28,469 个水稻全长 隆的序列；通过在公共数据库中进行同源性查找，推测了其中 21,596(个 编码的蛋白及其功能；通过将 隆作图定位到基因组 ，揭示了水稻基因组中 19,00000 个转录单位的位置；蛋白信息分析结果表明部分 码的蛋白存在于水稻中，而不存在于拟南芥中， 64%的 码产物可以在拟南芥中找到同源物 (图 目前，全长 隆的测定量已达 32,127 个，克隆的平均长度为 外， 45,000 个水稻 列已测序并于 2001 年释放到公用互联网数据库，但其中只有 25%的序列与已知功能的基因序列同源，大部分的基因序列功能有待鉴定 (et 2001)。随着序列测定及基因发掘工作的完成弄清这些未知基因的功能将是序列测定完成后的下一步中心任务。 功能基因组学是后基因组时代的重点研究内容 , 主要研究生物有机体内各基因的生物学功能进而了解所有基因如何协调发挥作用完成一序列的生长发育过程。通过与已知基因序列 ( 包括核苷酸序列、 列 和蛋白质序列 ) 的同源性比较可以预测许多未知基因的假定功能 , 也可能中国农业科学院博士学位论文 第一章 前言 3 通过它们在染色体上的位置进行预测。然而 , 要精确了解每个基因的功能及基因间的互作功能 , 必须分析单个基因和多个基因的突变表型以及它们的时空表达剖面。随着新技术新方法的不断创新开发 , 分析鉴定基因功能的方法越来越多 , 并逐渐形成功能基因组学的分支学科 , 如比较基因组学 (、转录基因组学 ( 蛋白质组学 (代谢基因组学 (和 表型基因组学 ( (et 2002)。 功能基因组学的分析工作以高通量为特征，运用一系列新发展起来的研究技术。这些新技术以已知方法为基础，经改进后适用于大规模的基因分析 (et 2002)，如基因芯片技术 (et 2002)， 涉技术 (et , 2002)，靶基因同源重组技术 (et 2002)等。 要 分离鉴定基因的功能首先是构建饱和的基因突变群体 ,通过突变体分析 鉴定基因功能。因此突变群体的构建是功能基因组学的基础。而已成为单子叶植物的模式植物水稻因其相对小的基因组 (约 430高密度的遗传和物理图谱、相对容易的遗传转化和与其它禾谷类具有共线性关系等特点 (et 1998;et 2000;Wu et 2002 ;et 1997),其突变体库的构建显得尤其重要。突变体的构建方法有多种，其中 基因组规模的插入突变战略为水稻功能基因组学的研究提供了一个高通量的系统，近年来水稻基因标签技术 在原理和方法上都取得很大进展，使得大量快速获得突变标签植株成为可能 (et 2001)。 工诱变突变体库的构建及其利用 自发突变的频率是很低的 , 在高等生物中 , 大约 10 万个到 1 亿个生殖细胞中才会有 1 个生殖细胞发生突变 , 突变率是 10且许多突变通过表型无法鉴定而丢失 , 很难进行系统收集。即使获得了感兴趣的突变株 , 要分离突变基因并进一步鉴定其功能也是相当困难的 , 需要进行系统的普通遗传学分析、突变性状的精细定位 , 再通过图位克隆法才有可能分离到相应的突变 基因。正因为如此 , 尽管人们在分子水平对光 (温 ) 敏核不育水稻进行了广泛的研究 (et 1999 ,2000; Li et 2001a; et 2001; et 1999;et 1995;et 1994 ),至今还不能分离克隆出水稻光 (温 ) 敏核不育基因，不能真正揭开光 (温 ) 敏核不育性的分子基础。当然 , 也有成功的例子 ,但需要及其漫长的过程。如水稻半矮秆突变体在上个世纪 50 年代就已发现 ,但直到 2002 年才报 道已利用图位克隆法分离到这个基因 (et 2003;et 2002;et 2002; 江树业， 2003)。 物理诱变中 , 快中子被认为是植物中相当有效的突变剂 ( et 1982)。由于快中子轰击往往导致缺失突变 , 相应的突变基因可以用基因组相减的方法分离 , 基因的功能可依据突变表型加以鉴定。如利用这个方法已克隆出拟南芥 的 因 (et 1992)。但基因组相减的方法相当 繁琐，无法进行大规模 的基因功能鉴定。随着水稻基因组测序工作的完成，利用基于术进行反向遗传学研究已成为可能。这个系统被命名为 Li et 2001b,2002） 。反向遗传学 (在已知基因序列的基础上研究基因的生物学功能。由于基因的序列已知，据此可设计一对 物及其槽式引物，以由快中子轰击所获得的所有突变体 模板进行 增。在 统中，如果缺失的片段不长的话，野生型基因和突变体在正常 件下均可扩增，只是扩增的产物大小不同 ，但可通过缩短 延伸时间来抑制野生型基因的扩增。为了获得期望的突变体，突变群体要足够大，需要对几万个突变体进行 中国农业科学院博士学位论文 第一章 前言 4 选，工作量相当大。 统的起始材料是大量的干种子，不需要进行转基因操作，大量突变体的获得简便易行。实验证明， 统用于鉴定小基因（ 1串联同源基因（ 能上独树一帜（ Li et 2001b., 2002）。 化学诱变就是通过化学诱变剂处理植物（通常是种子）来诱发突变。目前，使用较多的化学诱变剂是 一个稳定的、高效的诱变剂，已广泛用于水稻等植物的诱变育种。 要诱发点突变，可能导致无义突变、错意突变和沉默突变。在拟南芥中， 要导致碱基 C/G 到 T/A 的转换突变，再根据拟南芥的氨基酸编码习惯，可知有大约 5%的突变是无义突变， 65%是错义突变， 35%是沉默突变（ et 2000）。利用点突变可以精确鉴定基因的功能，在基因功能鉴定上有独特优势，但由于点突变不易鉴定，在功能基因组学上的应用受到限制。近年来，单核苷酸多 态性筛选技术的成熟，为鉴定点突变奠定了基础。在此基础上， 建立了用于大规模筛选点突变的方法 n (et , 2000a , 2000b) 。 用 检测异源双链核酸分子之间的错配来检测点突变 , 其主要步骤是 : 利用 发点突变 ; 突 变后代个体 提取和 的构建 ; 根据目标基因序列设计引物扩增出感兴趣的片段 ; 段的变性、退火 , 形成异源双链核酸分子 ; 测异源双链核酸分子 , 获得突变池 ; 利用相同方法从突变池中筛选突变个体 ; 突变个体 段的测序验证。目前，在拟南芥中这个系统已完全自动化，并有可能达到一天筛选 3基因的水平（ et 2001） 。 通过组织培养诱发的变异叫体细胞变异 (et 1981)。其变异频率随培养时间的延长而提高 , 且结 合化学诱变和利用选择压力进行细胞突变体筛选可实现一定程度的定向诱发 (et 1998;et 2001;et 2002)利用体细胞变异已育成若干水稻品种 (et 1995;et 1992)。但利用体细胞突变体进行大规模的基因功能鉴定方面还未见系统报道。组织培养可以导致染色体断裂和重排 (et , 1992 ; et 1994)以及 甲基化 ( et 1998),由这两种因素造成的突变在基因功能鉴定上很难利用。组织培养也可导致点突变和转座元素的激活跳跃 (et 1985;et 1998),由这两种因素造成的突变在基因功能鉴定上是可以应用的。组织培养突变体在功能基因组学上的应用可行性有待实验的验证。通过组织培养可以激发水稻中内源转座子或反转录转座子 , 由此导致的插入突变可在功能基因组学上的应用。 入突变库的构建及其应用 将某些元件插入到植物基因组中后 , 相应位点的基因的表达就可能受到抑制 , 插入元件同时又可用作标签 , 从基因组中分离出相应的基因并鉴定其功能。 入突变 (转座子插入突变技术是目前较为常用的两条创制水稻突变体的技术路线。利用入突变技术不仅可以获得基因敲除 (变体，还能用于捕获基因表达调控元件和获得激活标签 (变体。 入突变库及其应用 随着农杆菌介导的水稻转基因技术的不断完善 (et 1994) , 法已成为快速构建 插入突变库的主要方法。优点是基因组 插入通常是稳定的 , 且 插入不具有位点特异性 ,可以建立饱中国农业科学院博士学位论文 第一章 前言 5 和的 入突变库 (et , 1997)。水稻 入突变库的构建工作已取得可喜进展 , 如 (2000 ; 2001) 已经筛选出至少 30 ,000 个 入突变体 ; 交和 析表明 , 大约 65 %的插入突变体包含一个以上的 潮霉素抗性分析表明平均每个插入突变体包含 114 个 入 ; 同时发 现不少形态学突变 , 如矮秆突变 ( 7 %) 、叶色突变 ( 915 %) 、斑点叶 (1 %) 和叶型突变 (112 %) 等。转座因子也已广泛用于水稻插入突变库的构建。早期研究主要集中在外源的玉米 dS 及拟南芥中的转座元件是否可以在水稻中转座。研究表明 , 玉米中的 拟南芥中的 在水稻中活跃转座 ( et , 1991 ; et , 1999 ; et , 1991 ; et , 1991) , 为水稻转座子插入突变库的构建鉴定了基础。但目前已应用于水稻插入突变库构建的只有 拟南芥的 水稻中的转座频率较低而无法应用。然而 , 个自主转座元件 , 转入水稻后频繁转座 , 导致插入突变体的不稳定。尽管随着世代的增加 , 其转座频率明显下降 ( et ,1991 ; 1997 ; et , 1993) , 仍然需要几代才可能得到稳定突变体。为了克服这个问题 ,人们开始利用双因子系统建立 插入突变库 , 就是将 座酶和 自主元件分别转入水稻 , 再将 座酶水稻和 基因水稻有性杂交 , 有 座酶的情况下就会转座 , 在杂交后代中就可选择只含 入的突变体 , 这样的突变体因不再有 ,是稳定的 , 但当稳定的突变体与含转座酶的转基因水稻杂交后 , 又可产生回复突变 ,从而验证突变性状是否由转座子插入引起的。近年来 , 人们对这个双因子系统进行了大量研究 ,逐步完善了这个系统 , 同时获得一大批的插入突变体 , 并开始进行突变基因的分离及其功能鉴定 (et 2002 ; et 1999 ; et , 2000 ; et 2002 ; et 2002 ; et 2003) 。但玉米的 座子具有偏好向邻近连锁位置转座的特性 (et 1984) , 大大增加了构建饱和突变库的工作量。幸运的是 , 一些改进措施如采用阴性选择表记基因 (如 ) 等可有效增加向非邻近位置转座的频率 (et 1995)。 签的原理与基因敲除 自根癌农杆菌 (根癌农杆菌是植物冠缨病 (病原菌，其菌体内有一个能使植物产生肿瘤的质粒 (粒， 粒上含有一段 以转移到寄主的染色体内，此即为 叫转移 i 质粒 长度的 10%左右，在病原菌致病过程中，它能随机且稳定地整合到植物基因组中，并 能稳定表达。 有植物激素基因及产生特殊衍生物（ 基因，这一段基因插入寄主染色体后，即可使寄主细胞大量增生并产生特殊氨基酸衍生物供菌体利用。这种以基因转移的方式迫使寄主产生特殊产物而加以利用的方式，为植物转基因提供了一个非常有用的载体。 1983 年，首次利用 粒作载体，将外来基因转移至植物染色体中使其表达，由比利时根特大学的 别将 之以外源基因，证明可以将外源基因转 入植物基因组，并从转化细胞再生成完整的可育植株，至此第一例转基因植物诞生。与此同时，由华盛顿大学 导的研究组公布了另外一项突破性的进展，即将细菌的新霉素磷酸转移酶（ I） 基因转入植物细胞后，植物细胞可抗卡那霉素 (et 1998)。而 入植物基因组后就破坏原有基因的表中国农业科学院博士学位论文 第一章 前言 6 达模式导致产生突变体的产生 , 同时又可作为 ” 标签 ” 用来鉴定基因的功能，这就是了 et 1999)（图 当 可能造成无义突变 (即功能完全缺失；当插入位点在启动子或 3端非翻译区上，有可能造成基因表达量降低；当带有启动子的 能会使基因表达增强； 基因组中存在多个以发生多点敲除，使多个基因同时失活；另外 选获得具有突变表型的株系后，需要先得到 后 通过共分离 (或互补实验 (根据侧翼序列分析找到 对应的野生型拷贝转入突变株后，能够使其表型恢复正常来确认突变表型是由 图 因敲除类型示意图 (仿 et 1999) 转座子标签技术基本原理及应用 1951年 细胞遗传学家 命名为转座子，后来又陆续在细菌、酵母、果蝇、金鱼草和拟南芥等其他植物中发现了内源转座子。说明转座子广泛存在于从原核细菌到真核的高等动植株的细胞中。转座子分为两类：逆转座子（ 类因子）和转座子（ 类因子）。逆转座子首先在动物和酵母菌基因组中发现，但最近几年来许多证据表明它们几乎存在于裸子植物和被子植物等所有植物的基因组中，并且是植物基因组中一个很大的组成部分。逆转座子的增殖以 拷贝数较多。研究表明，逆转座子在很大程中国农业科学院博士学位论文 第一章 前言 7 度上是侵略性的，通常情况下逆转座子被严格控制，但在胁迫条件下，逆转座子可被激活。 类因子（即通常所说的转座子）只通过由 括细菌的插入序列（ 复合转座成分 ( Tn ；可转移噬体（ 酵母的 in 果蝇的 前研究得比较清楚且应用较多的是玉米的 s、 座子。植物的转座子，其结构类似于 细菌的复合成分，以 端为 11般认为 变异不稳定， 会引起插入突变。 转座子标签法不但可以通过