【毕业学位论文】（Word原稿）不同成熟度烤烟叶片超微结构及生理生化特性研究作物栽培与耕作学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 不同成熟度 烤烟 叶片 超微 结构 及生理 生化 特性 研究 on of on of I 摘 要 应用透射电子显微镜 对 不同成熟度烤烟 叶片细胞超微结构 进 行 观察 ,结合生理生化指标分析， 发现 变化 主要表现在以下几个方面： 胞进入衰老期后 最早和 最 明显的现象；线粒体 和 细胞核保持功能至衰老后期；质膜是最后发生裂解的细胞器，这种高度有序的 结构 丧失可以保证衰老细胞代谢所需能量 的 要求。在叶片成熟的过程中，叶绿体的超微结构变化最明显，且叶绿体发育不同步，前质体以及处于不同发育时期的叶绿体出现在同一细胞中。成熟期由于淀粉粒发育充盈导致叶绿体形状不规则。 叶片衰老 的 过程中，淀粉粒数量逐渐增多，体积也明显膨大， 淀粉粒的粘性增加 。 在成熟后期，淀粉粒把 叶绿体的被膜撑破，发生了游离。观察发现， 欠熟期低 片层数基粒 片层 （ 片层数 10） 占统计基粒 片层 数 的 而过熟期 低 片层数 基粒 片层 （片层数 10）占统计基粒 片层 数的 由此可以明显的看出叶绿体基粒垛叠在衰老过程中的变化 。 主要集中在嵴数的变化上，成熟后期，线粒体 嵴数明显减少， 大部分内膜已经破裂， 内部可供呼吸作用的面积减少，呼吸强度降低。 粒体 多 围绕在叶绿体周围，但是分布并不均匀，分布在近壁一侧的要多于内侧 ； 成熟后期， 则呈现无规律的不均匀分布 ，说明前期质膜需要更多的能量来维持生理功能 。 发现过氧化物体 , 后期在叶绿体和 线粒体上出现 了很多电子致密物， 同 时 细胞核异染色质化程度加深，说明此时的细胞已经进入 程序化死亡 阶段 。 叶绿素是受叶片衰老影响最显著的指标 ， 叶片成熟 期， 叶绿体 片层结构的 破坏， 从而引发了整个细胞衰老 。 关键词 ： 烤烟 ， 衰老 ， 超微结构 ，生理生化特性 he on of by on of as 1 of in of of to be of of be in of to of C，由此分析表明， 作为外观指标衡量是比较合适的。 士学位论文 第四章叶片超微结构与生理生化特性的关系分析 32 第 四 章 叶片超微结构与 生理生化特性 的关系 分析 从 不同成熟度 烟叶 细胞超微结构 的 复杂程度来看， 欠熟期叶片 的叶绿体超微结构最复杂，具体表现在基粒片层多，基质浓厚，多片层基粒所占比例较大， 适熟期 叶次之，而 过熟期 叶 片 的 超微结构 则表现的 相对简单 。烟叶成熟期间总氮与叶绿素、烟碱和可溶 性蛋白之间的相关性分析显示总氮与叶绿素和烟碱含量极显著相关，而与可溶性蛋白相关不显著。 叶绿素有助于烟碱对总氮的贡献，而烟碱却不利于叶绿素对总氮的贡献，即从氮代谢的角度看这个过程是单向的，这与 叶绿体 的 变化是细胞器中变化最明显的这一结论 是 一致的。同时，线粒体也表现出与叶绿体相似的变化规律，结合叶绿素含量分析表明，三个部位的叶绿素含量变化规律与 叶绿体 超微结构变化规律相一致 ， 这与 粒片层垛叠复杂程度与叶绿体的含量是直接相关的”结论一致。 烤烟在 欠熟到过熟的生育期内，叶绿素含量逐渐减少，这是电镜观察 中叶绿体基粒片层垛叠数分布规律的反映，同时也是细胞超微结构复杂程度的反映，观察表明，从欠熟期到过熟期，叶绿体垛叠明显出现松散的趋势，表现在基粒片层数的下降，片层结构的崩溃，基质浓度下降，片层内嗜锇颗粒增加，后期更是出现了叶绿体被膜的破裂的情况。 过熟期 片层结构松散 ， 叶片叶绿体低 片层数 基粒所占比例远远大于欠熟和适熟叶片， 欠熟期低 片层数 基粒 片层 （片层数 10）占统计基粒 片层 数的 而过熟期低 片层数 基粒 片层 （片层数 10）占统计基粒 片层 由此可以明显的看出叶绿体基粒垛叠在衰老过程中的变化 ， 说明过熟叶片的叶绿体内膜系统 功能 相对于欠熟和适熟已经下降，而适熟和过熟期叶绿体基粒片层数大于 20 的已经很少，说明其叶绿体内膜系统已经不发达 ，被膜破裂，同时淀粉粒逐渐发育充盈，最后撑破叶绿体被膜游离到细胞中部。同时 观察还发现，基粒片层的变化不仅仅表现在垛叠层数的变化上，其单个类囊体的长度也发生了明显的变化，通过对不同时期各 50 个叶绿体的类囊体进行观察，其平均长度从苗期的 降到欠熟期的 了过熟期由于结构的崩溃很多叶绿体内已经没有整齐的垛叠 。 说明 叶绿体 基粒片层垛叠的程度与叶 绿体内叶绿素总含量是直接相关的，垛叠整齐、单个垛叠片层数多且类囊体长的处理叶绿素含量较高，反之叶绿素含量则较低。 适熟期的基粒片层垛叠变化较为明显，明显的观察到了片层之间的离散，大部分叶绿体已经开始失去其清晰的片层结构，嗜锇体小球相对 较多 ，说明叶绿体开始解体，光合作用不如前一段时间强，此阶段有机物质积累速度减慢，叶片的衰老 速度 加快，将 此时的 取样时间缩短，更加详细的分析叶肉细胞的超微形态变化将为人工控制叶片衰老过程提供重要依据。而过熟期叶绿体出现明显的空泡，垛叠基本上已经离解，大部分的叶绿体呈松散的结构，垛叠 片层离散，片层结构紊乱，出现空泡，有的只能观察到残留的片层，而有的已经观察不到有基粒的存在，这一现象反映了此阶段 是 叶绿体急剧衰老期，即衰老末期。 同时，细胞核异染色质化程度加深。以上细胞的超微结构变化表明，细胞在叶片进入成熟期后已经开始进入程序化死亡阶段，到过熟期程序化死亡的特征更为明显，细胞个体的衰老与叶片的衰老是紧密相连的。 本研究通过对叶片细胞超微结构观察证明，叶绿体 整齐片层结构的 丧失是细胞进入衰老期后 最早和 最 明显的现象 ， 线粒体 和细胞 核保持功能至衰老后期 ， 质膜是最后发生裂解的细胞器，这种高度有序的 结构 丧 失可以保证衰老细胞代谢所需能量 的 要求。 这与李寒冰等观察小麦芒和旗叶叶绿体结构的结果较一致 ，即 叶绿体 生理 活性强 时， 基粒垛叠整齐，基质浓厚， 士学位论文 第四章叶片超微结构与生理生化特性的关系分析 33 易形成突起；线粒体嵴发达，充满浓厚基质。但当叶绿体衰老时，可溶核糖核酸 (蛋白质含量下降， 化酶活力下降显著，继而叶绿素消退，核糖体解体，片层膜破碎分解，嗜锇颗粒增加，叶绿体退化收缩，体积变小，数量减少，或转化为其它有色体。姬生栋等在研究小麦旗叶 的 衰老过程中也观察到此现象，认为这些结构特征是导致叶片光合速率迅速降低的原因，而水稻研究中则认为光合 活性降低的主要原因是由于叶绿体中某些蛋白质的降解。 对叶绿体基粒片层数的显著性分析显示 烤烟 叶片叶绿体的超微结构在不同成熟时期有显著的变化， 而 叶绿素含量随着成熟度的加深也 开始 下降，说明了叶绿体 基粒片层垛叠的程度与叶绿体内叶绿素总含量是直接相关的 。 董建华等在研究水稻和稗草叶片叶绿体基粒片层与叶绿素含量、光合速率间的关系时认为叶绿体的光合膜发达的品种，其叶绿素含量和光合速率较高。马国英等研究了不同小麦品种叶片叶绿体超微结构与叶片叶绿素含量、光合速率的相互关系，得出了相同的结论。 在过熟期，丙二醛含量出现较 大幅度的增加，这与电镜观察到的成熟后期叶绿体内嗜锇颗粒的增加和电子致密物的增多的情况一致。对 不同成熟度叶片的叶绿素、烟碱、总氮进行定量分析 ，结果表明，叶绿素对总氮的影响主要是直接的，而烟碱虽然对总氮的影响达到极显著，但直接影响的作用不显著；可溶性蛋白含量虽然很大，但对总氮的影响不显著。 电镜观察中，不同 成熟度 叶片细胞超微结构变化最明显的就是叶绿体，经过比较， 欠熟期 上部叶的叶绿素和类胡萝卜素含量都高于中部和下部叶片，但到了过熟期，上部叶的叶绿素和类胡萝卜素含量则略低于中部和下部叶片，上部叶的丙二醛含量一直高于 中部和下部叶，说明上部叶在成熟过程中各方面的变化较大，这与观察到的上部叶片 超微 结构比中部和下部叶复杂的规律是一致的。 线粒体的超微结构变化规律与叶绿体相似，但是变化没有叶绿体明显。由于线粒体是进行呼吸作用的细胞器，伴随着线粒体内膜系统的崩溃，细胞的呼吸作用水平也随之下降。 呼吸作用释放的能量除一部分转变为热能被散失掉外，大部分则以 形式贮存起来，供生命活动利用。呼吸作用在分解有机物质的过程中产生了许多中间产物，其中有些中间产物的化学性质非常活跃，如丙酮酸、 果酸等，它们是合成核酸、蛋 白质、糖以及其它物质的原料。而线粒体则是进行呼吸作用的主要场所，所以线粒体的功能直接影响了细胞的生理状态。观察发现苗期线粒体很不发达， 进入成熟期，线粒体发生了很大的变化。欠熟期，线粒体处于发育较好的状态，个数增多，分布于叶绿体周围，分布不均匀，有聚集的现象出现，大小不一，有的较大，有的体积不大但是结构 较好 ， 个别 体积较小的线粒体嵴数还比体积大的嵴数还要多，说明线粒体的功能并不能简单的用其体积大小来进行比较。适熟期 线粒体 个数没有明显的减少，其变化主要集中在嵴数的变化上，这一时期，线粒体的嵴数明显降低，说明这一时 期线粒体的内膜开始破裂，呼吸作用的水平下降，反映出此时细胞的代谢强度下降。而到了成熟后期，线粒体结构崩溃，观察到的嵴已经很少 ，说明此时的线粒体大部分内膜已经破裂，内部可供呼吸作用的内膜面积 也有一定的下降。同时，细胞叶绿体被膜大部分也已经破裂，大淀粉粒游离到细胞中部，这时的细胞内部结构比较混乱，细胞内容物没有规律的分布在细胞里。 对 超氧化物歧化酶（ 过氧化物酶（ 可溶性蛋白（ 丙二醛（ 叶绿素（ 淀粉酶（ 淀粉（ C% 、 N、 P、 K、还原糖（ 总糖（ 总植物碱（ 相应的几个比值等 18 个指标进行的 主成分特征负荷量与典型相关系数分析 士学位论文 第四章叶片超微结构与生理生化特性的关系分析 34 结合烟叶成熟衰老的发育规律发现 ， 决定第一主成分的主要是 C、 N/S、 N、P、 A，决定第二主成分的主要是 定第三主成分的主要是 一主成分 指向 叶绿体解体 、 碳氮代谢 和 总植物碱合成代谢，第二主成分 指向 淀粉降解有关的可溶性糖积累，第三主成分 指向 烟叶膜质过氧化的过程。综合结果表明：烟叶的成熟衰老主要由于叶绿体解体、植物碱合成 代谢造成 ， 而最后才是膜脂过氧化的作用，其对烟叶衰老 的影响是深刻而不可逆的。 典型相关分析结果表明，在叶绿体解体与总植物碱合成代谢的关系中，第一对典型变量主要由 A 相关，第二对典型变量主要由 C/N 相关，第三对典型变量补充反应了 S/相关。在叶绿体解体与可溶性糖积累代谢的关系中，第一对典型变量主要由 C 和 二、三对典型变量主要由 C 和 相关。 烤 烟成熟期间总氮与叶绿素、烟碱和可溶性蛋白之间的相关性分析显示总氮与叶绿素和烟碱含量极显著相关，而与可溶性蛋白相关不显著。 叶绿素含量对总氮含量的贡献主要是直接作用，高达 可溶性蛋白含量直接作用仅占 从间接作用看，叶绿素含量通过烟碱对总氮含量的作用达 而烟碱通过叶绿素对总氮的贡献为 说明叶绿素有助于烟碱对总氮的贡献，而烟碱却不利于叶绿素对总氮的贡献。 结 合 电子显微镜观察发现，叶绿体整齐片层结构的丧失是 细胞进入衰老期 最早和最明显的现象，而后期嗜锇体小球和电子致密物的明显增多表明质膜是最后发生裂解的细胞器。对叶绿素 A、叶绿素 B、 总叶绿素 、 类胡萝卜素和丙二醛进行主成分分析的结果也显示反映叶绿体状态的叶绿素含量受衰老的影响大于反映细胞膜状态的丙二醛。 士学位论文 第五章结论 35 第 五 章 结论 本论文主要研究了不同成熟度烤烟叶片的超微结构特征， 结合生理生化指标分析，主要结论如下： 叶绿体基粒整齐片层结构的丧失 是 细胞进入衰老期后 最早和 最 明显的现象 ， 线粒体 和 核保持功能至衰老后期 ， 质膜是最后发生裂解的细胞器，这种高度有序的 结构 丧失可以保证衰老细胞代谢所需能量 的 要求。 微结构特征及其变化规律 烟草成熟过程中，叶 肉细胞 超微结构 变化最明显的是叶绿体，主要表现在片层结构松散 ， 过熟 期 叶片叶绿体低 片层数 基粒所占比例远远大于欠熟和适熟叶片， 欠熟期低 片层数 基粒 片层 （片层数 10）占统计基粒 片层 数的 而过熟期低 片层数 基粒 片层 （片层数 10）占统计基粒片层 数的 说明过熟 期 叶片的叶绿体内膜系统 功能 相对于欠熟和适熟来讲已经下降，而适熟 期 和过熟期叶绿体基粒片层数大于 20的已经很少，说明其叶绿体内膜系统已经不发达 ，被膜破裂，同时淀粉粒逐渐发育充盈，最后撑破叶绿体被膜游离到细胞中部 。同时观察还发现，其单个类囊体的平均长度从苗期的 降到欠熟期的 了过熟期由于叶绿体结构的崩溃很多叶绿体内已经没有 整齐 的垛叠 。 结构特征及其变化规律 线粒体 的 变化主要集中在嵴数的变化上，成熟后期，线粒体嵴数明显减少，大部分内膜已经破裂， 内部可供呼吸作用的面积减少，呼吸强度降低。 粒体多围绕在叶绿体周围分布，但是分布并不均匀，分布在近壁一侧的要多于内侧；成熟后期，则呈现无规律的不均匀分布，说明前期质膜需要更多的能量来维持生理功能。 而且后期在叶绿体和线粒体上出现 了很多电子致密物，同时细胞核异染色质化程度加深，说明此时的细胞已经进入程序化死亡 阶段 。 绿素是受叶片衰老影响最显著的指标，叶片成熟期，叶绿体片层结构的破坏，从而引发了整个细胞衰老。 对 18个指标进行测定 并 结合烟叶成熟衰老的发育规律 分析发现， 烟叶的衰老首先是叶绿素降解，碳水化合物的转化，随后是总植物碱的合成、蛋白质降解，然后是可溶性糖含量的上升，最后是膜质过氧化过程 ，其对烟叶的衰老影响是深刻而不可逆的，并最终造成了 细胞 的死亡。 烤 烟 在 欠熟到过熟的生育期内，叶绿素含量逐渐减少，这是 电镜观察中叶绿体基粒片层低垛叠数分布规律的反映，表明衰老的细胞复杂程度下降，在过熟期，丙二醛含量出现较大幅度的增加，而此时细胞内的嗜锇颗粒和电子密集物也明显增多， 细胞核异染色质化程度加深， 说明了在这一时期，细胞膜系统已经崩溃，细胞的生理活性随着其衰老程度的加深呈下降的趋势 ，细胞已经进入程序化死亡 阶段 。 综合以上结果表明， 烤 烟叶片在衰老过程中最早发生变化的是叶绿体，其结构和叶绿素含量发生了明显的变化，而质膜则是最后发生裂解的细胞器。 士学位论文 图版 36 图版 图版说明 W 胞壁， CE 绿体被膜， P 粉粒 L 粒片层 E N 胞核 M 粒体 C 氧化物酶体 图版： 1 苗期，示叶绿体沿细胞壁整齐排列。 2 苗期叶绿体，示基粒整齐的片层结构。 3 苗期 ，示不同发育时期的叶绿体。 4 欠熟期叶绿体，示类囊体垛叠。 5 欠熟期叶绿体，示垛叠整齐的基粒和线粒体 。 6 欠熟期叶绿体，示 大淀粉粒和小淀粉粒。 m ： 1 2 of 3 of 4 of 5 of 6 of m 士学位论文 图版 37 图版 图版： 1 欠熟期叶绿体，示略有松散的片层排列。 2 适熟期叶绿 体 ，示基粒类囊体垛叠松散。 3 适熟期叶绿体 ，示连接基粒的类囊体。 4 适熟期叶绿体 ，示淀粉粒膨大后发生游离。 5 过熟期叶绿体， 示叶绿体片层出现空泡。6 过熟期叶绿体 ，示出现空泡的叶绿体和线粒体。 m 1 of 2 of 3of 4 of 5 of of 6 of of m 士学位论文 图版 38 图版 图版： 1 过熟期叶绿体 ，示出现空泡的叶绿体、线粒体和电子致密物。 2 过熟期叶绿体 ，示片层溶解后的残留部分。 3 过熟期叶绿体 ，示淀粉粒膨大后游离到细胞中部。 4 过熟期叶绿体 ，示后期仍有新的淀粉粒形成。 5 苗期 ，示不发达的线粒体。 6 欠熟期 ，示结构发达的线粒体。 m 1 of a of of 2 of of 3 of in of of 5 6 of m 士学位论文 图版 39 图版 图版： 1 适熟期 ，示内膜溶解的线粒体和叶绿体上的电子致密物。 2 适熟期 ，示出现空泡的线粒体。 3 过熟期 ，示内膜溶解的线粒体。 4 过熟期 ，示 高度 异染色质化的细 胞核。 5 过熟期 ，示线粒体上的电子致密物。 6 过熟期 ，示叶绿体上的电子致密物。 m 1 of of 2 of 3 4 5 of of 6 of of m 士学位论文 图版 40 图版 图版： 1 过熟期，示叶绿体被膜上的电子致密物 。 2 过熟期 ，示叶绿体和线粒体上的锥形电子致密物 。 3 适熟期 ，示过氧化物酶体 。 4 适 熟期 ，示过氧化物酶体。 m 1 of of of of 士学位论文 参考文献 41 参考文献 1. 陈瑞泰主编 . 中国烟草栽培学 M. 上海：上海科学技术出版社， 11。 2. 陈淑珍 ,高致明 , 马长力 ， 等 . 烟草叶片腺毛发育及其分泌活动对烟叶品质的影响 J. 烟草科技， 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