【毕业学位论文】（Word原稿）百菌清降解菌的筛选及其降解特性研究植物病理学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 百菌清降解菌的筛选及其降解特性研究 of a of a 要 为有效控制因化学农药“百菌清”大量应用而导致的农田土壤和农产品污染问题，本研究开展了该化学农药的微生物降解研究。现将对所分离到的一株对百菌清具有高效降解能力的菌株的生物学特性、降解能力、降解谱、降解中间产物等简要介绍如下： 1、通过加富培养法富集、培养，从所采土样中共得到 30株耐受菌株， 其中菌株 形成明显的降解圈。通过高效气相色谱（ 该菌株进行了降解能力测定，结果表明：在无机盐液体培养基中（接菌菌体终浓度为 1107 30， 180r/天，百菌清（ 50）的平均降解率为 2、通过形态观察、生理生化特征测定和 16列分析，确定菌株 对生长条件的研究结果表明， 该菌株的适宜生长温度为 30 ,适宜 株摇瓶培养适宜的碳源为葡萄糖，有机氮源为牛肉膏，无机氮源为草酸铵，适宜的 C/。 3、应用高效液相色谱（ 定了菌株 果表明所用技术体系对土壤中添加百菌清后的回收率在 达到了农药残留提取标准要求。将菌株以 1070百菌清的灭菌土壤中，室温培养 24 小时后百菌清的平均 降解率可达 第 3 天 后 达 一周后可达 4、降解谱测定结果表明， 氯硝基苯、 六六六、 唑磷、甲基对硫磷、苯胺和苯酚或降解效果不明显。 5、 将 30 ， 180r/天的培养液以正己烷：异丙醇：甲醇体积比 5： 3： 2为展开剂，经硅胶薄层层析（ 离， 并 收集 254 下 的分离 斑 ，以 甲醇溶解 和 自然浓缩后，利用高效液相色谱一质谱联用技术 (析鉴定 ， 获得两种降解产物，分别为 1,3四氯苯和 4三氯苯二腈（ 。 推测 基水合作用和羟基化作用两种途径降解百菌清。 该研究 对百菌清残留土壤和环境的生物修复 具有重要意义。 关键词： 百菌清，生物降解，苍白杆菌，生物学特性，代谢产物 n to to a is a in to 1. A of in a on 0 as By it PN by of 0 , 180 in 2. in of 6s pH 0 .0 1% 1% % : N ( PN in of in PN 0 by 107g 1. 4% 4 h, . of it 5. of 0 by :3:2 as v/v). of 254 in by ,3,5,6,6 It of of V 目 录 第一章 绪论 . 1 究背景 . 1 . 1 机氯农药微生物降解研究进展 . 1 菌清及其降解代谢研究进展 . 7 . 9 究的主要内容及技术路线 . 10 . 10 . 11 第二章 百菌清高效降解菌的分离与筛选 . 12 . 12 . 12 试土样 . 12 养基 . 12 要仪器 . 13 . 13 . 13 . 13 富培养法） . 13 . 14 . 14 . 15 . 15 然土壤中固有微生物耐受百菌清浓度的测定 . 15 解菌的分离 . 15 解菌在无机盐培养基上对百菌清的降解能力 . 16 解菌株对百菌清降解能力的测定 . 16 论与讨论 . 18 第三章 百菌清高效降解菌株的鉴定 . 20 . 20 株 . 20 养基 . 20 验仪器 . 20 剂 . 20 法 . 21 形态特征 . 21 理生化特征 . 22 6S 因序列测定与系统发育分析 . 23 . 26 态特征 . 26 理生化特征 . 26 6S 因序列测定与系统发育分析 . 27 论与讨论 . 30 第四章 不同条件对菌体生长的影响 . 32 料 . 32 法 . 32 子液配制 . 32 定方法 . 32 度对 . 32 . 32 液量对 . 33 养对 . 33 据处理 . 33 果 . 33 度对 . 33 . 34 液量对 . 35 养对 . 35 论与讨论 . 37 第五章 解百菌清中间产物的测定 . 38 料 . 38 . 38 解谱的测定 . 38 解中间产物的鉴定 . 39 果 . 39 解谱的测定 . 39 解中间产物的鉴定 . 40 论与讨论 . 43 第六章 . 45 . 45 . 45 . 45 壤中百菌清添加回收率的测定 . 45 土壤中百菌清的降解效果测定 . 45 果 . 46 . 46 菌清在土壤中的添加回收率 . 47 土壤中百菌清的降解效果测定 . 47 论与讨论 . 48 第七章 全文总结 . 49 参考文献 . 51 致谢 . 58 作者简历 . 59 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 究背景 在过去的 50 年里 ， 环境污染尤其是土壤的污染已受到科学界和大众的广泛关注。 工业生产释放的废物、现代交通运输工具排放的废气以及有机农药使用造成的残留等 ， 使土壤圈越来越多地被 外来 化合物污染并且大大超过了环境的 自净能力。 有机氯农药是历史上最早大规模使用过的高残毒农药，使用时间长，虽然经过近 20 年的自然降解，土壤环境中的残留量仍十分 可 观。农药残留微生物降解技术是通过在土壤中接种高效降解性微生物，原位消除土壤中的农药残留，降低土壤中农药污染物的 量 ，从而减少进入作物体内的农药。本技术投入低、效率高，已经在无公害农产品生产中得到应用，是一项已经获得民众认可的、可操作性强的无公害农产品生产技术。目前生物降解技术已广泛用于土壤、水体、海滩的污染治理。 机氯农药的生物致毒性及其残留 有机氯农药自上世纪 70 年代在 全球范围内陆续被禁用，但它们不易分解且具有强脂溶性，能通过食物链在生物体包括人体内富集，对生态系统和人类健康造成威胁。有机氯的慢性毒理作用主要表现在影响神经系统、内分泌系统和侵害肝脏、肾脏，可引起肌肉震颤、内分泌紊乱、肝肿大、肝细胞变性和中枢神经系统等病变（ 2001）；不但影响本代，而且可能影响后代。据报道，它们使女性患乳腺癌、子宫癌和子宫内膜疾病的危险明显增加 (1998; 1998)。近年研究也表明，它们在动物体内的代谢产物具有类似于性激素的作用，影响动 物正常生理活动，有 环境激素 之称 (吴德生 ， 2001)。 因有机氯农药的化学性质稳定 ， 同时受到各种自然环境及耕作制度的制约 。 土壤中的有机氯农药残留期极长，据报道 95%的六六六在土壤中被分解，最长需要 20 年， 分解 95%需 30年 (刘广民 等 ， 2001)。刘广民等对吉林省西部松原地区农田土壤中的有机氯农药进行了研究，虽然停产、停用有机氯类农药几十年 ， 但六六六残留的最高值可以达到 60ng/广民 等 ， 2001)。有机氯农药通过土壤被植物吸收残留在植物内，并通过食物富集对人体健康产生威胁。郝桂明等（ 2001） 对 10 种茶叶中的有机氯含量进行了测定，其中，农药的残留量超过国家规定的有四种，占样品总数的 40%。张曙明等（ 2000）测试了黄芪、三七和西洋参中 15 种有机氯农药的残留量，结果表明各被测样品中均含有有机氯农药的残留。加强有机氯农药在土壤环境中的迁移转化、分布模式以及微生物降解等方面的研究，从而提出有效的控制和治理方法成为人们研究的热点。 机氯农药微生物降解研究进展 国外对农药微生物降解的相关研究主要集中在以下几个方面：农药降解菌的分离、特性、对土壤和水体的生物修复、对农药的降解途径、降解 动态、降解酶的研究、利用固定化酶和固定化细胞进行水体和土壤的修复、化合物结构与降解能力的关系、外界条件对降解菌降解能力的影响、中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 降解农药的分子机理、降解基因的检测、分离和稳定性研究、质粒转移、工程菌构建及其表达特性（虞云龙 等 ,1998; et 1976; 崔中利 等 ,2002；蔡烈伟， 1999；罗启芳 ,1996; et 1995; 994; 986; et 1995；王永杰 等 ,1999；阮少江 等，2000）、降解基因及构建工程菌的研究（ et 1976; 吕泽勋 等 , 1993; 崔中利 等 , 2002）。国内目前对降解有机磷农药 和除草剂 的细菌的研究较深入，包括降解菌株的获得、降解酶的纯化、降解酶基因的克隆以及降解菌的田间应用等。而对于有机氯的研究相对较少，研究多局限于菌株及生理特性的研究。 机氯农药降解菌的获得途径与鉴定 目前，可降解农药的微生物的获得途径主要有：从受农药污染严重的土壤中筛选分离具有优良性状的菌种；定向培育优良菌种；在此基础上，进行诱 变育种、原生质体融合及基因工程等手段构建高效、广谱的降解工程菌。 从受农药污染严重的土壤中筛选分离具有优良性状的菌种是目前采用最多的一种方法，一般是利用农药排污口及周围或长期使用某一种农药的土壤，经富集培养，分离出可降解农药的高效菌株。方玲（ 2000）分离到能降解六六六的芽孢杆菌属、无色杆菌属和假单孢菌属菌株，以及降解滴滴涕的产碱杆菌属和无色杆菌属。王玉军等（ 2002）从多年施用过 土壤中分离出一株高效细菌菌株 吉氏拟杆菌（ 一株放线菌菌株 金霉素 链霉菌( 并对其生长条件和降解机理进行了初步研究。王国惠（ 2004）从受污染的土壤中筛选到一株有机氯农药 2， 4效降解菌 菌对 2， 4有很高的降解活性及较强的耐受力。当 2,4 D 的浓度为 400 时几乎完全被降解，浓度为 800 时 降 解率达 耐受浓度高达 3200。 定向培养优良菌种也受到人们的关注，其方法就是在土壤中通过人为的多次施药，培育可降解该农药的微生物，当再次施药时，经降解速率的测定，如发现农药在该土壤 中的降解速率快于未施药土壤，则可以确定可降解该种农药的微生物种群已被培育起来，而后从中分离出高效菌株。这方面的研究已有过成功的例子。如 (1996)通过向土壤中施用萘丙酸草胺诱 导 该农药降解菌。 (1994)连续向土壤中施用乙烯菌核利，筛选出降解该农药的假单胞杆菌。 在上述农药降解菌的培育过程中，诱变育种也是常用的方法。对于降解效率不高的菌株可采用诱变的办法，使基因发生突变，获得降解能力提高的菌株。沈齐英等（ 2004）用紫外线做为诱变剂处理由燕化炼油厂污水厂的活性污泥中筛选得到的降酚菌株， 在 好 氧条件 下 筛选出 2 种高效降酚微生物 种能够有效降解较为复杂的含酚污水，且 种处理效果最佳。 高效农药降解工程菌的构建已经成为当今的研究热点。降解微生物尤其是细菌中的降解基因、降解途径等许多农药降解机制的阐明为构建高效降解性能的工程菌提供可能，基因工程技术的利用使人们可以按照人类的需要构建具有特殊功能的降解质粒，产生出降解效率高，降解范围广，表达稳定的新菌株。 降解菌的鉴定对于开发农药降解菌资源，阐明降解原理，构建工程菌及利用混合菌降解农药具有重要意义。目前常用的鉴定方法主要依据降解菌的形 态特征培养特征及生理生化特征，随着中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 分子生物学技术和其他学科的发展，一些先进的技术也被广泛应用于降解菌的鉴定中，这些技术包括： 量测定 合率测定 碱基顺序测定核糖体蛋白的组成分析，其他技术如红外吸收光谱核磁共振脂类分析细胞色素类型以及辅酶 Q 的类型等也被广泛应用 (马文漪 等 ，1998; 张继忠 ， 1990)。 降解的微生物种类 土壤微生物主要包括真菌、细菌、放线菌等，它们对农药均有降解作用。细菌由于生化上的多种适应能力和容易诱发突变等特性，在降解农药的微生物种群中占有重要位置 (1984)。土壤中的农药降解菌并非特殊微生物，它们在土壤中分布很广，某种农药往往同时有多种降解菌，同一种菌也可能会对多种农药具有降解作用。目前已分离到的能降解或转化有机氯的微生物如表1伟东 等， 2005） 。 药降解途径与机理 (一 ) 微生物降解农药的本质是酶促反应 农药的代谢方式主要有酶促与非酶促两种方式，而微生物的降解作用主要是通过其分泌酶的代谢来完成，其本质为酶促反应。常见的降解酶类主要有水解酶和氧化还原酶类（逢焕成等，2002）。水解酶类如对硫磷水解酶、酯酶和硫基酰 胺酶能将农药水解为结构简单的、毒性较低的小分子化合物，并且降低农药的生物专一性和稳定性，提高产物的生物降解性。这类酶对作用农药的专一性要求不高，水解农药的种类较多，显著降低原药毒性。此类酶促反应中不需要辅酶或辅助因子，使用也较方便 ， 多 见 于有机磷农药如久效磷、对氧磷和马拉硫磷等的降解。 氧化还原酶类可分为过氧化物酶和多酚氧化酶，如酪氨酸酶、漆酶对土壤中酚类化合物和芳香族化合物的降解就很有效。其中过氧化物酶可由植物和微生物分泌产生，如棘根过氧化物酶包含一个铁 原子 的卟啉环，需要过氧化氢才能发生酶促反应，能催化芳香 族化合物等一大类反应，包括木质素的聚合和解离反应。辣根过氧化物酶能催化酚和苯胺的聚合反应；酪氨酸酶通过催化酚的羟基化和氧联苯酚的脱氢作用来消除土壤中有毒物质的污染；漆酶是通过聚合过程来起作用。带有氯的苯酚和苯胺由漆酶和过氧化物酶在土壤中进行氧化而解毒。目前漆酶被证明是最有效的氧化还原酶类之一（和文样 等， 2001）。 1970） 则发现球形芽孢杆菌(细胞抽提物具有酰胺酶活性 ， 可降解苯胺类除草剂。 1974） 从节杆菌(得到了一种多功能氧化酶 ， 可降解 2,4 3,5这种多功能氧化酶在进行催化解毒时需要辅助因子 氧的存在。 （二）微生物在农药转化中的作用 一是矿化作用。有许多化学农药是天然化合物的类似物，某些微生物具有降解它们的酶系。它们可以作为微生物的营养源而被微生物分解利用，生成无机物、二氧化碳和水。矿化作用是最理想的降解方式，因为农药被完全降解成无毒的无机物，如石利利等 （ 2002） 研究了假单胞菌 1 在水溶液介质中降解甲基对硫磷的性能及降解机理后指出， 可以将甲基 对硫磷完全降解为无机离子 和 。 二是共代谢作用。有些化合物不能被微生物降解，但若有 其他 可 利用的 碳源和 氮 源存在时，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 它们则可被部分降解，这个作用称为共代谢作用。如门多萨假单胞菌 株不能以甲单脒作为碳源和能源而生长，只能在添加其它有机营养基质作为碳源的条件下降解甲单脒，且降解产物未完全矿化，属于共代谢作用类型（沈东升 等 , 1994）。共代谢作用在农药的微生物降解过程中发挥着主要的作用（王伟东 等 , 1995）。 表 1降解有机氯农药的微生物种类 of 解微生物种属 能够降解的农药 假单胞杆菌 ( 艾氏剂 、 毒杀芬 、 2,4 D、 2 甲 4 氯 、 对氯苯胺 、 五氯酚 、 多菌灵 、 乙烯菌核利 、 对氯苯胺 、 六六六 、 对硝基苯酚 无色杆菌 ( 2,4 D、 2 甲 4 氯 、 2,4,5 T、 对氯苯胺 、 六六六 产碱菌株 ( 六六六 、 五氯酚 、 三氯醋酸 屎拟杆菌 (硝基苯 吉氏拟杆菌 (五氯硝基苯 芽孢杆菌属 (艾氏剂 、 异艾 氏剂、 七氯 、 2 甲 4 氯 、 2,4 D、 五氯酚 棒状杆菌属 (2 甲 4 氯 、 2,4 D、 五氯酚 土壤杆菌属 (对氯苯胺 黄杆菌属 (2,4 D、 2 甲 4 氯 、 三氯醋酸 、 对氯苯胺 、 五氯酚 短杆菌属 (五氯酚 枝动杆菌属 (2,4 D、 2 甲 4 氯 、 2,4,5孢原平革菌 (五氯酚 曲霉属 (艾氏剂 、 毒杀芬 、 2,4 D、 2 甲 4 氯 、 异狄氏剂 、 狄氏剂 、七氯 、 二硝基苯胺 、 五氯酚 青霉属 (异狄氏剂 、 狄氏剂 、 七氯 、 五氯硝基苯 根霉属 (七氯 、 艾氏剂 木霉属 (七氯 、 艾氏剂 、 狄氏剂 、 五氯酚 、 五氯硝基苯 镰刀菌属 (七氯 、 艾 氏剂 、 五氯硝基苯 、 对氯苯胺 总状共头霉 (甲霜灵 诺卡氏菌属 (七氯 、 五氯硝基苯 、 艾氏剂 、 2,4霉属 (七氯 、 五氯硝基苯 、 艾氏剂 混合菌群 氯酚 、 氯苯类化合物 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 （三） 微生物降解农药时的生化反应（仪美芹 等 ， 2002） （ 1）氧化反应，包括羟化反应，如芳香族羟化、脂肪族羟化、 氧化； 化性脱烷基、脱卤、脱胺。 （ 2）还原反应，包括硝基还原、还原性脱卤、醌 类还原等。 （ 3）水解反应，一些酯、酰胺和硫酸酯类农药都有可以被微生物水解的酯键，如对硫磷、苯胺类除草剂等。 （ 4）缩合和共轭形成，缩合包括将有毒分子或一部分与另一有机化合物相结合，从而使农药或其衍生物物失去活性。应该指出，在微生物降解农药时，其体内并不是只进行单一的反应，多数情况下是多个反应协同作用来完成对农药的降解过程。 药降解酶基因的克隆与表达 近年来，随着分子生物学的发展，国内外已经有多个有机磷农 药降解酶基因被克隆，主要来源于黄杆菌、假单胞菌、单胞菌、节杆菌 、土壤杆菌和紫色杆菌等。通 过研究人们发现农药降解菌的降解基因主要位于质粒上，因此，将这些降解质粒导入易于繁殖的宿主中获得高表达，提高产酶率，或将不同的降解质粒导入同一菌株中，扩大降解谱，提高降解效率已成为一个重要的研究内容。 2002） 在分离 2,4,5降解菌时加入了含有降解质粒 多种微生物，共同培养 8 10 个月 后 筛选出高效降解 2,4,5恶臭假单胞菌 细胞内含有 多种质粒，该多质粒工程菌在 6 周内可将 1000 的 2,4,5解 至 500。 (2000)将可降解 2,4,5恶臭假单胞菌 株和 2,4解菌 行细胞融合，使 降解质粒转入 株，得到一株新工程菌 同时降解 2,4 2,4,5国顺等（ 2005）从六六六的富集液中扩增到基因 将其克隆到 化大肠杆菌（ 得到分子量约 17蛋白，转化子的 表达 能力明显提高。闫艳春 （ 2000）将抗性尖音库蚊五带亚种 的 抗有机磷农药基因 酯酶基因克隆到质粒 ，得到了高酶活性的工程菌，将工程菌固定化后对有机氯进行降解，结果表明固定化细胞在一小时内对其降解高达 90以上。 目前已报道了多种应用分子生物学方法获得的具有降解能力的基因，详见表 1韩杰 等，2004） 。 响土壤中农药降解的因素 微生物对土壤中污染物的降解效率受多种因素的影响。首先与污染物的结构、特性和浓度有关。结构简单、分子量小、易溶于水的农药较易降解。不同取代基苯酚化合物在污泥中完全降解所 需时间不同，硝基酚和甲氧酚所需时间较长。具有同一取代基的苯酚物，由于取代位置不同，其消失时间也不同。苯环上取代氯的数目越多，越不易降解。以氯的位置来说，苯环上间位取代的类型最难降解。农药的浓度对降解的影响也很大，太高浓度往往对降解菌有抑制作用，而太低的农药浓度则难以提供微生物足够的营养而使生物降解无法进行。其次，与微生物群体的活性有关。特定的农药只能由特定的微生物降解，同时，微生物的空间分布 、 群体密度 、 与其他微生物中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 的相互作用等均影响微生物的降解效率。 再者 ，环境因子对农药的降解的影响是巨大的，这些因子包括温度 、湿度、酸碱度、营养等。了解影响农药降解的因素 对 因时因地创造有利条件，充分发挥降解菌的降解效能有 重要意义 。 表 1用分子生物学方法获得的降解基因 by 标基因 分子生物学方法 来 源 下水 胱甘肽转移酶 壤 酚羟化酶 性污泥 并引物 染土样 氧化酶 壤菌群 并引物 洋菌 并引物 壤菌群 并引物 壤菌群 氧化酶 儿茶酚双氧化酶兼并引物 水和土壤菌群 氧化酶兼并引物 水、淤泥、土壤菌群 学问题及发展趋势 今后微生物降解农药的研究方向主要 涉及 以下几方面 ： 高效农药降解工程菌的开发 ， 混合菌的培养，降解菌的固定化 ， 农药生物降解的模型定量化研究。但也存在不少问题： （ 1）目 前关于农药微生物降解的研究多集中于细菌方面。真菌因其卓越的降解能力正逐渐引起人们的重视，但总体上不如细菌，而放线菌和藻类则更少。今后要加强 该 方面的研究。 （ 2）在实际应用中酶也存在局限性，如酶纯化和提取技术耗时长，花费高；酶受周围环境因素的影响可能不稳定；有些酶需要辅酶因子，在应用中比较困难；酶和污染物的相互作用会 因为 扩散受到抑制；酶可能会被蛋白酶所降解。但近年来已有研究表明，通过采用固定化技术，酶可重复使用 ； 同时抗蛋白酶降解能力较强，明显提高了酶的稳定性和使用期限，而采用基因工程技术可以解决酶的来源及降解 谱较窄问题。因此农药降解酶实际中应用具有广阔的前景。 （ 3）基因工程技术的应用使人们可以按照人类的需要 构 建具有特殊功能的降解质粒，产生出降解效率高 、 降解范围广 、 表达稳定的新菌株。但是目前这项技术的研究尚停留在实验室 阶段 ，真正投入应用的基因工程菌很少。 （ 4）进入到环境中的农药，会受到环境因子的作用，土壤的 度、含水量、有机质含中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 7 量、粘度及气候等均影响农药的降解。目前进行的农药微生物降解研究多停留在实验室水平，与大田的农药应用情况相比较，是在相当强选择压下分离降解菌，常用纯培养方式进行试验，得到的降解菌应 用到田间或者自然环境条件下其降解活性容易丧失。另外在实验室里得到的微生物在向大田释放和直接应用时对环境的安全性以及对人和其他生物的是否有害必须认真深入细致 地研究。如何使实验室得到的结果与大田应用相结合，是一个有待进一步进行探讨的复杂而具有实际意义的课题。 菌清及其降解代谢研究进展 菌清及其生态毒理学 百菌清 (化学名称 2,4,5,61,3由美国的 o (现在 司开发出来的一种 高效、低毒的非内