【毕业学位论文】（Word原稿）Delftia tsuruhatensis AD9苯胺降解关键酶基因的功能鉴定和表达调节研究生物化学与分子生物学硕士论文

密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 硕士 学位论文 胺降解关键酶基因的功能鉴定和表达调节研究 in in 略 词 缩略词 英文名称 中文名称 p m D9 胺降解菌 硝基 氨苄青霉素 四环素 卡那霉素 氯霉素 bp 基对 AO 胺双加氧酶 ,3苯二酚 2， 3双加氧酶 代十六烷基三甲胺 氧核糖核苷酸 EB 化乙锭 丙基硫代 kb 碱基对 钟 合酶链式反应 分钟转速 二烷基磺酸钠 4 3 i 摘 要 苯胺是一种难降解、毒性大、可对生态环境和人类健康造成严重危害的典型有机污染物。苯胺降解菌株 离自印染 厂 活性污泥，其最高耐受苯胺浓度为 4500mg/l。 以起始浓度 1500mg/l 苯胺 为唯一碳源生长时， 30 小时达到最大生长量（ 以 300mg/l 邻苯二酚为唯一碳源 生长时 29 小时达到最大生长量（ 。采用 氧化电极测定 分子氧 吸收率的方法 ，测 定 苯胺双 加氧酶 活性为826而内源呼吸仅为 306表明 有非常明显的苯胺双加氧酶活性。利用测定积累产物吸光值的方法，测定 邻苯二酚 2,3 双加氧酶酶活为 5.8 u (mg 1，而邻苯二酚 1,2 双加氧酶的活性仅为 mg 1，表明 苯胺代谢方式为间位裂解途径。 在克隆 整的苯胺降解基因簇并完成核甘酸全序列测定（ 陆号基础上，本论文利用 算机软件分析和 列比对，推测在 调控蛋白。第一个启动子位于苯胺降解基因簇前端，受 调控蛋白 调控，控制苯胺双加氧酶基因邻苯二酚双加氧酶基因 表达；第二个启动子位于基因 能受 调控，控制基因簇中第二组邻苯二酚双加氧酶基因 表达。分析了两个启动子的转录起始位点、 和 序列以及调控蛋白在启动子上的转录结合位点序列，预测其表达均为 70 因子 依赖型。预测了 三级结构，进行了序列比对及系统进化树分析。 为验证两个预测启动子的表达功能， 采用 载体 别构建了两个预测启动子的 合 性广宿主表达载体，分别命名为 过三亲接合方法将 入 ，在不同底物诱导下测定了结合子的 结果表明： 胺降解基因簇中第一个启动子的表达受到苯胺和对甲苯胺的诱导，第二个启动子的表达受到苯胺的降解中间产物邻苯二酚的诱导和对甲苯胺的降解中间产物4通过 方法验证了第一个操纵子和基因 表达受到苯胺的诱导，第二个操纵子的表达受到苯胺和邻苯二酚的表达，并且邻苯二酚的诱导作用要高于苯胺的诱导作用。 基于以上工作和相 关文献 推测了 解基因簇的调控模式。 有关苯胺降解基因簇中存在着两个诱导型启动子的研究在苯胺降解菌中属于首次报道，为胺代谢调控分子机理的进一步研究 奠定 了 理论基础 。 关键词 ： 苯胺， 胺双加氧酶，邻苯二酚双加氧酶， 启动子， 达调节 is to be to be D9 a up 500 mg in D9 500mg 0 D9 9 00mg as a O 2606,323O) by in 75 nm 23O D9 .8 u(mg 1, mg 1in is a we D9 of of We 70 10 35 by is by In to of by D9 by of by of by of we by by it by by D9 on It of in it on of 录 摘 要 . i . 一章 引 言 . 1 胺代谢途径的研究进展 . 1 生物中芳香族化合物降解基因簇转录调控的研究进展 . 3 录调节蛋白 . 3 控蛋白 . 5 控蛋白 . 6 控蛋白 . 7 控蛋白 . 8 成分信号家族调控蛋白 . 8 胺降解基因簇的代谢调控研究 . 10 论文的目的意义和技术路线 . 12 第二章 胺代谢关键酶活性的测定 13 料和方法 . 13 株和质粒 . 13 养基 . 13 要仪器 . 14 极测定苯胺双加氧酶酶活 . 14 苯二酚双加氧酶的测定 . 14 果 . 15 苯胺和邻苯二酚为唯一碳源的生长情况 . 16 胺代谢关键酶基因的功能验证 . 17 第三章 苯胺降解基因簇中双启动子的结构预测和功能验证 . 18 验材料 . 18 株和质粒 . 18 养基 . 19 物化学试剂、酶及试剂盒 . 19 验方法 . 19 因组 取 . 19 增 . 21 物的纯化 . 22 动子序列片段的克隆 . 23 组子的筛选与鉴定 . 24 亲接合 . 24 . 25 取 . 25 转录 . 25 果 . 26 胺降解基因簇中 调控蛋白的预测 . 26 胺降解基因簇中 诱导型启动子的验证 . 29 因簇中启动子的表达活性测定 . 33 证两个启动子诱导表达的情况 . 36 不同培养条件下的 取 . 36 标基因 16S . 36 转录 增两个操纵子中的基因 . 36 论 . 40 第四章 结论 . 43 参考文献 . 44 致 谢 . 52 个人简历 . 53 中国农业科学院硕士学位论文 引 言 1 第一章 引 言 环境污染是当今世界所面临的重大问题之一，目前在世界范围内约有 5 万种工业用化合物通过各种途径进入生态环境，其中相当一部分化合物难以自然降解，长期残留在环境中，直接 对生态环境及人类健康造成极大的危害 （ 李汉卿 1985） 。据 中国环境状况公告近十来年统计的数据， 我国每年的废水总排放量 （ 不包括乡镇工业 ） 为 350 420 亿吨 ，其中 工业废水约占了 200 多 亿吨。 约 1/2 的工业废水处理达不到国家排放标准， 1/3 工业废水未经处理排放 到环境中 ，严重污染了环境。 80%以上工业废水的含有芳香族化合物，其中含有多环芳烃和苯胺、苯酚类环境毒害性物质的工业废水由于其化学结构的稳定性而难以被自然降解。苯胺作为化学合成的芳香族化合物的典型代表，是重要的化工原料和精细化工中间体，广泛应用于染料、农药、制药、橡胶等行业生产中 (981， 1975)；这类污染物毒性大、难降解， 已 被世界各国列为 严重污染环境和危害的优先控制污染物 (et et et 有机污染物的 生物 处理具有巨大的潜力， 具有速度快、消耗低、效率高、成本低、反应条件温和以及无二次污染等显著优点。自然界中， 微生物是种类 繁多 ，分布 广泛， 具有个体微小、代谢能力强、繁殖快、易变异和适应性强等特点； 在 物质循环和能量转化中起着十分重要的作用，是环境净化的主要承担者，在污染物的去毒、降解和矿化中起主导作用 （ 981） 。 微生物经过长期的自 然选择，具备稳定的特殊结构、机能和遗传基因，以应答相应的强烈的环境限制因子 。 可适应性 获得 一些有机化合物降解能力或重金属抗性 （ 987，988， 991， 988， 987） 。 因此，开发和利用丰富的微生物资源，获取具有高效降解能力的微生物菌株；研究降解代谢途径 相关 基因 及其表达调控 ，提高降解微生物的耐受和有效降解污染物的能力 。在理论和实际应用上有着十分重要的意义。 胺代谢途径的研究进展 许多科学家对苯胺降解菌的功能特性和遗传机理 进行了大量而深入的研究，揭示了微生物降解苯胺的生化机理、苯胺代谢途径的组成和相关酶系的功能。 微生物在好氧条件下，降解途径的第一步是苯胺氧化成邻苯二酚。催化此步反应的酶就是关键酶苯胺双加氧酶。 1975年证明了在诺卡氏菌通过加双氧反应形成邻苯二酚，他第一次提出苯胺降解的邻位裂解（ 与 在 1990 证明了苯胺降解途径中邻苯二酚 1,2 双加氧酶催化邻位裂解开环。 1979 第一次提出苯胺降解的间位裂解（ 等人 1990 证明苯胺降解间位裂解途径的邻苯二酚 2,3 双加氧酶作用。 许多芳香族化合物降解的第一个中间产物都是邻苯二酚，微生物在好氧条件下，降解途径的第一步是苯胺氧化成邻苯二酚（图 1而邻苯二酚降解可以通过两种代谢途径，即邻位（ 间位（ 谢途径（图 1分别由邻苯二酚 1,2 双加氧酶或邻苯二酚 2,3双加氧酶催化。当苯胺通过邻位代谢途径时，在两个羟基之间切割邻苯二酚，再经多步反应中国农业科学院硕士学位论文 引 言 2 产生三羧酸循环的中间代谢物琥珀酸和乙酰辅酶。当苯胺通过间位代谢途径时，在其中一个羟基的旁侧切割儿茶酚，最后产生 丙酮酸和乙醛。假单胞菌的某些菌株可以通过间 O C O O H C O O O O C O O A n t h e a n i l i c a c i dM a n d e l i c a c i dB e n z o i c a c i dT r y t o p h a nN a p h t h a l e n eS a l i c y l i c a c i dA n t h e a c e n eP h e n o lC a t e c h o 1胺降解成邻苯二酚是苯胺降解途径中的关键第一步 1he is to C a t e c h o lm e t a p y r o c a t e c h a s e p y r o c a t e c h a s C O h y d r o x y m u c o n i c c i s , c i s - m u c o n a t C O f o r m a t ea c e t a l d e h y d e p y r u v a t u c o n o l a c t o n M e t a c l e a v a g e )( O r t h o c l e a v a g e )4- h y d r o x y k e t o v a l e r a t es e m i a l d e h y d e ( H M S )2- k e t o a d i p a t e e n o l l a c t o n u c c i n a t ea c e t y k e t o a d i p a t 香族化合物降解的共同途径： 邻苯二酚降解的邻位和间位途径 1he 国农业科学院硕士学位论文 引 言 3 位代谢途径降解苯胺。诺卡氏菌通过双加氧酶反应将苯胺转化为邻苯二酚，进而既可以通过邻位代谢途径也可以通过间位代谢途径降解邻苯二酚。 人 1992 年还对苯胺降解酶进行了基因定位，发现假单胞菌的邻苯二酚 2,3 双加氧酶的基因可能定位于质粒上。 1985 年报道，在厌氧条件下苯胺脱硫杆菌（ 先使苯胺羧基化形成对氨基苯 甲酸，然后进行还原脱氨作用。 不同微生物降解苯胺的途径不同，表明苯胺微生物降解代谢的多样性。另外需要特别指出的是，上述苯胺的降解代谢途径的研究都是通过测定细胞中所含的酶类来确定的，建立分子基础上的苯胺代谢途径仍鲜有报道。 生物中芳香族化合物降解基因簇转录调控的研究进展 仅有完整的芳香族化合物代谢途径是不够的，由于微生物生长在复杂多变、竞争激烈的自然环境中，微生物必须随环境条件的不断改变而灵活改变自身基因的表达，从而获得最大的代谢汇报和最小的能量损失来获得竞争优势。因此，细菌的降解基因簇应该是可 调控的，否则处于其它营养 状况时这一代谢途径组成型表达的无效转运将成为竞争劣势。因此成功的代谢途径还需要受到正确的调控，调控蛋白和启动子是控制代谢基因表达的关键组成成分。调节芳香族化合物降解途径的调控蛋白来自原核转录调控蛋白的不同家族，但发现大部分是都是转录激活蛋白，通过螺旋转角螺旋（ 合序列与我独自结合并激活转录，调控蛋白的特异性通过其与特异的诱导物，一般为芳香族化合物底物或者代谢中间产物的结合来体现 录调节蛋白 录调节蛋白（ 目前发现的最大的原核转录调节蛋白家族，也参与多种芳烃化合物的代谢调控。如 调控邻苯二酚降解操纵子 990)； 粒 调控氯代邻苯二酚降解操纵子 994)； 51 质粒 调控氯代邻苯二酚降解操纵子 991)； 调控氯代邻苯二酚降解 操纵子 999)； 调控苯酚降解操纵子 999)；调控 2， 4解操纵子 998)。基因簇结构以及代谢途径如图 1基因簇 位于 粒上，包括 个操纵子，受到 调控， 2， 4 二氯己二烯二酸和 2 功能相似，将 2， 4解为 3过序列比对发现，在该基因簇中存在第三个调控蛋白 是该蛋白由于被 入而失活。 中国农业科学院硕士学位论文 引 言 4 另外，在 调控苯甲酸降解的三个操纵子受到两个调控蛋白 作用 (995； 998)， 代谢途径以及 基因簇结构如图 1 图1甲酸的降解主要涉及到三个操纵子的作用， 甲酸首先在 作用下生成邻苯二酚，邻苯二酚在 环的中间物。整个基因簇的表达受到 节蛋白的调控。 感受信号分子顺，苯甲酸和顺己二烯二酸变为活化形式，激活 表达，同时也可部分激活 表达。 受信号分子顺，顺 康酸）变为活化 形式，激活 纵子的表达。同时， 因受到自身的负调控。 图 11 1粒 1 of on 国农业科学院硕士学位论文 引 言 5 图 11录调控蛋白一般以四聚体形式存在，对其调控的操纵子起转录激活作用。一般在操纵子上的结合位点有两个，一个结合位点 个激活位点 体作用方式见图 9。在无诱导物存在时，四聚体的 其中两个亚基和 合，结合位点一般为 外两个亚基和 合，结合位点在 左右，使 弯曲成一定角度。当有诱导物出现时，调节蛋白与 结合发生滑动，从而使 曲的角度发生变化。虽然发现单独可与调节蛋白结合，但 于介导调节蛋白与 合酶亚基的 结合是必须的，这一结合已经用酵母双杂交得到证明，通过这一结合可能增加了 控蛋白 控蛋白和 控蛋白在结构上相似，但在氨基酸序列上有很大区别。录调控蛋白通常起阻遏作用，但是目前发现的参与芳香类化合物降解调控的都是激活蛋白。例如， 的 998)，具体基因簇结构及代谢途径见图 1的 1994）， 的 的 998),这些都间位代谢途径的激活蛋白。但是在无诱导物存在的条件下它们可能起阻遏作用，这一点已经在 发现（ 001）。参与间位途径调控的如 参与 3-(3丙酸降解途径的 997）， 参与 41993）等都是激活蛋白。 纵子编码 6 个酶，负责将 3,4 二羟基苯甲酸转化为 这个 操纵子下游有两个操纵子， 别负责将 2 引 言 6 基苯甲酸转化为 3,4 二羟基苯甲酸。 图 1 3,4 二羟基苯甲酸降解基因簇和代谢途径 1 控蛋白 目前了解最深的参与芳烃化合物降解的 族调控蛋白是 于 粒上，负责 调控甲苯间位开环途径基因的表达 (981)。 调控对羟基苯甲酸羟化酶基因 达的 2001）， 的 001）， 的 1999）， 节编码对羟基苯甲酸单加氧酶基因 表达。 在 发现的 调控蛋白，调节编码对羟基苯乙酸单加氧酶 因的表达（ 996）， 因簇（图 1及到 44降解，包括两个操纵子， 者产生单加氧酶活性使 4成 3， 4受到 正调控；后者产生间位裂解途径的酶将 一步降解为参与 环的中间物。受到 负调控。当 信号分子（ 43合成为活化形式，与 动子结合，激活转录。 信号分子（ 4合而失去活性，从启动子上脱离 ，从而开启基因的转录。 中国农业科学院硕士学位论文 引 言 7 图 1 4解基因簇和代谢途径 1 4 控蛋白 除 了少数几个例外，其他参与芳烃化合物降解调控的阻遏蛋白均为 族转录调节蛋白，如 可阻遏苯乙酸（ 解操纵子（ 1998），这些操纵子编码有氧条件下降解芳香 类化合物的代谢基因。 因定位于 因下游，并且转录方向相同，但并未在同一个操纵子内， 因编码一个连接酶，形成苯乙酰辅酶 A，这是苯乙酸代谢的第一步。另外属于这一家族的调控蛋白还包括中国农业科学院硕士学位论文 引 言 8 调控香草酸脱甲基酶基因 2000）； 5， 调控联苯降解的 999； 2000； 2001）； 调控苯酚表达的 999， 2000） ， 基因簇及代谢途径见图 1 降解苯酚的基因主要分布在两个操纵子中， 者编码苯酚单加氧酶（ 邻苯二酚 2， 3 双加氧酶（ 后者编码将邻苯二酚降解为参与环的一系列酶。 码功能未知的蛋白。该基因簇主要受到三个蛋白的调控， 苯酚或粘 糠酸半醛（ 诱导下激活 表达， 表达。但是在该基因簇中，存在一个 族转录调节蛋白 调控蛋白第一次在降解苯酚的菌中发现。在苯酚存在时抑制 转录。并不抑制 转录。 图 1苯酚降解基因簇和代谢途径 1 控蛋白 目前仅发现 1 中 一个 族蛋白参与芳烃化合物降解的调控并起阻遏的作用， 因簇是降解对异丙基甲苯生成对异丙基苯甲酸，进一步在 因簇的作用下生成异丁酸、丙酮酸和乙酰辅酶 A（ 1997） ，具体基因簇结构和部分降解途径见图 1因簇包括 6 个基因 别编码单加氧酶的氧化酶和还原酶， 码一个乙醇脱氢酶， 码一 个乙醛脱氢酶， 码一个推测的外膜蛋白，在该基因簇中的功能未知。 码一个乙酰辅酶 A 合成酶，在该代谢途径中的功能未知。该基因簇受到 调控， 为一个阻遏蛋白抑制 纵子的表达，受到信号分子对异丙基苯甲酸（而不是对异丙基甲苯）的诱导开启基因的表达。 成分信号家族调控蛋白 中国农业科学院硕士学位论文 引 言 9 双成分信号转录体系包括两个成分，一个起感知作用的组氨酸激酶，一个是信号响应调控蛋白，组氨酸激酶 N 末端区域探测信号并催化中部一个保守组氨酸残基的 酸基随后经一个可逆的 酸中继体系传递给相应的调控蛋白的 活的调控蛋白随后介导相关基因表达（ 1994； 2004）。参与芳烃化合物降解调控的双成分信号转导体系有 1 和 统（ 1997；1999），调控甲苯降解操纵子 表达， 因位于该操纵子下游并同向转录，其它还有在 调控甲苯 4统 （ 2002）（图 1 调控联苯降解的1997）， 调控乙烯降解的 O， 2002）等。 在该