凝胶成像及Quantity One说明书.doc

GelDocTM XRThe Discovery Series Quantity One 1-D Analysis Software培训教程Bio-Rad目 录第一部分 仪器清点及安装2简介2仪器清点2仪器安装3仪器各组成部分介绍3图像采集5凝胶切割5注意事项5第二部分 仪器及Quantity One软件分析操作6简介6图像获取8基本图像优化12图像分析13一、 定量分析13二、 条带分析16三、 结果输出21常见问题及处理22订货信息24联系方式25附录：软件密码注册表26第一部分 仪器清点及安装简介：GelDoc XR和ChemiDoc XRS是Bio-Rad凝胶成像家族的两个成员，它们的特点是操作简便、功能齐全。它们采用自动控制的光学透镜CCD摄像头，便于进行缩放、聚焦和光圈大小等的调节，以实时采集图像。高精度的12位CCD使图像数据达到4096级灰度，能满足普通实验室各类凝胶以及印记膜的成像需求。除此以外，ChemiDoc XRS的CCD是一个可冷却45的超冷CCD，特别适合于化学发光等微弱信号的检测。Quantity One是凝胶成像仪附带的图像分析软件，并且可以直接控制这些仪器。拍好的图像直接通过Quantity One打开，可以灵活地实现蛋白及核酸的一维电泳凝胶分析以及聚类分析、克隆计数等，并可轻松实现各种分析结果的输出。仪器清点： - 2 -io-Rad Quantity One软件应用讲义选配件：170-7950 White Light Transilluminator 或 170-8001 White Light Conversion ScreenPC要求：仪器各组成部分介绍镜头及滤光片位控制面板紫外透射平台I Universal Hood（正面 大体）II控制面板Universal Hood电源开关（ChemiDoc另有镜头开关）III 背面开关及保险丝GelDoc镜头ChemiDoc镜头滤光片选择杆IV镜头及CCD V Universal Hood内顶部图像采集 用成像仪自带的荧光标尺和带刻度的透明塑料板，参照后文GelDoc XR成像的方法，按紫外透射、白光透射以及侧面白光三种模式分别采集一次图像。要求成像清晰、明暗适中。凝胶切割将抽屉式紫外透射平台完全拉开至最大，将待切割的样品放置其上。安装上有机玻璃保护屏，打开“Trans UV”和“Prep UV”。操作者戴上手套，站在保护屏后进行切胶操作。注意事项：1 安装ChemiDoc XRS的图像采集卡时，要先安装其驱动程序，再将图像采集卡插入；2 如果软件的密码狗不能被正常识别，请安装带补丁的驱动程序或向Bio-Rad安装工程师求助；3 在给用户安装图像仪和软件前，先提醒用户保存好申请来的密码、软件序列号和密码狗。4 培训仪器时，提醒用户不要将潮湿的样品长期放在暗箱内，以防腐蚀滤光片，更不要将液体溅到暗箱底板上，以免烧坏主板。5 提醒用户仪器用完，及时关上电源，特别是ChemiDoc XRS的CCD电源；6 提醒用户勿用控制成像仪的电脑上网，也不要自行重装电脑操作系统或给操作系统升级。第二部分 仪器及Quantity One软件分析操作培训目的：1 熟练掌握凝胶成像仪对一维电泳凝胶图像的获取；2 熟悉用ChemiDoc XRS对印迹膜的化学发光检测；3 熟悉Quantity One的定量分析和条带分析流程。时间安排：成像仪的使用培训大约需要2040分钟，Quantity One软件培训时间大约为1小时。简介凝胶电泳是每个做分子生物学的研究者天天都要打交道的基本技术。电泳之后的信息处理与电泳本身同样重要。目前有大量软件可以用于分析电泳结果，今天要向大家介绍的是Bio-Rad公司的1D凝胶分析软件Quantity One（Bio-Rad还有一个做2D凝胶分析的软件PDQuest）。Quantity One软件是常用1D凝胶分析软件中功能最强大，自动化程度最高的软件。这个软件的最新版本可以在Bio-Rad的网站（）免费下载，以供试用或用户升级之用。Quantity One软件的主要功能包括定量分析(Volumes Quick Guide)，电泳条带分析(Band Analysis)，差显分析(Differential Display Analysis)，克隆计数(Colony Counting Analysis)等，此外，还可以直接控制Bio-Rad公司的各类图像仪和ExQuest自动切胶仪，使您的凝胶分析工作变得极为轻松。Quantity One软件拥有与windows操作系统下绝大多数应用软件相同的友好界面。插入密码狗，打开Quantity One软件，可以看到最上缘蓝色横条幅是标题栏，往下依次是菜单栏和工具栏。每个菜单的主要功能如下：File图像打开、保存、引入、打印等操作Match分子量估算、条带匹配分析Edit图像普通编辑操作Volumn定量分析View图像缩放、三维视图、看光密度值等操作Analysis浓度估算、克隆计数等分析Image图像旋转、翻转、裁切等操作Reports分析结果输出Lane泳道分析Window窗口分析Band条带分析Help帮助、快捷菜单、软件注册等 往下一行是工具栏，上面每个按钮的功能见下表：打开文件图像显示控制条带分析工具保存操作显示条带匹配工具打印图像去除分析标记轮廓修改工具看全图图像工具打印快捷指南局部放大文字工具定量分析快捷指南拖曳定量工具条带分析快捷指南放大并居中灰度分析工具克隆计数快捷指南缩小并居中泳道分析工具Quantity One软件HelpQuick Guide快捷指南提示如何实现一个功能，如定量分析(Volumes Quick Guide)，电泳条带分析(Band Analysis)，差显分析(Differential Display Analysis)，克隆计数(Colony Counting Analysis)等。快捷指南下有1，2，3步骤，根据提示完成。使用Quantity One软件进行电泳结果分析，通常包括图像获取、图像优化、分析、结果输出四部分，参考下图：图像获取就是通过软件控制扫描仪（GS-800、PharosFX等）或凝胶成像系统（GelDoc、ChemiDoc、VersaDoc等）获取图像的过程。图像优化就是将扫描或拍照获得的原始图像进行初步处理，以便更好地进行后续分析。接下来是分析过程，根据分析的方法和目的不同，又可以分为定量分析、条带分析、克隆计数、差异（聚类）分析等等。不管如何分析，最终我们都必须通过软件的输出功能，得到我们想要的结果。Quantity One软件提供了多种结果输出方式。在接下来的几章里，我们将按照这个思路，一步步引导您使用这一软件。图像获取Quantity One 4.44.6版本可以控制Bio-Rad目前几乎所有的图像仪，如GelDoc XR、ChemiDoc XRS等。这些图像仪采集到的图像，可以直接保存成软件可直接分析的图像，即扩展名1sc的原始图像文件。下面将具体介绍如何通过Quantity One软件从GelDoc XR和ChemiDoc XRS获取图像。一 GelDoc XRGelDoc XR是Bio-Rad凝胶成像系统中最常用，操作最简便的仪器，它可以用来拍摄EB、SYBR Green等染料染的核酸电泳凝胶；Sypro Ruby、银染、考马斯亮蓝等方法染的蛋白电泳凝胶；以及化学显色的印记膜等。使用GelDoc XR之前，先接通电源，打开位于仪器背面右下角的电源开关；然后根据具体的应用选择合适的照明和滤光片位置。原则如下：模式1模式2模式3照明类型紫外透射白光透射侧面白光适用样品EB、SYBR Green、Sypro Ruby等需要紫外激发的透明样品金属银、考马斯亮蓝等染料染色，直接可见的透明样品化学显色等非透明可见样品载物平台抽屉式紫外透射平台白光转换屏(170-8001)或白光板(170-7950)抽屉式紫外透射平台光源按钮“Trans UV”白光板：“Trans UV”白光转换屏 白光转换屏有自己的电源开关，位于屏下方，打开后不必每次都关闭这个开关。：“Trans White”“Epi White”滤光片位IIO不管使用何种模式，基本的操作过程都是这样的：1 将样品置于适当的载物平台上2 关闭暗箱门3 调整滤光片4 打开相应光源5 接下来打开Quantity One软件，选择FileGelDoc XR，按以下顺序操作： 按下Live/Focus，成像仪进入实时成像； 选择照明模式，一般荧光样品选择UV,普通透射或反射样品选择White模式 注意：该选项对图像数据格式有影响，但不能代替光源选择。 此功能有三个上下键按钮：IRIS（光圈），ZOOM（缩放），FOCUS（聚焦），您可在软件上直接调节或在仪器面板上手工调节 调节步骤：a 调大IRIS，以看到图像 b点ZOOM,将胶适当放大 c 调节IRIS至合适大小（一般情况下尽量选择小光圈，因为小光圈景深大，图像更清晰) d调节FOCUS，至图像最清晰 单击Auto Expose,系统将自动选择曝光时间成像（系统默认0.15%的像素饱和的成像时间为最佳时间，在Options对话框中可以修改该项设置），如不满意，单击Manual Expose，并输入曝光时间（秒） 图像曝光满意后，按下“Freeze”按钮。 按下“Analyze”按钮，将弹出一个新窗口显示图像，以供分析。 第5步结束后，也可以按下“Save”键，保存图像。 选择合适的应用模式，鼠标点击会弹出如下图所示的菜单：a) 核酸凝胶或荧光染色的蛋白胶，选择UV Transilluminationb) 银染、考染的蛋白胶，选择White Transilluminationc) 不透明、不发光样品，选择White Epi Illuminationd) 信号较强的化学发光印记膜，选择Chemiluminescencee) 信号较弱的化学发光印记膜，选择Chemi Hi Sensitivityf) 如果要拍照特殊样品，如信号很弱的化学发光印记膜，选择Custom，并选择需要的照明方式及像素捆绑等；注意，选择完成后，要按下成像仪面板上相应的光源按钮，同时根据以下原则调整滤光片位：在a、b两种应用模式下，或在custom模式并选择紫外或白光透射时，将滤光片选择杆置于位置“I”处；其它模式或在custom模式并选择侧面白光或无照明时，将滤光片选择杆置于位置“O”处。 对焦，调节光圈，方法与GelDoc XR类似； 调节好以后，按下“freeze”； 获取图像，选择自动曝光或手动曝光，方法与GelDoc XR类似。对化学发光检测而言，信号较强的样品也可以选择自动或手动曝光，信号较弱的样品最好使用“Live Acquire”功能。点击该按钮，弹出如下对话框：第一行，填入最长曝光时间（以秒为计）；第二行，填入初次曝光时间（以秒为计）；第三行，填入需要曝光的次数，每次曝光都是前几次曝光时间的累加最后按“OK”键，开始曝光。注意：化学发光检测需要关闭所有光源，并将光圈“IRIS”调至最大。另外，建议先用检测普通非透明样品的方法对焦，再关闭光源，检测化学发光 当这个选项被选中时，软件将会使用动态平场技术消除图像中间和四周的亮度差异。对于步骤当中的a)、b）两种应用模式，曝光完成后软件会提示是否使用以前做过的平场参照。除非近期刚做过相同方式的平场参照，否则选则“No”。接下来，软件会提示取出样品，放入荧光参照板，打开紫外光源。如图所示：如果是在白光透射下做平场，则将样品取出，保留白光板或白光转换屏，打开相应光源。软件会自动生成平场，并用平场技术校正刚刚摄取的图像。关于动态平场更详细的叙述请参考Quantity One软件的Instruction Manual。基本图像优化通过图像仪采集的图像，可能会有偏斜、对比度不佳、数据关系错误等问题影响分析。所以新采集的图像应经过优化后再进行分析。优化的基本过程是：Rotate（旋转）Crop（裁剪）Transform（转化）。另外，当数据关系错误的时候，需要改变之。详细步骤见下。1旋转（Rotate） 在ImageRotate菜单中选择适当的旋转角度，其中“Custom Rotation”工具可以实现任意角度的旋转，点击后，图像上出现如下图所示的情况：图中出现一个白圈和黄色十字，鼠标靠近黄色箭头，可以任意角度拖动这个箭头。旁边有个小窗口显示所需要旋转的角度和弧度，点击“Rotate”按钮旋转即可完成，请保存旋转后图像。2裁剪（Crop） 裁剪的目的是去掉电泳区域以外的部分，仅保留从电泳起点到前缘有泳道的部分。选择ImageCrop，在图像适当的范围内画一个方框。鼠标移动到框边变成双向的箭头，可以改变框的大小和形状。最后鼠标移动到框内，当鼠标变成一剪刀形的时候，单击，选择“拷贝并裁剪”。3转化（Transform）优化图像显示，便于肉眼观察。选择ImageTransform，会弹出右图所示窗口：选择“Auto-scale”，软件会自动调整对比度至最优 这种对比度调整并不改变具体的灰度数据，只是将图中最“淡”的点显示成白色，最“深”的点显示成黑色。除此之外，有时还必须检查数据关系是否正确。即图中黑色部分的数据是否高于白色部分。正常情况下是的，但有时会反过来。这种情况往往出现在用软件分析其它公司的图像仪时或者使用GelDoc XR，第二步“Image Mode”选错的情况下。方法是：1选择ViewPlot DensityDensity at Cursor，在图像中颜色较深的地方点击一下，观察弹出的灰度数值2再在颜色较浅的地方点击一下，观察灰度数值。3比较前次数值是否大于后次的，如果是，则不用再进行任何改动；如不是，选择ImageInvert Data，按弹出的对话框的提示一步步往下做。最后进行一次“Transform”。图像分析Quantity One的图像分析功能相当强大，根据不同的需要，可以分为定量分析、条带分析、相似性分析以及克隆计数(用于蓝白斑筛选)等等，而且每种分析法都有独特的优点和输出方式。本章重点介绍常用的定量分析和条带分析方法，其余更细更深的功能请参考软件自带的用户手册。一 定量分析（Volumn Analysis）定量分析是计算选定区域内信号强度的总和，是Quantity One最方便的定量工具。这种分析方式考虑全定区域的真实形状，可用于电泳条带、斑点、大型芯片以等图像的定量。这种定量的方法可以扣除背景，可以按照用户的标准曲线计算出条带或斑点的浓度，但它不能计算分子量，也不能进行条带匹配和相似性分析。Quantity One软件称这类定量的结果为Volume。 Volume选定区域内所有像素信号强度的总和像素面积 Volume的单位：intmm2快捷指南Volumes Quick Guide，能够指导您对任意所选区域进行定量分析,此分析可以报告多种结果，常用的结果是相对浓度和绝对浓度（须提供标准品）。具体的操作方法如下：1 选择成像系统或打开已保存的文件(软件可以控制Bio-Rad所有的成像系统如GelDoc,ChemiDoc,VersaDoc,GS-800,FX,如不是Bio-Rad成像系统所摄取的图象，将图象保存为Tiff 必须是8位（bit）或16位（bit）无压缩的tiff文件文件格式，软件也可进行分析处理)2 Zoom Box，缩放，对图象进行放大观察3 选择待分析区域：Volumn Contour Tool等高线勾勒区域，自动连接浓度浓度相同的点，如U1 Volume Free hand Tool自由画笔选择区域，可以勾勒出无规则形状,如U2Volume Rect Tool 矩形区域选择，如U3Volumn Circle Tool圆形选择区域，如U4按上面4种方法选择需要定量的区域。5双击所选区域，出现如下窗口，定义样品类型，如未知样品Unkonwn(U1,U2即待计算样品)，背景Background(B1,B2，软件在算浓度时会将此区域的浓度自动扣除) 或标准样品Standard（Std1,Std2, 如果该样品是浓度标准样品，即定量标准，需在浓度concentration一栏输入该样品的浓度）。6 Select Tool选择不同区域7 Print Image打印图像8 Volume Analysis Report 定量报告结果。打开出现如下窗口，选择要报告的参数，主要有2个参数Volume、adj. Vol. (即adjusted volume) 和Concentration。Volume为定量值，adj. Vol. 为扣除背景后的定量值，如有浓度标准样品（Std），软件可报告Concentration绝对浓度。参数选好后，按下按钮“done”。 打印文本输出7软件报告如上图所示：按右侧输出按钮，可将表格保存成txt文件，按左侧打印按钮，可将报告打印出来。二条带分析（Band Analysis）条带分析是Quantity One最基本的分析工具，它可以自动识别电泳泳道和识别条带，依据泳道的平均光密度和条带宽度对每个条带进行模式化定量。这种分析方式虽然不如定量分析来得方便，但这样可以实现非常复杂的电泳分析，满足各种不同的结果需要。这种方式的最大优点在于它可以完全抛弃人为主观因素而进行全自动定量。用条带分析的方法进行定量的结果叫Trace Quantity（Trace Qty），计算方法是：首先软件自动计算条带上每一横排像素的平均光密度和平均光密度分布曲线，然后每个具体条带的定量值是平均光密度曲线的线下面积的积分，即：Trace Quantity平均光密度条带上下边界的距离Trace Quantity的单位：OD*mm条带分析中的条带定量模型下面介绍用此功能对泳道内的所有条带进行分子量确定，相对浓度分析1 打开已保存的文件(如不是Bio-Rad成像系统所摄取的图象，将图象保存为Tiff 必须是8位（bit）或16位（bit）无压缩的tiff文件文件格式，软件也可进行分析处理)2 Zoom Box，缩放，对图象进行放大观察3 Transform转化，调节图象的对比度黑白4 确定泳道(lane),并对泳道进行各种调整（实际实验中泳道往往不是垂直的而出现各种变形）。按下图所示在软件的工具栏中有一Lane Tool图标，包含有更多泳道编辑工具。Band Tool条带编辑工具包Lane Tool泳道编辑工具包5选择Frame Lanes，输入图像实际泳道(lane)数并确认。此时图像上泳道的位置上会出现一条条红线，每条红线就代表一根泳道。6选择Add/Adjust Anchors，此时泳道红线上会出现一些小圆圈。这些小圆圈称为锚定点(anchor)，锚定点规定了泳道走向。当泳道不直时，点击出现弯曲的泳道部位，就可以增加锚定点。鼠标按住锚定点，可以拖动锚定点，让每根红线始终位于泳道的中间线上。7Lane Background去除泳道背景。点击该按钮，选择一条适当的泳道点击之，然后在弹出的对话框中选“All Lane On”，在“Rolling Disk Size”中填入适当的数值 数值代表背景扣除数，值越大则背景扣除越少，被计入条带定量值越多，反之则背景扣除越多。从经验来看，该数值以240之间为宜。 8Detect Band，检测泳道内的条带，打开出现如下窗口。通过调节sensitivity灵敏度可调节检测出的条带数，调节Lane Width使代表表带的红色横线与条带宽度差不多宽。中间一行人工编辑按钮可以用来增加/减少条带、调节条带的上、下边界等。打开工具栏中Band Tool条带编辑工具包可看到更多编辑工具（如上图）人工编辑按钮9. Standard输入分子量标准，软件自带有许多Bio-Rad的分子量标准，如你用的是自己的标准，进入New Standard建立新的分子量标准，软件可以选择标准单位是MW（蛋白质）还是BP（核酸）等（左下图）。在Protein-Standard对话框中输入分子量数值，完成后单击赋值图标（右下图），回到图象文件上单击标准样品的泳道，软件自动将所输的分子量数值和泳道内的条带一一对应。赋值图标：告诉软件哪条是分子量标准样品的泳道输入分子量数值10. Band Attribute条带属性，在完成第9步以后，软件已自动计算出了其他未知条带的分子量,打开band attribute选择要报告的参数，这里我们选择Molecular Weight，图象上可以看到所有条带的分子量（红颜色标记），标准分子量为蓝色标记。11. Print Image打印图象相对丰度 （纯度）分子量条带号条带定量12. All Lane Report所有泳道条带结果报告。打开窗口，选择要报告的参数，如Mol.Wt.（分子量，如左下图），软件将报告结果（右下图），在报告的右下脚有一报告输出工具，点击可将报告结果输出成TXT文本格式或输出至剪贴板，可粘贴到EXCEL，WORD等文件下。注：Relative Qty输出每个条带的相对丰度，即在泳道中的占比，用百分数表示。但软件有两种相对丰度的计算方法，一种是单一条带占整个泳道（包括不属于任何条带的部分）的百分比，另一种是单一条带占泳道中所有条带的百分比。前者所有条带的百分比之和小于100，后者所有条带的百分比之和等于100。用户可以根据需要选择。方法是：选择Edit Preferences Application。在“Relative Quantity Calculation”的选项里根据需要选择。报告结果输出三、结果输出分析数据输出 分析数据、表格的输出在Analyze菜单下，根据分析的方法不同，可以选择输出（Report）的结果，或者打印表格。具体的方法参考前两部分的结果输出步骤。图像输出 Quantity One软件可以实现原始图像以及进行了各种分析后的图像的灵活输出。图像输出的格式有两种：JPEG格式和TIFF格式。这两种格式下的输出有着不同的特点。 JPEG格式：选择FileExport to JPEG Image，在弹出的对话框（如左图）中选择合适的图像质量，按下“Export”按钮即可。图像将输出成不可进一步编辑，扩展名”.jpg”的文件。这种输出方式的特点是可以做到“显示即输出”，图像显示多大范围、有哪些标记，就输出这样的范围，这些标记，如下图。TIFF格式：选择FileExport to TIFF Image，在弹出的对话框（如下图）中如选择“export view excluding overlays”，可输出不带分析标记的全部图像，且可以选择适当的分辨率（不能超过原始图像的分辨率）；如选择“export view including overlays”，就可输出带分析标记的图像，也可以做到“显示即输出”，但不能选择分辨率。常见问题及处理：1 问：为什么我新买的Quantity One软件几天前还能用，现在只能使用最基本的功能了？答：可能是密码未正确安装，而试用期已过。2 问：为什么我重新安装Quantity One软件后就不能使用了？答：可能是安装了超过版本限制的高版本Quantity One。3 问：我的密码狗还在，可密码找不到了，我该如何填写密码？答：可以暂时将电脑连到Internet上，打开Quantity One软件，选择HelpRegisterCheck License，或直接打电话800-820-5567，向Bio-Rad工程师询问。4 问：Quantity One软件能否分析通过其它公司成像仪或扫描仪得到的照片？答：可以，但前提是照片必须是未经压缩的TIFF (tif) 文件，且数据采集位数是8位或12位。5 问：我拍出的图片，条带很明显，为什么软件总找不到？答：打开Quantity One软件，鼠标放在图像上，同时按下Ctrl.+T，看看条带数据是否大于背景，如果不是，则参考基本图像优化，进行Invert Data。6 问：为什么我拍出来的照片，总有一根根很粗的背景？答：可能是应该使用滤光片而没有使用，把照明灯管摄入照片。7 问：为什么我用ChemiDoc XRS拍出来的照片，总有一条条向电泳条带