PCR扩增DNA片段及产物检测的方法20111123

聚合酶链式反应 聚合酶链式反应 PCR 扩增 扩增 DNA 片段片段 一 实验目的一 实验目的 1 学习 PCR 基因扩增的基本原理和操作方法 2 理解 PCR 基因扩增在分子生物实验技术中的重要性 3 了解引物设计的一般要求 二 实验原理二 实验原理 多聚酶链式反应 Polymerase Chain Reaction PCR 原理类似于 DNA 的变性和复制过程 即在高温 93 95 下 待扩增的靶 DNA 双链受热变性成为两条单链 DNA 模板 而后 在低温 37 65 情况下 两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链 DNA 模板结合 形成部分双链 在 Taq 酶的最适温度 72 下 以引物 3 端为合成的起点 以单核苷 酸为原料 沿模板以 5 3 方向延伸 合成 DNA 新链 这样 每一双链的 DNA 模板 经过一次解链 退火 延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链 DNA 分子 如此反复进 行 每一次循环所产生的 DNA 均能成为下一次循环的模板 每一次循环都使两条人工合 成的引物间的 DNA 特异区拷贝数扩增一倍 PCR 产物得以 2n的批数形式迅速扩增 经 过 25 30 个循环后 理论上可使基因扩增 109倍以上 实际上一般可达 106 107倍 PCR 反应系统的组成 引物 寡核苷酸 Taq DNA 聚合酶 模板 DNA 缓冲液 三 试剂与器材三 试剂与器材 1 试剂 10 EX Taq Buffer Mg2 plus dNTP Mixture 各 2 5 mM TaKaRa EX Taq 聚合酶 5U l 模板 DNA 已预先稀释 上 下游引物混合物 已预先稀 释 2 器材 微量移液器及吸头 硅烷化的 PCR 小管 PCR 扩增仪 PTC 100 台式高速冷 冻离心机 四 操作方法四 操作方法 1 编辑设定 PCR 扩增程序 2 PCR 管中加入灭菌水 缓冲液 四种 dNTP 引物 模板 聚合酶 3 运行程序进行扩增 4 电泳检测扩增结果 五 关键步骤与注意事项五 关键步骤与注意事项 1 试剂湿热灭菌 小管分装 防止污染 2 所用的 PCR 扩增管 微量移液器的吸头都 要灭菌 3 试剂混合时要在超净工作台中 戴上一次性手套 防止污染 要离心混匀 4 每次反应都要设置阴性和阳性对照 5 根据引物的融解温度设定退火温度 防止出 现非特异性扩增产物 六 思考题六 思考题 1 PCR 进行的的基本条件是什么 2 PCR 每一循环有哪几个步骤组成 3 影响 PCR 扩增的因素有哪些 4 优化那些条件可以最大限度的减少非特异性扩增 PCR 扩增产物扩增产物检测分析检测分析琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR 扩增反应完成之后 必须通过严格的鉴定 才能确定是否真正得到了准确可靠的预期 特定扩增产物 凝胶电泳是检测 PCR 产物常用和最简便的方法 能判断产物的大小 有 助于产物的鉴定 凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 前者主要用 于 DNA 片段大于 100bp 者 后者主要用来检测小片段 DNA 1 琼脂琼脂糖凝胶电泳糖凝胶电泳 这是实验室最常用的方法 简便易行 只需少量 DNA 即可进行实验 其原理是不同大小 的 DNA 分子通过琼脂糖凝胶时 由于泳动速度不同而被分离 经溴化乙锭 EB 染色 在紫外光照射下 DNA 分子发出荧光而判定其分子的大小 用于电泳检测 PCR 产物的琼脂糖浓度常为 1 2 应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖 这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质 1 制胶 琼脂糖凝胶厚度约为 3 5mm 过薄则加样孔样品会溢出来 过厚观察时荧 光穿透不强以至有些小片段 DNA 带型不易分辨 如配制 2 凝胶 100ml 称取琼脂糖 2g 于三角瓶中 加入 100ml 0 5 TBE 液 微波炉加热 2 5min 使琼脂糖完全溶解 注意不 要暴沸 置室温等温度下降至 60 时 加入终浓度 0 5 g ml 的 EB 液 充分混匀后倒板 注意排除气体 2 加样和电泳 上样时一般取 PCR 反应液 5 10 l 加入 3 l 溴酚兰液 充分混匀 加 入凝胶加样孔中 电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪 电泳工作液为 0 5 TBE 液 接通 电源 使样品由负极向正极移动 60 100V 恒压电泳约 30 60 分钟 3 检测 将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测 DNA 产物与荧光染料 EB 形成橙黄色荧光复合物 观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现 并与扩增时所设的阳性对 照比较 判断阳性或阴性结果 也可在电泳时以标准分子量作对照 判断其扩增片段是否 与设计的大小相一致 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐 但在引物纯化 PCR 扩增指纹图 多重 PCR 扩增 PCR 扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到 它与琼脂糖凝胶电泳比较具有如下优点 分辨率很强 可达 1bp 能装载的 DNA 量大 达每孔 10 gDNA 回收的 DNA 纯度高 其银染法的灵敏度较琼脂糖中 EB 染色法高 2 5 倍 避免了 EB 迅速退色的弱点 银染的凝胶干燥后可长期保存 聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨 DNA 片段的有效范围 1 制胶 在两块制胶玻璃板中间放上垫片 放上制胶架 拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板 制备适量合适浓度的凝胶 使之略多于胶板 制备 100 l 体积凝胶的配制方法见下表 不同浓度 聚丙酰胺凝胶的制法 试剂3 5 5 8 12 20 30 丙烯酰胺溶液 ml 11 616 626 64066 6 水 ml 67 762 726 64066 6 5 TBE ml 2020202020 10 过硫酸铵 ml 0 70 70 70 70 7 TEMED ml 0 0350 0350 0350 0350 035 在加入 TEMED 和 10 过硫酸铵后 立即混匀 倒入放置 45 角的玻璃板内 完全注满 注意不要有气泡 迅速将玻璃板放置水平位置 立即放成型梳子于腔顶并夹紧 待 30 60 分钟胶聚合后 取下胶板 放入电泳槽中固定 2 加样和电泳 上下槽中加入 1 TBE 电泳缓冲液 溢过加样孔 拔出梳子 排出加样孔中的气泡 将 PCR 产物或限制性内切酶消化产物 2 与 1 上样缓冲液混匀 用微量注射器加入加样孔底部 使样品在孔底成一层 两侧孔中加入标准分子量的 DNA Marker 以 2 10V cm 电压电泳 电泳时间足够长 使片断足以分开 待指示剂走到适宜位置时关 闭电源 将胶片取出 3 银染 分开两块玻璃板 将凝胶片放入 100ml 银染固定液中振荡 15min 双蒸水洗 3 次 每次 2min 然后将凝胶片转入 100ml 0 2 的 AgNO3中于摇床上染色约 10min 吸去 AgNO3 液 用双蒸水洗 3 次 每次 30s 加入 100ml 显色液约 7 10min 待 DNA 带显示清除时 吸去显色液 加入固定液 Na2CO3 静置 2 3min 取出凝胶观察 PCR 产物的电泳检测时间一般为产物的电泳检测时间一般为 48h 以内 有些最好于当日电泳检测 大于以内 有些最好于当日电泳检测 大于 48h 后带型后带型 不规则甚致消失 常见问题如下 不规则甚致消失 常见问题如下 一 假阴性 不出现扩增条带一 假阴性 不出现扩增条带 PCR 反应的关键环节有 模板核酸的制备 引物的质量与特异性 酶的质量及 PC R 循环条件 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究 模板模板 模板中含有杂蛋白质 模板中含有 Taq 酶抑制剂 模板中蛋白质没有消化除净 特别是染色体中的组蛋白 在提取制备模板时丢失过多 或吸入酚 模板核酸变性不彻底 在酶和引物质量好时 不出现扩增带 极有可能是标本的消 化处理 模板核酸提取过程出了毛病 因而要配制有效而稳定的消化处理液 其程序亦应 固定不宜随意更改 酶失活酶失活 需更换新酶 或新旧两种酶同时使用 以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致 假阴性 需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭 引物引物 引物质量 引物的浓度 两条引物的浓度是否对称 是 PCR 失败或扩增条带不理想 容易弥散的常见原因 有些批号的引物合成质量有问题 两条引物一条浓度高 一条浓 度低 造成低效率的不对称扩增 对策为对策为 选定一个好的引物合成单位 引物的浓度不仅要看 OD 值 更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳 一定要有引物 条带出 现 而且两引物带的亮度应大体一致 如一条引物有条带 一条引物无条带 此时 做 PCR 有可能失败 应和引物合成单位协商解决 如一条引物亮度高 一条亮度低 在稀 释引物时要平衡其浓度 引物应高浓度小量分装保存 防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分 导致引物变质 降解失效 引物设计不合理 如引物长度不够 引物之间形成二聚体等 Mg2 浓度浓度 Mg2 离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大 浓度过高可降低 PCR 扩增的特 异性 浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带 反应体积的改变反应体积的改变 通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul 30ul 50ul 或 100ul 应用多 大体积进行 PCR 扩增 是根据科研和临床检测不同目的而设定 在做小体积如 20ul 后 再做大体积时 一定要模索条件 否则容易失败 物理原因物理原因 变性对 PCR 扩增来说相当重要 如变性温度低 变性时间短 极有可能出现假 阴性 退火温度过低 可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模 板的结合而降低 PCR 扩增效率 有时还有必要用标准的温度计 检测一下扩增仪或水溶锅 内的变性 退火和延伸温度 这也是 PCR 失败的原因之一 靶序列变异靶序列变异 如靶序列发生突变或缺失 影响引物与模板特异性结合 或因靶序列某 段缺 失使引物与模板失去互补序列 其 PCR 扩增是不会成功的 二 假阳性二 假阳性 出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致 有时其条带更整齐 亮度更高 引物设计不合适引物设计不合适 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性 因而在进行 PCR 扩增时 扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列 靶序列太短或引物太短 容易出现假阳性 需重新 设计引物 靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 这种污染有两种原因 一是整个基因组或大片段的交叉污 染 导致假阳性 这种假阳性可用以下方法解决 操作时应小心轻柔 防止将靶序列吸入 加样枪内或溅出离心管外 除酶及不能耐高温的物质外 所有试剂或器材均应高压消毒 所用离心管及样进枪头等均应一次性使用 必要时 在加标本前 反应管和试剂用紫外线 照射 以破坏存在的核酸 二是空气中的小片段核酸污染 这些小片段比靶序列短 但有 一定的同源性 可互相拼接 与引物互补后 可扩增出 PCR 产物 而导致假阳性的产生 可用巢式 PCR 方法来减轻或消除 三 出现非特异性扩增带三 出现非特异性扩增带 PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致 或大或小 或者同时出现特异性扩增带与非 特异性扩增带 非特异性条带的出现 原因原因 一是引物与靶序列不完全互补 或引物聚合形成二聚体 二是 Mg2 离子浓度过高 退火温度过低 及 PCR 循环次数 过多有关 其次是酶的质 和量 往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现 酶量过多有时也会 出现非特