质粒DNA的提取与酶切

生物化学实验报告 质粒 DNA 的提取与酶切 质粒 DNA 的提取与酶切 0 质粒 DNA 的提取与酶切 一一 实验原理实验原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法 其基本原理为 当菌体在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解时 蛋白质与 DNA 发生变性 当加入中和液后 质粒 DNA 分子能够迅速复性 呈溶解状态 离心时留在上清中 蛋白质与染色体 DNA 不 变性而呈絮状 离心时可沉淀下来 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒是分子生物学研究的常规技术 碱法质粒抽提用到三种 溶液 溶液I 50 mM葡萄糖 25 mM Tris Cl 10 mM EDTA pH 8 0 溶液II 0 2 N NaOH 1 SDS 临用前混合 溶液III 3 M 醋酸钾 2 M 醋酸 1 溶液I的作用 对于任何生物化学反应 首先要控制好溶液的pH 因此选用适 当浓度和适当pH值的Tris Cl溶液 加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉 积到管子底部 EDTA是Ca2 和Mg2 等二价金属离子的螯合剂 可以抑制 DNase的活 性和微生物生长 此步骤菌体一定要悬浮均匀 不能有结块 否则会降低抽提得率 2 溶液II的作用 NaOH是最佳的溶解细胞的试剂 不管是大肠杆菌还是哺乳动 物细胞 碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解 这是由于细胞膜发生了从bilayer 双层膜 结构向micelle 微囊 结构的相变化所导致 SDS也呈碱性 但如果只用SDS 达不 到彻底溶解细胞的作用 加入SDS主要为下一步做铺垫 这一步操作要注意两点 第 一 时间不能过长 因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂 第二 必 须温柔混合 不然基因组DNA也会断裂 3 溶液III的作用 SDS在高盐浓度下发生沉淀 同时SDS能与蛋白质结合 平均 两个氨基酸上结合一个SDS分子 所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来 溶 液中的K 置换了SDS中的Na 而形成了不溶性的PDS 高浓度的盐使沉淀更完全 同 时 由于基因组DNA很长 容易被PDS共沉淀 2 M的醋酸可以中和NaOH 因为长时 间的碱性条件会打断DNA 基因组DNA一旦发生断裂 小于100 kb的片断 就不容易 与 PDS共沉淀 所以碱处理的时间要短 而且不得激烈振荡 否则最后得到的质粒上 会有大量的基因组DNA污染 这一步操作混合均匀后在冰上放置 可以使PDS沉淀更 质粒 DNA 的提取与酶切 1 充分 4 酚 氯仿 异戊醇的作用 PDS 的沉淀并不能将所有的蛋白质沉淀 酚可以使蛋 白质变性 作用大于氯仿 但水饱和酚的比重略比水重 碰到高浓度的盐溶液 离心 后酚相会跑到上层 不利于含质粒的水相的回收 加入氯仿后可以增加其比重 使得 酚 氯仿始终在下层 方便水相的回收 还有 酚与水有很大的互溶性 如果单独用酚 抽提后会有大量的酚溶解到水相中 而酚会抑制很多酶反应 比如限制性酶切反应 因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除 而用酚 氯仿混合 液进行抽提 跑到水相中的酚则少得多 微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必 担心酶切等反应不能正常进行 异戊醇的添加 主要可以使离心后上下层的界面更加 清晰 方便水相的回收 二二 试剂准备试剂准备 1 Solution I 100ml 50mM 葡萄糖 25mM Tris HCl PH8 0 10mM EDTA 10mg 100ml RNaseA 2 Solution II 100ml 0 2N NaOH 1 SDS 3 Solution III 100ml PH5 5 3M KAc 2M HAc 4 酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 5 70 乙醇 100ml 6 LB amp 培养基 200ml 前一次实验已准备 三三 实验步骤实验步骤 1 接种 实验前一晚进行 挑取单克隆 接种到 LB Ampr 或 Kan 液体培养基中 37 C 220r min O N 质粒 DNA 的提取与酶切 2 2 质粒提取 吸取 1ml 菌液于 Eppendorf 管中 8000 r min 离心 3min 弃尽上清 加入 150 l 冰预冷的 solutionI 涡旋振荡 30s 后置于冰上 3min 加入 300 l solution II 快速上下颠倒试管 4 5 次 置于冰上 3 5 min 再加入 225 l 冰预冷的 solutionIII 上下小心颠倒 5 6 次 置于冰上 3 5 min 12000 r min 离心 5 min 取上清 约 600 l 加入等体积的酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 混匀 12000 r min 离心 5 min 取上清 约 500 l 加入 2 倍体积冰预冷的无水乙醇 20 C 静置 2h 或 O N 12000 r min 离心 5min 去上清 沉淀用 400 l 冰预冷 70 乙醇洗 2 3 次 吹干 沉淀 加入 15 l 含 0 5U RNAase 的 ddH2O 溶解沉淀 37 C 静置 30min 20 C 保存 质粒酶切 向提含有质粒的小管中加入 20ul 酶切体系 质粒 8ul ECOR1 1ul H2O 8ul KPN1 1ul 10X Buffer 2ul 轻轻混匀 置于 37 度水浴 1h 终止反应 电泳 酶切产物电泳 直接取 5ul 加入点样孔 是否加入 loading buffer 与反应加 入试剂有关 质粒电泳需要加入 loading buffer 混匀后加入点样孔 3 电泳检测质粒提取结果 琼脂糖电泳进行鉴定质粒 DNA 时 多数情况下你能看到三条带 但不要认为你看到 的是超螺旋 线性和开环这三条带 碱法抽提得到质粒样品中不含线性 DNA 用 EcoRI 来 线性化质粒后再进行琼脂糖电泳 就会看到线性质粒 DNA 的位置与这三条带的位置不一 样 其实这三条带以电泳速度的快慢而排序 分别是超螺旋 开环和复制中间体 即没有 质粒 DNA 的提取与酶切 3 复制完全的两个质粒连在了一起 如果你不小心在溶液 II 加入后过度振荡 会有第四条 带 这条带泳动得较慢 远离这三条带 是 20 100kb 的大肠杆菌基因组 DNA 的片断 非 常偶然的是 有时候抽提到的质粒会有 7 10 条带 这是由于特殊的 DNA 序列导致了不 同程度的超螺旋 超螺旋的圈数不同 所致 电泳处理结果如下 四四 结果分析 结果分析 电泳图中左