氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化.doc

1 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。二、实验原理带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，需要导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得、纯的重组质粒DNA，满足进一步的DNA序列测定、外源基因的宿主细胞表达、制备探针DNA等需要。含外源DNA片段的质粒DNA导入细菌如大肠杆菌的过程称为转化(transformation)过程。转化的概念来源于遗传学,细菌细胞的生物学特性由于吸收外源DNA而发生遗传特征改变称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA状态称感受态，用理化方法诱导细菌进入感受态的过程称为致敏过程。重组DNA转化细菌技术操作的关键是利用化学试剂诱导细菌细胞进入感受态，以便吸收外源DNA进入细菌胞内。基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖, 重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。Ca+处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA愈小，转化率愈高。环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。除外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，促使DNA进入细菌。转化率最高达109-1010转化子/g闭环DNA。电击法因操作简便也愈来愈被各实验室采用。为了转化成功，本实验室购买了“北京博大泰克生物基因技术有限责任公司”的“高效感受态DH5a细菌细胞”，可省略制备DH5a感受态细胞的实验步骤，直接进行转化。三、仪器与试剂1隔水式电热恒温培养箱，水浴锅，台式冷冻恒温振荡器，低温离心机，净化工作台。2待转化质粒DNA。3高效感受态DH5a细菌细胞，试剂A，无菌双蒸水。4LB液体培养基，LB固体培养基(含氨苄青霉素100g/ml)。5100mmol/L氯化钙溶液(已消毒)。四、实验步骤（一）.实验室感受态细胞的制备和转化方法（此过程只作了解）：1感受态细胞的制备：(1)需在超净台内操作，用接种环挑取单克隆大肠杆菌的DH5菌落于2ml LB液体培养基中,37振荡培养过夜。(2)将上述过夜培养的细菌按1：100的比例转接至5ml LB液体培养基中振荡培养2-3小时(OD600约0.20.4)。(3)将上述生长对数期的菌液置冰上10分钟，4离心8000rpm, 30秒,弃去上清。(4)用100mmol/L的氯化钙溶液400ul悬浮菌体，冰浴10分钟，4离心，4000rpm，5分钟，弃去上清。（5）再把菌体悬浮在400ul冰上预冷的100mmol/L氯化钙溶液中，此菌液即为感受态细菌，按100ul分装在已消毒的Eppendorf管内，置4冰箱中备转化用。2转化：（1）制冰盒一个，打开净化工作台电源，使其处于工作状态，将水浴锅调至42，涂布棒浸泡在75%酒精中，以下操作除孵育、振荡菌液外，其余均需在净化工作台内进行。（2）从4冰箱中取出感受态细菌和从-20冰箱中取出质粒DNA的Eppendorf管各一支，置冰盒内。（3）在净化工作台内，将质粒DNA 1ul加入感受态细菌100ul 取Eppendorf管内，混匀，置冰上30分钟。（4）然后立即置42水浴中90秒，不要摇动试管，取出后置冰盒中冷却2分钟。（5）向每管中加入900ul LB液体培养基（无氨苄青霉素），在37摇床上温和摇动，转速200 rpm，1小时。（6）取出37预热了30分钟的LB琼脂固体培养基（含氨苄青霉素100ug/ml）平皿，点上酒精灯，将消毒浸泡的涂布棒凉干。（7）将转化的感受态细胞用涂布棒均匀地涂布在LB琼脂固体培养基（含氨苄青霉素）平皿上，做上标记。（8）铺菌平皿倒置在培养箱中，37培养12小时，长出单菌落。（9）取消毒玻璃试管一支，加3ml LB液体培养基、3ul氨苄青霉素（0.1mg/ul），将培养出的单菌落用消毒牙签或接种棒挑出一个菌落融入试管，置37摇床上温和摇动，转速200 rpm，12小时。（二）.基因公司提供的高效感受态DH5a细菌细胞转化方法：1制冰盒一个，打开净化工作台电源，使其处于工作状态，以下操作除孵育、振荡菌液外，其余均需在净化工作台内进行。2从-80冰箱中取出“高效感受态DH5a细菌细胞”一支，“试剂A”，从-20冰箱中取出无菌双蒸水一支和待转化的质粒DNA一支，均置冰盒内。3取消毒1.5 ml Eppendorf管一支，用移液器将待转化质粒DNA 1ul、“试剂A”20 ul、无菌双蒸水80 ul，分别吸入消毒1.5 ml Eppendorf管内混匀，冰上备用。将高效感受态DH5a细菌细胞80-100 ul吸入消毒1.5 ml Eppendorf管内混匀，冰浴20分钟。随后，室温放置10分钟。4在1.5 ml Eppendorf管内加入400ul LB液体培养基，37，200rpm振荡10-40分钟。5随后取100-600 ul铺平板，于37温箱培养12-16小时。五、注意事项1制备感受态细胞前，一定要保证培养的宿主菌处于对数生长期且繁殖代数应基本一致，这也是细菌做转接培养并测其OD值的原因。2制备感受态细胞的过程中，每一步操作的动作要轻柔，尤其是悬浮细胞时要避免用旋祸混