克隆生物技术论文.doc

克隆生物技术论文 克隆原指以幼苗或嫩枝插条以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物如扦插和嫁接下面是小编为大家精心推荐的克隆生物技术论文希望能够对您有所帮助 猪USF1基因克隆与序列分析 摘要：研究克隆了猪USF1基因1382bp的cDNA序列(登录号：EF219407)和5516bp的DNA序列(登录号：EF625885)序列分析发现猪USF1基因编码区序列与人、小鼠的同源性分别为99%和98%基因组序列分析发现猪USF1基因包含11个外显子和10个内含子内含子的剪接方式均符合“GTAG”法则 关键词：猪;USF1基因;克隆;序列分析 中图分类号：S828;Q78文献标识码：A文章编号：04398114()24617503 上游刺激因子1(Upstreamstimulatoryfactor1USF1)是螺旋环螺旋亮氨酸拉链(HLHLZIP)转录因子家族成员之一1可以与USF2形成二聚体并能识别DNA的Ebox序列调节基因转录2人类USF1基因位于1q22q233并广泛表达于机体的各个组织调控糖和脂肪代谢基因的表达4此外USF1基因还具有调节免疫反应和细胞周期的功能5研究发现USF1基因可以作为调节治疗人的胰岛素抵抗葡萄糖不耐症、II型糖尿病和向心型肥胖易感症的候选基因69本研究利用EST信息和测序的方法克隆了猪USF1基因并进行了序列分析为进一步研究该基因对猪生长发育的调控机理具有重要的意义 1材料与方法 1.1试验材料 采集4月龄大白猪(湖北省农业科学院畜牧兽医研究所原种猪场)的肌肉组织用液氮速冻置于 70中利用TRizol法提取总RNA反转录得到cDNA利用DNA提取试剂盒天根生化科技(北京)有限公司提取DNA贮存于20 pMD18Tvectorsystem、DH5购自宝生物工程(大连)有限公司;GelExtractionKit购自生工生物工程(上海)股份有限公司 1.2引物设计 以人的基因序列为探针利用NCBI中的BLAST工具在GenBank数据库中搜索同源序列筛选猪的同源性EST(标准：长度200bp相似性80%)用DNAStar软件包中的SeqMan程序进行EST序列拼接参照拼接的contig(重叠群)采用Primer5.0软件设计引物U1F/U1RU2F/U2RU3F/U3R等3对引物扩增USF1基因的cDNA序列参照USF1基因的cDNA序列设计U4F/U4RU5F/U5RU6F/U6RU7F/U7RU8F/U8RU9F/U9R等6对引物(表1)扩增USF1基因的序列引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成 1.3PCR扩增与测序 PCR扩增体系为25L包括50ng模板DNA、2.5mmol/L1TaqBuffer、1.5mmol/LMgCl2、2.5mmol/LdNTPs、0.5mmol/LPCRprimers、2UTaqDNA聚合酶PCR反应程序为：94预变性4min;94变性45s退火(温度、时间根据引物来确定)72延伸90s35个循环;最后72延伸10minPCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测用GelExtractionKit试剂盒纯化回收与pMD18Tvectorsystem连接并转化大肠杆菌DH5将阳性克隆送至北京奥科生物技术有限公司测序 2结果与分析 2.1RTPCR扩增USF1基因 以大白猪cDNA为模版利用引物U1F/U1RU2F/U2RU3F/U3R均扩增出了特异带RTPCR扩增产物结果如图1所示将PCR产物回收、纯化、克隆测序测序结果显示引物U1F/U1R扩增产物长度为613bp(图1a)引物U2F/U2R扩增产物长度为312bp(图1b)引物U3F/U3R扩增产物长度为520bp(图1c) 2.2猪USF1基因的cDNA序列同源性分析 利用DNAStar软件的SeqMan程序将RTPCR扩增得到的片段进行拼接得到一条长1382bp的cDNA序列将获得的猪USF1基因的cDNA序列分别与人USF1基因cDNA序列(NM007122)和小鼠序列(NM009480)进行比对结果表明猪与人、小鼠的同源性分别为99%和98%确定所获取的序列为猪的USF1基因提交到GenBank得到登录号为EF219407 2.3猪USF1与部分物种USF1的进化关系 利用GenBank已有的USF1蛋白质序列：NP001001161(USF1Cattle)NP001007486(USF1Gallus)NP009053(USF1Human)NP033506(USF1Mouse)NP113965(USF1Rat)以及猪USF1基因编码的氨基酸序列利用ClustalW软件对6个物种的USF1氨基酸序列进行了序列比对结果发现猪与人和牛的同源性达到了99%与小鼠和大鼠的同源性达到了98%并构建了系统进化树(图2) 2.4猪USF1基因组序列的克隆和序列分析 根据人的cDNA序列和人的基因组序列比对结果预测的猪USF1基因内含子参照分离得到的基因序列设计U4F/U4RU5F/U5RU6F/U6RU7F/U7RU8F/U8R和U9F/U9R等6对引物以大白猪基因组DNA为模板PCR扩增猪USF1基因的10个内含子序列扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3 引物U4F/U4R在猪基因组中的扩增片段长度是2094bp其中第1内含子的长度为2007bp;引物U5F/U5R在猪基因组中的扩增片段长度740bp其中第23内含子的长度分别为363bp和157bp;引物U6F/U6R在猪基因组中的扩增片段长度783bp其中第45内含子的长度分别为301bp和241bp;引物U7F/U7R在猪基因组中的扩增片段长度600bp其中第67内含子的长度分别为249bp和135bp;引物U8F/U8R在猪基因组中的扩增片段长度656bp其中第89内含子的长度分别为153bp和249bp;引物U9F/U9R在猪基因组中的扩增片段长度690bp其中第10内含子的长度为192bp利用DNAStar软件的SeqMan程序将扩增得到的片段进行拼接得到一条5516bp的DNA序列将序列拼接提交到GenBank收录号为EF625885基因组序列分析发现猪USF1基因包含11个外显子和10个内含子内含子的剪接方式都符合“GTAG”法则3小结与讨论 本研究中猪USF1基因的cDNA序列与人和小鼠的同源性分别为99%和98%;编码区的高度保守性证实了所分离基因的正确性同时也为利用小鼠等模式动物的基因信息来进行畜禽基因组学的研究提供依据 脊椎动物间的基因序列具有高度的保守性根据已知物种的基因组序列可以预测其他物种同源基因的基因序列本研究利用人USF1基因序列预测了猪USF1基因序列并通过试验获得了相应的基因组序列测序结果表明所获得的候选基因的内含子和外显子组成及相对位置与预测结果一致且内含子的剪接方式均符合“GTAG”法则 参考文献： 1GREGORPDSAWADOGOMROEDERRGetal.TheadenovirusmajorlatetranscriptionfactorUSFisamemberofthehelixloophelixgroupofregulatoryproteinsandbindstoDNAasadimerJ.GenesDev19904(10)：17301740. 2SIRITOMWALKERSLINQetal.MembersoftheUSFfamilyofhelixloophelixproteinsbindDNAashomoaswellasheterodimersJ.GeneExpression19922(3)：231240. 3SHIEHBHSPARKESRSGAYNORRBetal.Localizationofthegeneencodingupstreamstimulatoryfactor(USF)tohumanchromosome1q22q23J.Genomics199316(1)：266268. 4LEEJCLUSISAJPAJUKANTAP.Familialbinedhyperlipidemia：Upstreamtranscriptionfactor1andbeyondJ.CurrentOpinioninLipidology17(2)：101109. 5TERRAGNIJNAYAKGBANERJEESetal.TheEBoxbindingfactorsMax/MntMITFandUSF1ActcoordinatelywithFoxOtoregulateexpressionofProapoptoticandcellcyclecontrolgenesbyphosphatidylinositol3kinase/Akt/GSK3signalingJ.JournalofBiologicalChemistry286(42)：3621536227. 6PAJUKANTAPLILJAHESINSHEIMERJSetal.Familialbinedhyperlipidemiaisassociatedwithupstreamtranscriptionfactor1(USF1)J.NatureGene36(4)：371376. 7KOMULAINENKALANNEMAUROKetal.RiskallelesofUSF1genepredictcardiovasculardiseaseofwomenintwoprospectivestudiesJ.PlosGenetics2(5)：672681. 8COONHXINYHOPKINSPNetal.Upstreamstimulatoryfactor1associatedwithfamilialbine