双歧杆菌三联活菌肠溶胶囊对高脂饮食所致大鼠非酒精性脂肪肝的疗效及机制探讨改.doc

文章编号：1005-376X(2013)07-0000-06 【论 著】双歧杆菌三联活菌肠溶胶囊对高脂饮食所致大鼠非酒精性脂肪肝的疗效及机制探讨冯丽英,沈颖娟,于书雷(河北医科大学第二医院 消化内科,河北 石家庄 050000)【摘 要】 目的 观察微生态制剂贝飞达（双歧杆菌三联活菌肠溶胶囊）治疗高脂饮食所致大鼠非酒精性脂肪肝的疗效并探讨其可能的作用机制。方法 雄性SD大鼠32只，适应性饲养1周后，随机分为3组，正常组：12只给予普通饲料喂养；模型组：12只，贝飞达治疗组：8只，均给予高脂饲料喂养；于喂养12周末正常组及模型组各处死4只，经肝组织HE染色确定造模成功后，贝飞达治疗组给予贝飞达0.113 g/(kgd)灌胃,于16周末全部处死。检测大鼠血清AST、ALT、TC、TG、LDL、HDL、血清内毒素水平，观察其肝组织学变化。 结果 模型组于高脂饲料喂养12周末出现脂肪肝，与正常组比较，模型组大鼠血清AST、ALT、TG、TC、LDL、HDL及血清内毒素水平均明显升高（P0.01）。贝飞达治疗组大鼠各项指标较模型组均有显著改善，肝脏脂肪变性程度减轻。结论 微生态制剂贝飞达可能通过改善肠道菌群紊乱，减轻内毒素血症，从而调节肝脏脂质代谢紊乱，对非酒精性单纯性脂肪肝起到治疗作用。【关键词】贝飞达;非酒精性脂肪性肝病；肠源性内毒素血症 【中图分类号】R378.992 【文献标识码】ATo explore the effect and mechanisms of Beifeida on nonalcoholic fatty liver disease rat model FENG Li-ying, SHENG Ying-juan, YU Shu-lei(Department of internal Medicine, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000,Hebei Province, China) 【Abstract】 Objective To explore the therapeutic effect and mechanisms of microbial pharmaceutics Bifid.Triple Viable Capaules Dissolving at Intestines in the nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) in rats fed by high-fat diets. Methods 32 male Sprague Dawley rats were randomly assigned into 3 groups after fed with normal diet for 1 week. The control group (n=12) was fed with normal diets. The model group (n=12) and the therapy group (n=8) were fed with high-fat diets (consisting of 88% normal diet + 10% lard + 1% cholesterol + 5% egg yolk powder). 4 Rats in control and model groups were killed at 12 weeks, and pathology was observed by HE stain to make sure the model was successed. Whilst the therapy group was treated with microbial pharmaceuticals which named as Bifid.Triple Viable Capaules Dissolving at Intestines 0.113 g/(kgd). All the rats were executed at the end of 16 weeks. Blood samples were collected for detection of serum aspartate transaminase (AST), alanine aminotransferase (ALT), total cholesterol (TC), thermogravimetry (TG), low density lipoprotein (LDL), high density lipoprotein (HDL) and endotoxin. The histological changes of liver tissues were observed by HE stain. Results Nonalcoholic fatty liver disease formed in the model rats at the end of 12 weeks. Comparde with normal control group, the levels of AST, ALT, TC, TG, LDL, HDL and endotoxin in the serum increased in the model group (P0.01). The above indexes in the therapy group were improved obviously. Conclusion Microbial pharmaceutical Bifid.Triple Viable Capaules Dissolving at Intestines by the action of regulating gut microbiota, lighting endotoxin and regulating lipid metabolism treatment nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). 【Key words】Beifeida; Nonalcoholic fatty liver disease；Intestinal endotoxemia随着人们生活水平的不断提高，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease ,NAFLD)的发病率日益增高。但其目前尚无确切的有效治疗药物。研究发现NAFLD患者伴有小肠细菌过度生长(SIBO)1,2，SIBO可以影响体内脂质代谢，增加肝脏脂质沉积，对非酒精性脂肪肝的发生发展起到主要作用3。本研究通过高脂饮食建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，检测其血清内毒素水平，并应用微生态制剂贝飞达对其进行干预，以探讨贝飞达对大鼠非酒精性脂肪肝的疗效及其作用机制。1 材料与方法1.1 材料 雄性SD大鼠32只，体重180200 g(由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号1104150)。微生态制剂贝飞达由山西省晋城海斯制药有限公司提供。胆固醇由南京新百药业有限公司提供。猪油及蛋黄粉购自广州金益食品有限公司。鲎试剂盒由湛江安度斯生物有限公司提供。全自动生化仪购自德国Bayer公司，由河北医科大学第二医院生化实验室提供。1.2 实验动物及分组 实验大鼠随机分为正常对照组12只，模型组12只，贝飞达治疗组8只，除正常对照组给予普通饲料外，其余各组均给予高脂饲料（88%普通饲料+10%猪油+1%胆固醇+5%蛋黄粉），各组大鼠自由进食水，分笼（每笼4只）饲养于(252)、明暗各12 h的动物实验室内。喂饲12周取正常组和模型组各4只处死，行肝组织HE染色确定大鼠非酒精性脂肪肝模型成功后，治疗组给予双歧杆菌三联活菌肠溶胶囊0.113g/（kgd）灌胃，正常对照组及模型组给予等容量蒸馏水灌胃。_【收稿日期】2013-04-23【作者简介】冯丽英(1959-),女,主任医师,从事脂肪性肝病和病毒性肝炎研究,Email:1.3 方法 治疗4周后统一处死大鼠，处死前一晚禁食，不禁水。各组动物经4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后处死，无菌无热源件下于下腔静脉取血5 mL，在3000 r/min离心15 min分离血清用于：（1）鲎试剂法测定血清内毒素水平；（2）采用全自动生活分析仪测定血清谷丙转氨酶(AST)，谷草转氨酶(ALT)，总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白(HDL)，低密度脂蛋白(LDL)。采血后处死动物，迅速取出肝脏，取肝左叶用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色用以观察肝组织病理变化。1.4 统计学方法 实验所有结果均用均数标准差（s）表示，通过SPSS 13.0统计软件,采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对各组均数进行显著性检验,相关性采用直线相关分析,P0.05为差异有统计学意义。相关系数r值界于1+1，r为正表示正相关，r为负表示负相关。2 结果2.1 大鼠体质指标变化 正常对照组大鼠精神充沛，灵活好动，皮毛整洁有光泽，体重逐渐增加；而高脂组最初较正常组体重明显增加，8周后体重较前增长缓慢，精神萎靡，性情温顺，且喜卧懒动，皮毛凌乱，光泽度差，大便稀松。2.2 血清生化指标及内毒素水平变化 与正常组比较，模型组大鼠体重，肝湿重，Lees指数均明显增高（P0.01）；与模型组比较，贝飞达治疗组大鼠体重，肝湿重，Lees指数均明显下降（P0.01）（见表1）。与正常组比较，模型组大鼠各生化指标均明显增高（P0.01）；与模型组比较，贝飞达治疗组中ALT、LDL水平明显下降（P0.01）, AST、TG、TC和HDL水平亦较模型组下降(P0.05)（见表2，表3）。与正常组比较，模型组大鼠血清内毒素水平明显增高(P0.01);与模型组比较，贝飞达治疗组大鼠血清内毒素水平明显下降(P0.01)（见表3）。表1 各组大鼠体质变化分组鼠数（只）体重（g）肝湿重（g）Lees指数（%）模型组8570.8513.41a19.812.47a0.0350.005a治疗组8524.317.22b15.361.23b0.0290.002b正常组8507.4311.6512.910.780.0250.002注:与正常组比较,aP0.01;与模型组比较,bP0.01。表2 各组大鼠血脂变化分组TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL(mmol/L)LDL(mmol/L)模型组0.600.08a1.200.18a0.650.06a0.350.06a治疗组0.500.09b1.020.17b0.730.06b0.180.15c正常组0.310.080.680.160.820.080.210.05注:与正常组比较,aP0.01;与模型组比较,bP0.05,cP0.01。表3 各组大鼠肝功能及血清内毒素水平变化分组ALT(U/L)AST(U/L)内毒素(EU/mL)模型组718.73a204.8818.22a0.2380.015a治疗组45.8815.10b183.0018.47c0.1710.020b正常组417.43157.8817.600.1180.010注:与正常组比较aP0.01;与模型组比较aP0.01,cP0.05。2.3 血清内毒素水平与各生化指标的相关性分析 内毒素水平与ALT、AST、TC、TG和LDL水平均成正相关，相关系数分别为0.802、0.746、0.757、0.801和0.916，均P0.01；内毒素水平与HDL水平成负相关，相关系数为0.660，P0.01。2.4 肝组织病理学变化 肉眼可见：正常组大鼠肝脏为鲜红色，边缘锐利，表面光滑；模型组肝脏体积明显增大，颜色呈土黄色，质软，与周围组织有粘连，切面油腻；贝飞达组肝脏接近正常，表面呈浅黄色，油腻状减轻。光镜下观察：正常组大鼠肝小叶结构完整，中央静脉周围有放射状排列的肝细胞索，窦间隙均匀、清晰，汇管区清晰可辨，无明显炎细胞浸润；模型组肝细胞均呈弥漫性大泡或小泡脂肪变性，以小泡变性为主，肝细胞脂肪变性面积达到2/3以上，脂变肝细胞以中央静脉周围最为明显，极度肿胀呈圆形，体积较正常明显增加，胞浆内充满大量脂肪空泡，界限不清，肝窦狭窄；贝飞达组脂肪变程度较模型组明显减轻。正常组 HE400 模型组 HE400 治疗组 HE400图1 肝组织病理学变化3 讨论近年研究证实，肠道菌群紊乱在非酒精性脂肪肝的发生发展中具有重要作用。最近的一项临床研究显示78%的NAFLD患者存在小肠细菌过度生长（SIBO）4。SOZA等5在不伴有糖尿病的NAFLD患者中检测到了内毒素,说明SIBO也可能是非酒精性脂肪肝发病过程中的始动因素6,7。SIBO可通过产生内毒素、TNF、IL-8等肝毒性物质对肝脏造成损害，同时可增加胰岛素抵抗（IR）等与NAFLD发生发展有关的各种因素的作用，影响肝脏脂质代谢并造成肝脏损伤3。在SIBO的致病机制中，内毒素被认为是最重要的因素之一3,8。大量研究发现包括NAFLD在内的各种肝脏疾病均伴有不同程度的肠源性内毒素血症911。内毒素可通过干扰机体脂质代谢促进NAFLD的发生发展。有人通过在大鼠体内注入脂多糖后大鼠出现体重增加及空腹血糖和胰岛素水平的升高，且肝脏甘油三酯增加，说明内毒素在NAFLD患者肝脏脂质沉积中起到重要作用8。另一方面内毒素可以激活肝脏Kupffer细胞，刺激一氧化氮及TNF、IL-6等细胞因子的释放12，对肝细胞造成损害，加速NAFLD的进展。本研究通过连续12周的高脂饮食成功建立NAFLD模型，其肝组织病理符合NAFLD的病理改变，我们发现模型组大鼠较正常组大鼠的血清内毒素水平明显升高（P0.01），且模型组大鼠存在明显的血脂异常，其血清TC、TG和LDL明显升高（P0.01），而血清HDL水平显著下降（P0.01）。提示NAFLD患者存在内毒素血症及脂质代谢紊乱，这与文献报到结果一致。另外本研究对大鼠血清AST,ALT进行检测发现模型组大鼠血清AST, ALT水平亦明显升高（P0.01）。表明内毒素血症在非酒精性单纯性脂肪肝进展为非酒精性脂肪性肝炎过程中具有重要作用。本研究还对血清内毒素水平与血清AST、ALT、TC、TG、LDL和HDL水平进行了相关性分析，发现血清内毒素水平与血清AST、ALT、TC、TG和LDL水平成正相关，与血清HDL水平成负相关(均P0.01)。充分说明内毒素在NAFLD发生发展过程中具有重要作用。微生态制剂，是利用正常微生物或促进微生物生长的物质制成的活的微生物制剂。其可促进正常微生物群生长繁殖及抑制致病菌生长繁殖，减少细菌内毒素等有害物质的产生，快速构建肠道微生态平衡，改善肠道菌群紊乱状态。有人应用微生态制剂对Lepob/ob大鼠及非酒精性脂肪肝大鼠进行治疗，并取得了显著疗效，推断微生态制剂可能通过改善肠道菌群，调节机体脂质代谢紊乱，抗脂质过氧化反应，抗炎等综合作用防治非酒精性脂肪肝 1316。另有相关研究发现益生菌可降低血清总胆固醇、LDL及甘油三酯水平1719。但上述研究所应用的益生菌菌种单一或为非肠溶剂型，不能有效的避免胃酸对其的杀灭作用，而本研究所应用的微生态制剂贝飞达是长型双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌经适当配合而成的活菌制剂。每克含长型双歧杆菌1.0106 CFU，嗜酸乳杆菌1.0106 CFU，粪肠球菌1.0106 CFU。三者组成了一个在不同条件下都能生长、作用快而持久的联合菌群，且为肠溶剂型，服用后可在整个肠道黏膜表面形成一道生物屏障，抑制有害菌产生内毒素，维持人体肠道正常的生理功能。我们通过应用微生态制剂贝飞达对非酒精性脂肪肝模型大鼠进行4周的灌胃治疗发现治疗组大鼠较模型组大鼠肝组织病理明显好转，血清内毒素水平明显下降（P0.01），且治疗组大鼠较模型组大鼠血清TC、TG和LDL水平均明显下降，血清HDL水平显著升高，差异均具有统计学意义，表明肠道菌群紊乱及肠源性内毒素血症可影响肝脏脂质代谢，而微生态制剂贝飞达可减轻NAFLD患者内毒素血症并对脂质代谢有明显的调节作用，因此我们推断微生态制剂贝飞达对NAFLD患者有治疗作用，其机制可能是通过调节肠道菌群，减轻内毒素血症，从而影响脂质代谢，减轻肝脏脂质沉积，但有关内毒素影响脂质代谢的具体机制有待进一步研究。本实验同时对治疗组大鼠血清AST、ALT亦进行了检测，发现治疗组大鼠较模型组大鼠AST、ALT水平下降，表明微生态制剂同时具有减轻肝脏炎症作用，其机制可能是通过减轻肠源性内毒素血症，从而减少内毒素对肝脏kupffer细胞的刺激作用，最终减少炎症因子的释放及其对肝细胞的损害作用。综上所述，本研究通过应用微生态制剂贝飞达对大鼠非酒精性脂肪肝进行治疗，证实贝飞达可能通过调节肠道微生态系统平衡，改善肠道菌群紊乱状态，减轻NAFLD患者的肠源性内毒素血症，并调节脂质代谢，从而对NAFLD起到治疗作用，为临床NAFLD治疗过程中微生态制剂的应用提供了更加广泛的选择。【参考文献】1HAN D W.Intestinal endotoxemia as a pathogenetic mechanism in liver failureJ.World J Gastroenterol,2002,8(6):961-9652BRUN P,CASTAGLIUOLO L,DI LEO V,et al.Increased intestinal permeability in obese mice new evidence in the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitisJ.Am J Physiol Gastrointest Liver 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