PBL表型测定.doc

TLR9 expressin of MSC induced by Thymosin alpha 1（0.1ug/ml） 600bp500bp400bp300bp200bp100bp TLR9268bp 1 2 3 4 5 6 7 Marker 600bp500bp400bp300bp200bp100bp-actin 421bp 1 2 3 4 5 6 7 Marker (1-5为Thymosin alpha 1不同诱导时间，依次为0、1、2、3、6h，6为空白对照，7为HL-60细胞阳性对照)INDO expressin of MSC induced by Thymosin alpha 1(18hr)600bp500bp400bp300bp200bp100bpINDO430bp 1 2 3 4 5 6 Marker (1-3为-actin，4-5为不同Thymosin alpha 1浓度，依次为1ug/ml、2ug/ml，6为-干扰素诱导MSC作阳性对照)TLR9 expressin of MSC induced by Thymosin alpha 1 1 2 3 4 5 6 7 Marker(1-5为Thymosin alpha 1不同诱导时间，依次为0、1、2、3、6h，6为空白对照，7为HL-60细胞阳性对照) 一、BM-MSCHOUActivation of PHA-stimulated PBL 表型：按MSC：PBL1：20的比例，将0.3ml 1105/ml的 MSC接种于24孔板内，加入0.2ml培养液，孵育过夜后，加入0.3 ml 2106/ml PBL和0.2ml培养液，0.5 ml 80g /ml PHA和0.5 ml培养液，37，5%CO2培养72hr后收集细胞，用PBS离心洗涤2次，FCM备用；设组及布板如下： MSCPBLPHADMEMPBLPHADMEMPBLDMEM 一、BM-MSCSAAActivation of PHA-stimulated PBL 表型：按MSC：PBL1：20的比例，将0.3ml 1105/ml的 MSC接种于24孔板内，加入0.2ml培养液，贴壁后（4-6hr）取出，倾除培养液，加入0.5ml 0.1ug/mlTa1，于37，5%CO2反应18hr后，加入0.5ml 2mmol/L的1-MT，37，5%CO2反应10min，加入0.3 ml 2106/ml PBL和0.2ml培养液，0.5 ml 80g /ml PHA和0.5 ml培养液，37，5%CO2培养72hr后收集细胞，用PBS离心洗涤2次，FCM备用；设组及布板如下：MSCPBLPHADMEM MSCTa1PBLPHAMSCTa1/1-MTPBLPHAPBLPHADMEMPBLDMEM三、Ta1诱导BM-MSCHOU TLR9和IDO表达：1、 0.1ug/ml Ta1诱导BM-MSCHOU0，1，2，3，6小时，收集细胞，提取RNA后，行RT-PCR，检测TLR9的表达。（取5瓶BM-MSCHOU，加入4 ml 培养液后，再加入4ug/ml Ta1 0.1ml，于37，5%CO2反应0，1，2，3，6小时，分别用0.25胰酶-EDTA消化液收集细胞，提取RNA后，行RT-PCR。另收集HL-60细胞，作为TLR9阳性表达细胞。） 2、 分别用5 ug/ml 、10 ug/ml Ta1诱导BM-MSCHOU 18小时，收集细胞，提取RNA后，行RT-PCR，检测IDO的表达。（取2瓶BM-MSCHOU，加入4 ml 培养液后，再分别加入40ug/ml Ta1 0.5ml、1ml ，于37，5%CO2反应18小时，分别用0.25胰酶-EDTA消化液收集细胞，提取RNA后，行RT-PCR。另收集1瓶-干扰素诱导MSC，作为IDO阳性表达细胞。）四、Ta1诱导BM-MSCSAA IDO表达： 分别用5 ug/ml 、10 ug/ml Ta1诱导BM-MSCHOU 18小时，收集细胞，提取RNA后，行RT-PCR，检测IDO的表达。（取2瓶BM-MSCHOU，分别加入3.5 ml 、3ml培养液后，再分别加入40ug/ml Ta1 0.5ml、1ml ，于37，5%CO2反应18小时，分别用0.25胰酶-EDTA消化液收集细胞，提取RNA后，行RT-PCR。另收集1瓶-干扰素诱导MSC，作为IDO阳