临床免疫学补体检测及应用.doc

第十九章补体检测及应用本章考点1.概述2.补体的活化途径3.有关补体测定的试验4.补体测定的应用补体是存在于人和脊椎动物正常新鲜血清及组织液中的一组具有酶样活性的球蛋白。补体系统是补体加上其调节因子和相关膜蛋白共同组成一个反应系统，称为补体系统。补体系统参与机体的抗感染及免疫调节，也可介导病理性反应，是体内重要的免疫系统和放大系统。第一节补体系统的组成和性质 一、命名根据l968年WH0命名委员会对补体系统进行了统一命名。参与补体激活经典途径的固有成分按其被发现的先后顺序分别称Cl、C2、C9。Cl由Clq、Clr、Cls三种亚单位组成；补体系统旁路激活途径及调节因子中另一些组分以英文大写字母表示，如B因子、D因子、P因子、H因子等；补体调节成分多以其功能进行命名，如C1抑制物、C4结合蛋白、衰变加速因子等；补体活化后的裂解片段以该成分的符号后面加小写英文字母表示，如C3a、C3b等；具有酶活性的成分或复合物在其符号上划一横线表示，如、，灭活的补体片段在其符号前面加英文字母i表示，如iC3b等；对补体受体以其结合对象命名，如CLrR、C5Ar、对C3片段受体则用CRl、CR2CR4表示。二、分类构成补体系统包括30余种活性成分，按其性质和功能可以分为三大类：1.在体液中参与补体活化级联反应的各种固有成分；2.以可溶性形式或膜结合形式存在的各种补体调节蛋白；3.结合补体片段或调节补体生物效应的各种受体。三、理化性质补体的大多数组分都是糖蛋白，且多属于球蛋白，约占血清球蛋白总量的l0%；Clq，C8等为球蛋白；Cls，C9为球蛋白。正常血清中各组分的含量相差较大，C3含量最多，C2最低。各种属动物间血中补体含量也不相同，豚鼠血清中含有丰富的补体，故实验室多采用豚鼠血作为补体来源。补体性质不稳定，易受各种理化因素影响，如加热、机械振荡、酸碱、酒精等均可使其失活；在010下活性只保持34天，冷冻干燥可较长时间保持其活性；加热5630min可使血清中绝大部分补体组分丧失活性，称为灭活或灭能。第二节补体系统的活化与调控 一、补体系统的活化补体系统的各组分在体液中通常以非活性状态、类似酶原的形式存在，当受到一定因素激活，才表现出生物活性。补体的激活途径主要有两种，即经典途径和替代途径，此外尚有MBL（甘露糖结合凝集素）途径。经典途径和替代途径两种途径的启动过程不一致，但经典途径的激活可以导致替代途径的活化，反之则不行。补体的其他激活途径即甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径，简称MBL途径。此途径开始于急性期蛋白与病原体的结合，而不是抗原复合物形成。1.经典途径：经典途径是以结合抗原后的IgG或IgM类抗体为主要激活剂，补体C1C9共11种成分全部参与的激活途径。除了抗原抗体复合物外，还有许多因子可激活此途径，如非特异性凝集的Ig、细菌脂多糖、一些RNA肿瘤病毒、双链DNA、胰蛋白酶、纤溶酶、尿酸盐结晶、C-反应蛋白等。经典活化途径可人为地分成识别、活化和膜攻击3个阶段。2.替代途径：替代途径又称旁路途径。它与经典途径的不同之处主要是越过C1、C4和C2，直接激活补体C3，然后完成C5C9的激活过程；参与此途径的血清成分尚有B、D、P、H、I等因子。替代途径的激活物主要是细胞壁成分，如内毒素、某些蛋白水解酶、IgG4、IgA聚合物等。替代途径是通过研究C4缺陷而仍保持补体系统活化的患者而发现的。二、补体活化的调控补体系统被激活后，进行系统有序的级联反应，从而发挥广泛的生物学效应，参与机体的防御功能。如果补体系统活化失控，可形成过多的膜攻击复合物而产生自身损伤，或过多的炎症介质造成病理效应。正常机体的补体活化处于严密的调控之下，从而维持机体的自身稳定。1.补体的自身调控：补体激活过程中生成的某些中间产物非常不稳定，成为补体级联反应的重要自限因素。此外只有细胞表面形成的抗原抗体复合物才能触发经典途径，而旁路途径的C3转化酶则仅在特定的物质表面才具有稳定性，故正常机体内一般不会发生过强的自发性补体激活反应，补体系统自身调控的作用在于维持机体自身的稳定性；2.调节因子的作用：体内存在多种可溶性膜结合的补体调节因子，它们以特定方式与不同的补体成分相互作用，使补体的激活与抑制处于精细的平衡状态，调节蛋白的缺失有时是造成某些疾病发生的原因。目前发现的补体调节蛋白有十余种，按其作用特点可分为三类：l）防止或限制补体在液相中自发激活的抑制剂；2）抑制或增强补体对底物正常作用的调节剂；3）保护机体组织、细胞免遭补体破坏作用的抑制剂。第三节补体系统的生物活性 补体是机体重要的免疫效应系统之一。补体系统活化可以溶解细胞，在活化过程中产生的中间复合物及某些片段也具有多种多样的生物活性，所以补体系统对机体的作用是多方面的，既可参与机体的防御效应和自身稳定，亦可引起免疫损伤。1.溶细胞作用：不论何种途径活化，补体系统都能对其粘附的细胞产生溶解作用。补体的溶细胞反应不仅可以抗菌，也可抵抗其他微生物及寄生虫的感染。另一方面，补体也常常引起病理性反应，如异型输血时的溶血反应、自身免疫病时细胞损伤等；2.免疫复合物的清除：补体在活化过程中生成的中间产物，对抗原抗体复合物有很强的亲和力，可共价结合到免疫复合物上，然后通过补体的其他效应对免疫复合物产生抑制或清除作用。常通过以下几种方式对免疫复合物的清除：1）吞噬调理作用；2）免疫粘附作用；3）免疫复合物抑制作用；3.炎症介质作用：补体是机体重要的炎症介质之一，可通过过敏毒素作用、趋化作用、激肽样作用等多种途径引起炎症；4.中和与溶解病毒作用：其机理可能是阻止病毒对易感细胞的吸附和穿入，并可能干扰病毒在细胞中的增殖。第四节补体的合成与代谢 1.补体编码基因：补体成分十分复杂，各编码基因分散在不同的染色体上，补体成分的许多蛋白质分子具有同分异构现象，显示其遗传多态性。几乎所有补体蛋白均为单位点常染色体等显性遗传。编码人C4、C2、B因子的基因在第6对染色体短臂上，与MHC的基因相邻，命名为类组织相容性基因；与C3、C4反应的许多调节蛋白的基因被组合在一起，在第一对染色体上形成一个超基因家族，此家族编码的蛋白有：H因子、C4bp、DRF、CRI、CR2等。2.补体合成的器官及细胞：尽管一些器官和组织产生不同补体成分，但产生补体的主要器官是肝脏，主要细胞是巨噬细胞。3.补体的代谢平衡：补体成分在血液中可被蛋白酶直接降解，病理情况下补体的代谢速率反映了补体的激活程度，补体活化后的酶解片段迅速失活，并很快从循环中消除，沉着于细胞表面及组织中被消耗或分解。如C3在C3转化酶作用下，生成C3a和C3b，C3降解为iC3b，再降解为C3c、C3dg。最后降解为C3d和C3g。第五节补体总活性测定 （一）实验原理补体最主要的活性是溶细胞作用。特异性抗体与红细胞结合后可激活补体，导致红细胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分渗入，引起红细胞肿胀而发生溶血。补体溶血程度与补体的活性相关，但非直线关系。在一个适当的、稳定的反应系统中，溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线。如以溶血百分率为纵坐标，相应血清量为横坐标，可见在轻微溶血和接近完全溶血处，对补体量的变化不敏感。S形曲线在30%70%之间最陡，几乎呈直线，补体量的少许变动，也会造成溶血程度的较大改变，即曲线此阶段对补体量的变化非常敏感。因此，实验常以50%溶血作为终点指标，它比l00%溶血更为敏感，这一方法称为补体50%溶血实验即CH50。（二）检测试剂绵羊红细胞；溶血素；稀释缓冲液。（三）方法评价CH50试验是测定经典途径总补体溶血活性，所反映的是补体9种成分的综合水平。方法简便、快速，但敏感性较低。补体的溶血活性除与试验中反应体积成反比外，还与反应所用缓冲液的pH、离子强度、钙镁浓度、绵羊红细胞数量和反应温度有一定关系。缓冲液pH和离子强度增高，补体活性下降，虽可稳定溶血系统，但过量则反而抑制溶血反应，故实验时对反应的各个环节应严加控制，统一步骤。（四）临床意义CH50法检测是补体经典途径的溶血活性，所反映的主要是补体9种成分的综合水平。如果测定值过低或者完全无活性，首先考虑补体缺陷，可分别检测C4、C2、C3和C5等成分的含量；严重肝病时血浆蛋白合成能力受损。营养不良时蛋白合成原料不足，也可以不同程度地引起血清补体水平下降。在患系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎等自身免疫病时，血清补体水平随病情发生变化。疾病活动期补体活化过度，血清补体水平下降；病情稳定后补体水平又反应性增高。因此补体检测常可作为自身免疫病诊断或是否有疾病活动的参考指标。细菌感染特别是革兰阴性细菌感染时，常因补体旁路途径的活化过度引起血清补体水平降低。心肌梗死、甲状腺炎、大叶性肺炎、糖尿病、妊娠等情况下血清补体水平常升高。 第六节补体结合试验补体结合试验是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年Wasseramann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。1.补体结合试验原理、类型：补体结合试验中有5种成分参与反应，分属3个系统：1）反应系统；2）补体系统；3）指示系统。其中反应系统（抗原与抗体）与指示系统（绵羊红细胞与溶血素）争夺补体系统。如先加入反应系统和补体，给其以优先结合补体的机会，如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原、抗体发生反应后可结合补体，再加入指示系统（SRBL与相应溶血素），由于反应中无游离的补体而不出现溶血，为补体结合试验阳性。如待测系统中不存在待检的抗体或（抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示剂时会出现溶血，为补体结合试验阴性。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。2.补体结合试验的临床应用：补体结合试验可应用在以下几个方面：1）传染病诊断，病原性抗原及相应抗体的检测；2）其他抗原的检测，如肿瘤相关抗原、血液中的蛋白质鉴定，HLA分型等；3）自身抗体的检测等。补体结合试验的优点为灵敏度高、特异性强、应用面广、易于普及。缺点为试验参与反应的成分多，影响因素复杂，操作步骤繁琐并且要求十分严格，容易出现错误。第七节单个补体成分测定在30多种补体成分中，主要检测C3、C4、Clq、B因子和Cl酯镁抑制物。测定方法分为免疫溶血法及免疫化学法。1.免疫溶血法溶血法主要根据抗原与其特异性抗体（IgG、IgM型）结合后可激活补体的经典途径，导致细胞溶解。该方法中抗原为SRBC，抗体为兔或马抗SRBC的抗体，即溶血素。将两者组合作为指示系统参与反应。试验中有两组补体参与，一组是作为实验反应系统的补体，此类试剂可选用先天缺乏某单一补体成分的动物或人血清，如某些人可天然缺乏C2、豚鼠缺C5、家兔缺C6；也可利用化学试剂人为灭活正常血清中某种成分制备缺乏该成分的补体试剂，加入致敏SRBC（检测经典途径补体成分用）或总红细胞RRBC（检测替代途径补体成分用）指示系统后，此时由于补体级联反应体系中缺乏某种补体成分，不能使补体连续激活，不发生溶血。另一组为待测血清中的补体，当加入待测血清，使原来缺乏的成分得到补充，补体成分齐全，级联反应恢复，产生溶血。溶血程度与待测补体成分活性有关，仍以50%溶血为终点。免疫溶血法无须特异仪器与设备，快速，但敏感性较低，影响因素多。该法不是检测某补体成分的具体含量，而是检测其活性，在某些需了解该成分活性情况下，本试验适用。2.免疫化学法免疫化学法分为单向免疫扩散法、火箭免疫电泳、透射比浊法和散射比浊法。前两种方法已逐渐趋于淘汰，后两种方法通过仪器对补体的C3、C4、B因子等单个成分进行测定。待测血清标本的C3、C4成分适当稀释后与检测用相应抗体结合形成复合物，反应介质中的PEG可使该复合物沉淀，仪器对复合物产生的光散射或透射信号进行自动检测，并换算成所测成分的浓度单位。自动免疫化学法检测补体成分方法简单、特异、重复性好，可反映所测补体成分的绝对值，并能进行标准化流程管理和质控，是当前主要检测方法。第八节补体测定的应用检测补体的单个成分及补体的活性对于机体免疫系统的功能评价，疾病的诊断与治疗，流行病学调查等均有重要作用。同时根据补体具有的溶细胞活性和联级反应的性质，可利用补体作为一种试剂，参与很多实验反应，补体检测技术可应用于下述情况。1.诊断病原体感染，如华氏反应（已淘汰）诊断梅毒螺旋体感染。2.检测补体的功能，如CH50和AH50试验。3.补体单个成分及其裂解产物的测定，如Clq、C3、CA、C3a和补体受体的测定等。4.相关疾病时补体的检测（1）免疫性疾病：如自身免疫病时Cl、C2、C3、C4和HF等缺陷；变态反应如型超敏反应为免疫复合物型，其中C3a、C5a等过敏毒素， 等趋化因子的作用导致组织损伤。（2）与补体有关的遗传性疾病：如C3缺陷导致严重感染；Cl抑制物缺陷与遗传性血管性水肿；细胞表面CRl缺陷与CIC清除障碍（SLE）；If、Hf缺陷与肾小球肾炎；DAF缺陷与阵发性夜间血红蛋白尿等。（3）补体含量显著降低的疾病：如1）消耗增多见于SLE、自身免疫性溶血性贫血、类风湿性关节炎、移植排斥反应；2）细菌感染，特别是革兰阴性菌感染时；3）大量丧失见于大面积烧伤、大出血和肾病综合征等；4）合成不足则见于急慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌患者和营养不良等。（4）高补体血症：少见。主要见于感染恢复期和某些恶性肿瘤患者，常为C4、C2、C3和C9的升高。5.补体参与的试验：即利用补体作为试剂而设计的实验，例如HLA分型的补体依赖性细胞毒试验（CDCC）。这类试验还有脂质体免疫试验、免疫粘连血凝试验、溶血空斑技术、胶固素结合试验、Clq结合试验和补体结合试验等。6.流行病学调查：如补体结合试验用于流行病学调查；CDCC用于人群HLA分布频率的调查等。7.补体应用于临床治疗后的检测。习题86 关于补体旁路激活途径的叙述，错误的是A.激活物是细菌壁成分B.从C3激活开始C.发挥效应比经典途径晚D.有激活效应的扩大E.在感染后期发挥作用答疑编号500734190201正确答案E答案解析在感染前期就发挥作用。习题87 实验室灭活补体最常用的方法是A.56，30minB.65，30minC.95，10minD.紫外线照射E.添加强酸或强碱答疑编号500734190202正确答案A习题88 关于补体的叙述，正确的是A.对热稳定B.含量与抗原刺激无关C.由多种细胞产生D.是存在正常血清的一组球蛋白E.两条激活途径有相同的末端效应答疑编号500734190203正确答案B、C、D、E习题89 具有趋化作用的补体裂解物有A.C2aB.C3aC.C4aD.C5aE.C3b答疑编号500734190204正确答案B、D、E习题90 补体的生物学作用包括A.调理作用B.免疫粘附作用C.免疫调节作用D.炎症介质作用E.溶细胞作用答疑编号500734190205正确答案A、B、C、D、E习题91 补体结合试验前的抗原抗体方阵滴定的目的是A.选择抗原抗体最佳比例B.使抗原抗体复合物形成最少C.使抗原抗体复合物结合补体的量最少D.使抗原抗体复合物结合补体的量最多E.避免抗原抗体复合物太多答疑编号500734190206正确答案A答案解析此题超出教材内容。补体结合试验分试剂滴定和正式试验两部分。前者又往往直接影响试验的成败。补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而，应通过预试验选择两者适当比例。目前主要采取方阵法进行滴定，以选择抗原抗体最佳比例。习题92 补体结合试验中，补体最主要的特性是A.与抗原结合B.与抗体结合C.与抗原抗体复合物结合D.溶解红细胞E.溶解抗原抗体复合物结合答疑编号500734190207正确答案D第二十章自身抗体检测及应用本章考点1.概念2.自身抗体的特性、概念3.常见自身抗体的检测4.自身抗体检测的临床应用自身免疫：当机体免疫系统受某种因素作用使自身免疫耐受削弱或破坏时，免疫系统会对自身成分包括：正常或变性的组织、器官、细胞、蛋白质或酶类等自身抗原产生免疫应答反应，出现自身抗体或致敏淋巴细胞的这种现象称为自身免疫。自身免疫性疾病：当某种原因使自身免疫应答过分强烈时，也会导致相应的自身组织、器官损伤或功能障碍，这种病理状态称为自身免疫性疾病。自身抗体；血循环中针对自身组织、器官、细胞及细胞内成分的抗体称为自身抗体。正常人血清中可有多种微量的自身抗体或致敏淋巴细胞，它能清除体内衰老细胞而起到免疫稳定的效应。第一节自身抗体的特性自身抗体是自身免疫性疾病的重要标志。每种自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗体谱。患者血液中存在高效价自身抗体是自身免疫性疾病的特点之一，也是临床确诊自身免疫性疾病的重要依据。产生自身抗体的抗原包括以下几种：化学修饰的组织抗原；与自身组织成分存在交叉反应的外来抗原；隐蔽抗原；自身细胞HLA-DR抗原的表达以及低分化的组织抗原等，在一定条件下，均可刺激机体产生自身抗体。自身抗体与疾病的关系：某些自身抗体对某种疾病的诊断具有高度特异性，已经成为该病的血清标记性抗体或特异性抗体；某些自身抗体与疾病的活动性有相关性；少数自身抗体参与了免疫病理性损伤。测定自身抗体的意义：自身免疫性疾病的诊断；疾病活动性的判断；疗效的观察；指导临床用药等。第二节常见自身抗体的检测自身抗体种类很多，这里只是简单介绍几种常见的自身抗体的检测。一、类风湿因子（一）概念类风湿因子（rheumatoid factor，RF）是一种抗人或动物IgG分子Fc片段抗原决定簇的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。可与人或动物的变性IgG结合，而不与正常IgG发生凝集，最多见于类风湿性关节炎患者。Rose等1984年在RA（rheumatoid arthritis）患者血清中发现RF。RF有IgM、IgG、IgA和IgE型，IgM型为主要类型。（二）检测方法1.胶乳凝集试验：以IgG吸附于聚苯乙烯胶乳颗粒上，如血清中含有RF，可与乳胶颗粒出现凝集反应。该法只能定性或半定量，灵敏度及特异性不高，只能检测IgM型RF。2.速率散射比浊法：定量检测、准确、快速，准确性和敏感性高于胶乳凝集实验。也只能检测IgM型RF。3.ELISA法：可检出不同Ig类型的RF，在酶标记抗体时，分别标记IgG、IgA或IgM。（三）临床应用RF主要见于类风湿，在类风湿性关节炎患者中的检出率很高，RF阳性支持早期RA的倾向性诊断，对年轻女性应进行RA和风湿热的鉴别；而对非活动期RA的诊断，需参考病史。但RF也像ANA一样，并不是RA独有的特异性抗体。在SLE患者约有50%RF阳性，在其他结缔组织病如SS、硬皮病、慢性活动性肝炎以及老年人中均可有不同程度的阳性率。部分正常人也可出现。但RF滴度或含量一般较低（80IUml伴严重关节功能障碍者，提示预后不良。IgG型RF：与患者滑膜炎、血管炎和关节的症状密切相关。正常人以及非RA患者中很难检出。IgA型RF：10%RA可检出，为RA临床活动的指标，与骨质破坏以及关节炎症状的严重程度显著相关。IgE型RF：在关节液、胸水中高于血清水平。二、抗核抗体抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）是以自身真核细胞成分作为靶抗原的一组自身抗体的总称，泛指各种核成分的抗体，是一种广泛存在的自身抗体。迄今已发现20余种。性质主要是IgG，也有IgM、IgA、IgD和IgE，可与不同来源的细胞核起反应，无器官特异性和种属特异性。ANA主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液以及尿液等体液中。ANA可见于多种疾病，主要存在于自身免疫性疾病患者血清中，如SLE、SS、MCTD、类风湿性关节炎等。也可见于慢性肝病、病毒感染以及正常老年人、妊娠妇女等。ANA阴性不能排除自身免疫性疾病的诊断；阳性也不一定是自身免疫性疾病。由于细胞核成分的复杂性，不同成分的抗原性也不同；因此就会有多种不同类型的ANA。ANA在不同的疾病中呈现不同的组合，不同的疾病有自己的抗核抗体谱。有些ANA只是针对某一特定成分，只在某一疾病中出现，成为该病的血清标志性抗体。ANA是一个重要的筛选试验。分类：按理化特性和抗原分布部位分为四大类。包括抗DNA抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体、抗核仁抗体。命名：1.根据抗原化学名称命名：例如抗dsDNA、抗RNP。2.以第一位检出患者命名：例如抗Sm、抗Ro、抗La抗体。3.以相关疾病命名：例如抗SSA、抗SSB抗体。（一）检测方法由于ANA的复杂性及多样性，故测定方法繁多。目前ANA常用的方法有免疫荧光法、放射免疫法、ELISA、免疫双扩散、对流免疫电泳及免疫印迹技术等。常用间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IIF）作为总的ANA筛选试验。鼠肝常用于检测抗核抗体，但近十年来多被HEp-2细胞所代替，这是因为HEp-2细胞具有以下特点：人源性；细胞核大；分裂期细胞多；可大批量培养。当然，单个细胞不可能替代组织切片，所以鼠组织切片仍继续用于自身抗体的检测。放射免疫法：常用于检测抗DNA抗体，有Farr法及过滤法。Farr法的原理为用同位素标记DNA，被标记的DNA和被检血清的抗DNA抗体结合，经50%硫酸铵饱和液沉淀，然后比较沉淀物和上清液中的放射活性，从而得出DNA结合活性，一般结合率大于20%为阳性。过滤法是在分离结合物时用纤维素酯薄膜滤器（孔径为0.45m）进行过滤，游离的DNA被滤去而与抗体结合的复合物被阻留在滤膜上。ELISA法：临床上主要是应用间接ELISA检测抗dsDNA抗体，其重复性及敏感性均较对流免疫电泳及双扩散为高。目前已有试剂盒供应。免疫印迹（immunoblotting）法：先将混合抗原作凝胶电泳，分离开不同的区带，然后将这些带转印到硝酸纤维素膜上，最后用酶标抗体或放射性同位素标记抗体进行检测和分析。由于该试验不需纯化的单个抗原，可在同一固相上作多项分析检测，灵敏度高，特异性强。故目前已广泛用于自身免疫病患者血清中多种自身抗体的检测，如检测抗Sm抗体、抗RNP抗体、抗SS-A抗体及SS-B抗体等。另外，还可用传统的琼脂双向扩散法、对流免疫电泳法、间接血凝法和补体结合试验等。这些试验要求的实验条件比较低，但敏感性也比较低。均质型斑点型核仁型核膜型（二）常见ANA荧光图形及临床意义1.均质型：多是由抗DNP抗体所引起。也可由核小体抗体和抗双链DNA抗体引起。主要见于SLE，药物性狼疮。2.斑点型：是由抗ENA抗体所引起。主要见于SLE、MCTD、PSS、SS等。高滴度的斑点型常见于MCTD。3.周边型（又称核膜型）：主要由抗dsDNA的抗体所引起。主要见于SLE。特别是活动期患者。4.核仁型：主要见于硬皮病。相关抗体是抗核仁特异的低分子量RNA等。5.着丝点型：主要见于局限性硬皮病及CREST综合征。主要的靶抗原是着丝点B抗原。（三）抗双链DNA抗体的检测方法检测抗DNA抗体的方法有多种，如ELISA、IIF、金标法、免疫印记法、放免法等。其中最特异敏感的是应用锥虫或血鞭毛虫（如绿蝇短膜虫）作基质测定抗dsDNA抗体。因为这些血寄生虫的动基体内含大量的纯dsNDA，无其他抗原干扰；在阳性结果时，可见鞭毛一端的动基体显示清晰的荧光。因此该试验用于测定抗dsDNA抗体具有特异性强和敏感性高的优点。另外，短膜虫对人畜无害，可以人工养殖，来源方便，值得推广。抗dsDNA抗体是SLE的特征性标记抗体，是SLE活动期的重要指标。抗体滴度的动态检测对疗效的监测提供了有价值的实验室手段。抗dsDNA抗体对诊断SLE特异性较高；可达95%以上，但敏感性较低，仅为30%50%，因此，抗dsDNA抗体阴性不能排除SLE的诊断。抗dsDNA抗体在SLE的发病机制中起到重要作用。如狼疮肾炎；血管炎；皮肤的蝶形红斑等均与该抗体有关。三、抗ENA抗体谱（一）概述ENA（extractable nuclear antigens）是可提取性核抗原的总称。ENA是细胞内许多小分子的RNA和多肽组成的非组蛋白的酸性核蛋白颗粒。ENA主要包括Sm、RNP、SSA、SSB、Jo-1、Scb-70等抗原。不同的自身免疫病可以产生不同的抗ENA抗体。ENA抗体的检测对自身免疫性疾病的诊断和鉴别诊断具有重要意义。（二）检测方法检测方法有多种，如免疫印迹法（immunoblotting，IBT）、ELISA、对流免疫电泳、双扩散、金标法等。这里主要介绍免疫印迹技术。免疫印迹技术属于膜载体酶免疫技术，其固相载体为吸附有抗原的硝酸纤维膜。其基本原理为从小牛或兔胸腺提取ENA，经过SDS-PAGE电泳分成区带，然后转印至硝酸纤维膜上，将待检血清（含抗ENA抗体）加在硝酸纤维膜上，抗ENA抗体与ENA抗原结合，形成Ag-Ab复合物，加入酶标抗人IgG，形成Ag-Ab-酶标Ab复合物，然后加入底物显色。与标准条带对比判读，可以确定不同的抗ENA抗体。免疫印迹技术不需纯化抗原，灵敏度高，特异性强，操作简便，是广泛采用的检测抗ENA抗体的技术。图1 ENA自身抗体谱标准对照带（三）抗ENA抗体的临床意义1.抗Sm抗体：是SLE的血清标志抗体，阳性率30%40%。阴性不能排除SLE的诊断。抗Sm抗体水平与SLE活动性没有相关性，也不与临床表现相关，治疗后的SLE患者也可呈现抗Sm抗体阳性。抗Sm抗体的检测对早期或不典型的SLE以及治疗后的SLE的回顾性诊断具有帮助。2.抗核RNP抗体：高滴度的抗核RNP（nRNP）抗体是MCTD诊断的重要依据。因其抗原为含有U1RNA的核蛋白复合物，故称U1RNP。MCTD阳性率可高达95%。也可见于其他自身免疫性疾病。因为Sm与RNP为同一分子复合物（RNA-蛋白质颗粒）中的不同抗原位点，因此两种抗原具有相关性，常伴随出现，单一的抗Sm抗体阳性者较少见。3.抗SSARo抗SSBLa：是干燥综合征（SS）最常见的自身抗体，抗SSB特异性较SSA高。两者同时检测可提高SS的诊断率，抗SSA抗体也可见于SLE和其他自身免疫病，亚急性红斑狼疮患者、补体缺陷的SLE患者、新生儿狼疮患者可以出现抗SSA抗体。IgG类抗SSA抗体通过胎盘进入胎儿后，可引起新生儿狼疮综合征，出现典型的SLE皮损。抗SSA抗体与胎儿的心脏传导系统结合，可以造成先天性心脏传导阻滞。4.抗Jo-1抗体：最常见于多发性肌炎（polymyositis，PM）。在其他AID一般为阴性。PM与硬皮病重叠者阳性率较高。5.抗Scl-70抗体：几乎仅见于进行性系统性硬化病（progressive systemic sclerosis，PSS），阳性率40%60%，其他AID少见，是PSS的标志性抗体。正常人为阴性。四、抗中性粒细胞胞浆抗体（一）概念抗中性粒细胞胞浆抗体（antineutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）是一组以人中性粒细胞胞浆成分为靶抗原，与临床多种小血管炎性疾病密切相关的自身抗体，是系统性血管炎的血清标志抗体，对血管炎的诊断、分类及预后具有重要意义。ANCA主要有两型：胞浆型（cANCA）和核周型（pANCA）。cANCA针对的靶抗原是蛋白酶3（PR3），pANCA针对的靶抗原主要是髓过氧化物酶（MPO），其他还有乳铁蛋白等。PR3和抗MP0抗体在参与小血管炎的发病中起重要作用。（二）ANCA的检测方法ANCA的检测一般应用IIF和ELISA。IIF检测采用酒精或甲醇固定的中性粒细胞涂片作为抗原。在荧光显微镜下，胞浆型（cANCA）和核周型（pANCA）分别显示特定的荧光染色模型。ELISA法采用纯化的PR3和MP0包被固相反应板，分别检测两种抗体。（三）ANCA的临床应用ANCA是原发性小血管炎的特异性血清标志物。cANCA产生弥漫性细胞浆染色，是针对PR3的抗体，常见于Wegener肉芽肿病（WG），特别是肾和肺受累的病人。pANCA产生核周染色，是针对MP0的抗体，主要见于系统性血管炎病人。ANCA检测是原发性小血管炎患者的诊断、疗效观察、判断病情活动和复发的一项重要指标。WG患者活动期抗体滴度升高；缓解期下降。ANCA阳性还可见于继发性血管炎、炎性溃疡、RA、SLE、自身免疫性肝病等。五、抗心磷脂抗体（一）概念抗心磷脂抗体（anti-cardiolipin antibody，ACLA）是抗磷脂抗体之一，是最有代表性的一种。所针对的抗原是血浆中的磷脂结合蛋白。ACLA与自身免疫病和抗磷脂抗体综合征有密切关系。ACLA可以分为IgG型、IgA型和IgM型。（二）检测方法常用方法为ELISA。可以进行分型。（三）临床应用ACL抗体阳性常见于SLE、RA、急性脑血管病、反复自然流产、血栓形成、抗磷脂抗体综合征等。六、抗平滑肌抗体抗平滑肌抗体（anti-smooth muscle antibody，ASMA）是抗肌动球蛋白的自身抗体。一般采用IFA法，以大鼠胃作为抗原基质，阳