生物化学课程论文.doc

1 引言 我国自20世纪70年代末即开始了基因工程研究工作，经过20多年的研究开发，我国的基因工程发展在医学、农业各个领域取得了令人瞩目的成果，正向产业化迈进。目前，基因工程技术已经突破了经典的研究方法和研究内容，能直接从生物细胞中分离出所需的基因（特定的DNA片段），并使其增殖以得到大量同质基因。它运用克隆得到的大量DNA片段，测定基因在染色体上的位置，分析基因的结构与功能，并进而能用人工方法来合成基因、改造基因。基因工程技术形成了一个内容广泛而暂新的新领域。自然界创造的新的生物物种一般需要几十万乃至几百万年，但是在实验室用基因工完成程技术可能在几天之内完成这个过程。基因工程使人类从单纯地认识生物和利用生物的传统模式跳跃到随心所欲地改造生物和创造新生物的新时代，为生物学、医药学、遗传学、农业科学、环境科学和某些工业研究开拓了广阔的、革命性的发展前景。1.1 基因工程的概况 1.1.1 概述 基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程或重组体DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和行使正常功能（称之为“表达”），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。一般来说，基因工程是专指用生物化学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统的DNA结合成一个复制子。这样形成的杂合分子可以在复制子所在的宿主生物或细胞中复制，继而通过转化或转染宿主细胞，使之生长和筛选转化子，并进行无性繁殖，使之成为克隆。然后直接利用转化子，或者将克隆的分子自转化子分离后再导入适当的表达体系，使重组基因在细胞内表达，产生特定的基因产物。 基因工程中内外源DNA插入载体分子所形成的杂合分子又称为嵌合DNA或DNA嵌合体。构建这类重组体分子的过程，即对重组体分子的无性繁殖过程又称为分子克隆、基因克隆或重组DNA、 1.1.2 基因工程发展史 基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。一般来说，基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质-DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中安家落户，进行正常复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。 这个定义表明，基因工程具有以下几个重要特征：首先，外源核酸分子在不同的寄主生物中进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中，而这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系，这种能力是基因工程的第一个重要特征。第二个特征是，一种确定的DNA小片段在新的寄主细胞中进行扩增，这样实现很少量DNA样品拷贝出大量的DNA，而且是大量没有污染任何其它DNA序列的、绝对纯净的DNA分子群体。科学家将改变人类生殖细胞DNA的技术称为“基因系治疗”（germlinetherapy），通常所说的“基因工程”则是针对改变动植物生殖细胞的。无论称谓如何，改变个体生殖细胞的DNA都将可能使其后代发生同样的改变。1989年，我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物重组人干扰素lb，标志着我国生产的基因工程药物实现了零的突破。重组人干扰素lb是世界上第一个采用中国人基因克隆和表达的基因工程药物，也是到目前为止唯一的一个我国自主研制成功的拥有自主知识产权的基因工程一类新药。从此以后，我国基因工程制药产业从无到有，不断发展壮大。1998年，我国基因工程制药产业销售额已达到了7.2亿元人民币。截止1998年底，我国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品共计15种。目前，国内已有30余家生物制药企业取得了基因工程药物或疫苗试生产或正式生产批准文号。根据1997年对全国452从个事生物技术研究、开发和生产的单位进行的通讯调查结果，截止1996年底，我国已有8种基因工程药物和疫苗商品化（包括试生产），1996年基因工程药物和疫苗销售额约为2.2亿元人民币，仅占同期全国医药生物技术产品年销售额21.16亿元人民的10.4%。然而可喜的是，近年来我国基因工程制药产业发展迅猛，年销售额已从1996年的2.2亿元人民币增长到1998年的7.2亿元人民币，年均增长率高达80%。预计2000年我国基因工程药物销售额将达到22.8亿元人民币。基因工程在制药业中具有广阔的发展前景,我国的基因制药行业已经初具规模,但与世界发达国家存在差距,主要表现在具有自主知识产权的产品较少,产业规模小、经济效益低。目前,基因制药产业面临着历史性的机遇,主要表现在政府支持、资源丰富、基因信息公开、国际交流增加等方面。提高自主开发能力、保护基因资源是当前亟待解决的问题,同时,应加强对基因制药领域技术壁垒的研究与准备。1.1.3 基因工程的国内外对比 我国生物技术产业，特别是生物制药产业规模与美国相比差距很大。1996年，我国生物技术销售额为114亿元人民币，美国为100亿美元，相差7倍。1996年，我国基因工程和疫苗销售额为2.3亿元人民币，同期美国75亿美元。1998年，我国基因工程药物和疫苗销售额为7.2亿元人民币，还不到1亿美元，而1996年美国Amgen公司的两个主要产品Neupgen（G-CSF）和Epogen（红细胞生成素）销售额均达到10亿美元。从上市品种看，1998年，我国有15种基因工程药物和疫苗获准上市，美国上市的生物药物（主要是基因工程药物）共53种。我国基国工程药物市时间较美国同品种上市时间晚5年-10年。1.1.4 基因工程的原理 基因工程技术所应用的原理就是用生物体当中所提取的酶，来在一种动植物，甚至是原生动物，或者原核动物的DNA分子当中剪切下一段我们想要的，用的基因，然后再把它转嫁到另一种生物体当中去。例如：现在的医用疫苗的培养，人工用酵母菌去合成胰岛素，和转基因动植物的出现。这些无不使我们的生活变得更加舒适，并且在工农业，医学上都起到了举足轻重的作用。我们把北海鱼的抗寒耐冻基因转嫁到小麦当中，我们就可以得到抗寒耐冻的新型小麦，这与传统的生物杂交育种相比更加精准地选择了生物的基因以及其表现性状。与此同时，还极大地缩减了研究的时间。用基因工程技术去制造疫苗，合成人体所需要的激素，给很多的病患者带来了福音。并且现在的实验表明：用2000L细菌培养液，通过基因工程技术，就能够提取出100g胰岛素。这相当于1t猪胰脏当中所提取的胰岛素产量，除此之外，前者比后者要便宜近50%。1.1.5 基因工程的基本过程 基因工程的基本内容是有目的地遗传物质功能单位进行综合，创造有价值的生物分子或新的生物、植物或微生物品系。基因工程和其他工程一样，是有设计、有蓝图、有预期目的而进行的一种创造性工作。基因工程是在实验室条件下，进行肉眼看不见的分子水平上的操作，实验所采用的核酸试剂一般是以微克、纳克来进行计算和计量的。 基因工程的基本步骤和过程主要包括： （1）目的基因制取 从生物体的基因组或cDNA文库中分离（克隆）目的基因的DNA片段，或者根据已知目的蛋白质的基因序列人工合成目的基因的DNA片段； （2）基因载体的选择和构建 构建能够将目的基因运载进入受体细胞克隆或表达的工具基因片段，如质粒、噬菌体、病毒等； （3）目的基因与载体DNA的拼接 将目的基因连接到具有自我复制并有选择标记的载体上，形成重组DNA分子； （4）重组体分子导入受体细胞 通过转化、转染、转导或其他基因转移技术，使重组体DNA分子进入受体细胞，通过筛选和无性繁殖（克隆），选择具有重组体DNA分子的细胞克隆（阳性细胞克隆）； （5）外源基因的表达和产物的分离纯化 将阳性细胞克隆的目的基因在细胞内进行高效表达，并且进行表达产物的分离纯化。1.1.6 基因工程的流程 基因工程实验设计可以是多种多样的，具体的操作方法也可以灵活变动，各不相同，但其基本过程大体是一样的。我们可以把基因工程的工艺流程概括成图一所示的模式图。 在图一中，我们把载体的构建部分放在流程图上部的中间，构建好的载体在基因工程上游技术的好多关键的步骤都用得到，图中也简述了基因工程在各领域的应用以及益处。通过这一个流程图，我们可以大致了解一些关于基因工程的知识，还有，下游技术中很多步骤都要进行检测和筛选，有的是进行对目的基因的检测筛选，有的是进行对受体细胞中有无目的蛋白质的检测和筛选。基因工程的上游工程主要是目的基因的制取和无性繁殖。 图一 基因工程的简易流程图1.2 基因工程的应用1.2.1 生产领域 在生产领域,人们可以利用基因技术,生产转基因食品.例如,科学家可以把某种肉猪体内控制肉的生长的基因植入鸡体内,从而让鸡也获得快速增肥的能力.但是,转基因因为有高科技含量, 怕吃了转基因食品中的外源基因后会改变人的遗传性状，比如吃了转基因猪肉会变得好动，喝了转基因牛奶后易患恋乳症等等。华中农业大学的张启发院士认为：“转基因技术为作物改良提供了新手段，同时也带来了潜在的风险。基因技术本身能够进行精确的分析和评估，从而有效地规避风险。对转基因技术的风险评估应以传统技术为参照。科学规范的管理可为转基因技术的利用提供安全保障。生命科学基础知识的科普和公众教育十分重要。1.2.2 军事领域 生物武器已经使用了很长的时间.细菌,毒气都令人为之色变.但是,现在传说中的基因武器却更加令人胆寒.基因武器只对具有某种基因的人(例如某一种族)有杀伤力,而对其他种族的人毫无影响.这种武器的使用无疑会使遭受基因武器袭击的种族面临灭顶之灾。1.2.3 环保领域以往由于治理技术落后，环境意识低下等原因，相当一部分废物未经任何治理而直接排入环境，造成环境污染。现在，通过基因工程技术可以经回收、再循环、再生产方式转化成再生资源或二次能源，从而加以利用，这是防止环境污染、资源再利用的最有效措施。另外我们可以针对一些破坏生态平衡的动植物,研制出专门的基因药物,既能高效的杀死它们,又不会对其他生物造成影响.还能节省成本.例如一直危害我国淡水区域的水葫芦,如果有一种基因产品能够高校杀灭的话,那每年就可以节省几十亿了。 人们期望能够利用基因工程的手段将所希望的遗传基因植入易培养的微生物（如大肠杆菌）体内，使之得以表达复制，另克隆菌起到原菌净化环境的特殊功能，从而达到人们设想的目的。1.2.4 医疗领域 随着人类对基因研究的不断深入，发现许多疾病是由于基因结构与功能发生改变所引起的。科学家将不仅能发现有缺陷的基因，而且还能掌握如何进行对基因诊断、修复、治疗和预防，这是生物技术发展的前沿。这项成果将给人类的健康和生活带来不可估量的利益。 所谓基因治疗是指用基因工程的技术方法，将正常的基因转如病患者的细胞中，以取代病变基因，从而表达所缺乏的产物，或者通过关闭或降低异常表达的基因等途径，达到治疗某些遗传病的目的。目前，已发现的遗传病有6500多种，其中由单基因缺陷引起的就有约3000多种。因此，遗传病是基因治疗的主要对象。 第一例基因治疗是美国在1990年进行的。当时，两个4岁和9岁的小女孩由于体内腺苷脱氨酶缺乏而患了严重的联合免疫缺陷症。科学家对她们进行了基因治疗并取得了成功。这一开创性的工作标志着基因治疗已经从实验研究过渡到临床实验。1991年，我国首例B型血友病的基因治疗临床实验也获得了成功。 基因治疗的最新进展是即将用基因枪技术于基因治疗。其方法是将特定的DNA用改进的基因枪技术导入小鼠的肌肉、肝脏、脾、肠道和皮肤获得成功的表达。这一成功预示着人们未来可能利用基因枪传送药物到人体内的特定部位，以取代传统的接种疫苗，并用基因枪技术来治疗遗传病。 目前，科学家们正在研究的是胎儿基因疗法。如果现在的实验疗效得到进一步确证的话，就有可能将胎儿基因疗法扩大到其它遗传病，以防止出生患遗传病症的新生儿，从而从根本上提高后代的健康水平。1.2.5 农业领域农业是国名经济的基础，尤其我国是人口众多、人均可耕地面积少的社会主义大国，更加要主意农业的发展。本世纪五、六十年代，由于杂交品种推广、化肥使用量增加以及灌溉面积的扩大，农作物产量成倍提高，这就是大家所说的“绿色革命”。但一些研究人员认为，这些方法目前已很难再使农作物产量有进一步的大幅度提高。农业的一个关键问题是如何培育出高产、优质的农作物品种，为解决全人类共同面临的粮食短缺问题做出贡献。最近十年来，随着外源基因在转基因植株中首次获得成功的表达，应用重组DNA技术培育具有优良性状的粮食作物的工作已经初见成效。这方面的工作按其发展水平可以分为三个不同阶段：第一阶段，主要集中于有重要意义的目的基因的分离与改造；第二阶段，目标是培养出具有改良的重要经济性状的工程植株；第三阶段的发展方向是培养出具有生物反应器功能的工程植株。在农业领域，人们利用基因工程技术来改良甚至创造新的作物品种，例如用适当的基因转移来增加玉米的赖氨酸含量，或使某些作物增加维生素含量并提高产量，或把生长快的动物基因转移到家畜体内使其快速生长，等等。自从转基因作物进入农田试验以来，基因技术产品日趋增多，充分展现了21世纪农业育种的雏形。与传统的农业育种不同的是，它将作物的性丁锡国、状本质基因做了改造，使问题解决比较透彻，定向性也强。通过基因工程有可能把许多农作物的优点通过转基因技术转移到某一品种上综合表达，如优质高产、抗逆、抗病、抗虫、耐耐碱及固氮的基因等，不仅可以大大减少农药化肥对环境的污染破坏和对人类的危害，而且能够打破地域、季节的限制，减少可耕土地的使用或开发盐碱土地的使用，甚至使传统的耕种方式转入产业化的生产模式，这无疑为农业可持续发展开辟了一条有效的途径。1.2.6 基因工程药物研究 基因工程药物，是重组DNA的表达产物。广义的说，凡是在药物生产过程中涉及用基因工程的，都可以成为基因工程药物。在这方面的研究具有十分诱人的前景。 基因工程药物研究的开发重点是从蛋白质类药物，如胰岛素、人生长激素、促红细胞生成素等的分子蛋白质，转移到寻找较小分子蛋白质药物。这是因为蛋白质的分子一般都比较大，不容易穿过细胞膜，因而影响其药理作用的发挥，而小分子药物在这方面就具有明显的优越性。另一方面对疾病的治疗思路也开阔了，从单纯的用药发展到用基因工程技术或基因本身作为治疗手段。 现在，还有一个需要引起大家注意的问题，就是许多过去被征服的传染病，由于细菌产生了耐药性，又卷土重来。其中最值得引起注意的是结核病。据世界卫生组织报道，现已出现全球肺结核病危机。本来即将被消灭的结核病又死灰复燃，而且出现了多种耐药结核病。据统计，全世界现有17.22亿人感染了结核病菌，每年有900万新结核病人，约300万人死于结核病，相当于每10秒钟就有一人死于结核病。科学家还指出，在今后的一段时间里，会有数以百计的感染细菌性疾病的人将无药可治，同时病毒性疾病日益曾多，防不胜防。不过与此同时，科学家们也探索了对付的办法，他们在人体、昆虫和植物种子中找到一些小分子的抗微生物多肽，它们的分子量小于4000，仅有30多个氨基酸，具有强烈的广普杀伤病原微生物的活力，对细菌、病菌、真菌等病原微生物能产生较强的杀伤作用，有可能成为新一代的“超级抗生素”。除了用它来开发新的抗生素外，这类小分子多肽还可以在农业上用于培育抗病作物的新品种。1.3 中国基因工程的现状 自DNA重组技术1972年取得成功以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术有了飞速的发展，基因工程药物成为各国政府和企业投资研究开发的热点领域，大量的基因工程药品问世。年产值达数十亿美元。近几年，世界各国都将基因工程产品视为国民经济新的增长点，展开了激烈的市场竞争。到1999年底，全球至少已有近3000家生物工程公司从事生物药品与基因产品的研究与开发。据不完全统计，在欧美国家，已经上市的基因工程药品有近百种，大约还有超过300种以上的药物正处于临床试验阶段，约2000种药品处于研究开发中，形成了一巨大的高新技术产业。 基因工程制药产业也是中国制药行业关注的焦点，从事医药健康领域市场研究的专业公司东方健康市场研究中心对中国基因工程制药产业作了一些系统的调查研究，下面就我国基因工程制药产业的现状及存在的司题作一简要介绍。 中国生物技术产业经过十几年的发展，已经拥有一支初具规模和具有一定竞争力的研究队伍。这支队伍是以医药科研单位为核心，一些高等医药院校和综合大学生命科学院也纷纷参与研究、开发工作。中国目前约有1万余名科研技术人员专门从事基因工程药物的研究、开发和生产工作，有20个基因工程国家重点实验室，3个基因工程药物开发中心，已有15种基因工程药物获准上市，有10余种生物技术新药正处于临床试验阶段，还有重组凝乳酶等40多种基因工程药物或疫苗处于研究开发阶段。目前，已在有关部门登记立项的基因工程药物生产企业有60余家，已取得基因工程药物试生产或获得正式生产批准文号的企业大约有30家。这些企业主要分布在一些经济发达的省、市，如北京、上海、深圳、吉林、浙江、江苏、山东等。我国自20世纪70年代末即开始了基因工程研究工作，经过20多年的研究开发，我国的基因工程发展在医学、农业各个领域都取得了令人瞩目的成果，正向产业化迈进。但目前现代生物技术在医药领域的应用仍处于初级阶段，其市场前景十分广阔。而我国上市公司中真正的生物制药公司还很少，资本市场在支持生物制药产业发展方面天地广阔。 近年来，我国基因工程药品的研制，自从调整计划，改变跟踪仿制模式以来，有不少具有我国自主知识产权的基因工程药品在实验室相继问世。例如，在治疗性乙型肝炎疫苗方面，基因工程乙肝表面抗原-抗体二重合物已完成实验室研究和中式工艺研究，正申请临床试验；重组人新型肝再生增强因子项目已进入工程菌发酵、产品纯化的中式阶段；新细胞因子趋化素样因子、人神经分化因子、一系列抗肿瘤和抗病毒反义寡核苷酸制剂都有望开发成新药，目前在动物试验中获得了良好的结果。这些科研工作为我国在基因工程药物研制走自己独立自主创新的道路奠定了基础。 我国利用转基因动物作为生物反应器设生产医用蛋白和多肽的研究也取得了良好的成绩。“九五“期间，我国科学家成功地培育出可表达医药用蛋白质的转基因牛、羊。这些成就为我国培养转基因动物作为药用产品打下了良好的基础。1.4 我国基因工程的前景现代生物技术在医药领域的应用非常广泛，其中：基因工程制药产业化程度最高、市场销售量最大、涉足公司最多，人们所称的生物制药一般指此。基因芯片处于产业化前期，市场前景十分乐观。基因治疗处于初期临床试验阶段，应用前景十分巨大，但离实用还有相当长一段路要走。目前世界已有2000多家生物技术公司，其中70从事医药产品的开发。 中国基因工程药物的产业化前景：据不完全统计，中国有生物工程公司200 多家，并形成了一支近万名从事生物技术研究和开发的科技队伍，从地域上来看主要集中在北京、上海、深圳、西安、合肥等地。 未来我国研究和投资的主要方向：开发针对神经系统、肿瘤、心血管系统、艾滋病及免疫缺陷等重大疾病的多肽、蛋白质和核酸等新生物技术产品。此方面开发重点将主要是干扰素、生长激素与TPA等。 选择一批市场前景好的生物技术产品及疫苗、诊断用单克隆抗体。专家认为我国在这方面已有一定基础，开发重点是乙肝基因疫苗与单克隆抗体诊断试剂。开发靶向药物主要是开发抗肿瘤药物。血液替代品的研究与开发仍然占重要地位。生物技术在医药领域的应用：基因治疗、生物 /基因芯片、干细胞等。我认为，我国基因研究目前与世界其他先进国家有很大差距，其研究意义比网络更重要。1.5 基因工程药物 基因工程药物是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，经过一系列基因操作，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中去，这些受体细胞包括细菌、酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细胞，在受体细胞不断繁殖过程中，大规模生产具有预防和治疗这些疾病的蛋白质，即基因疫苗或药物。 在医学和兽医学中应用正逐步推广。 以乙型病毒性肝炎（以下简称乙肝）疫苗为例，像其他蛋白质一样，乙肝表面抗原（HBSAg）的产生也受DNA调控。利用基因剪切技术，用一种基因剪刀将调控HBSAg的那段DNA剪裁下来，装到一个表达载体中，所谓表达载体，是因为它可以把这段DNA的功能发挥出来；再把这种表达载体转移到受体细胞内，如大肠杆菌或酵母菌等；最后再通过这些大肠杆菌或酵母菌的快速繁殖，生产出大量我们所需要的HBSAg（乙肝疫苗）。 长期以来，医学工作者在防治乙肝方面做了大量工作，但曾一度陷于困境。乙肝病毒（HBV）主要由两部分组成，内部为DNA，外部有一层外壳蛋白质，称为HBSAg。把一定量的HBSAg注射入人体，就使机体产生对HBV抗衡的抗体。机体依靠这种抗体，可以清除入侵机体内的HBV。过去，乙肝疫苗的来源，主要是从HBV携带者的血液中分离出来的HBSAg，这种血液是不安全的，可能混有其他病原体其他型的肝炎病毒，特别是艾滋病病毒（HIV）的污染。此外，血液来源也是极有限的，使乙肝疫苗的供应犹如杯水车薪，远不能满足全国的需要。基因工程疫苗解决了这一难题。 与上述的血源乙肝疫苗相比，基因工程生产的乙肝疫苗，取材方便，利用的是资源丰富的大肠杆菌或酵母菌，它们有极强的繁殖能力，并借助于高科技手段，可以大规模生产出质量好、纯度高、免疫原性好、价格便宜的药物。在小孩出生后，按计划实施新生儿到六个月龄内先后注射三次乙肝疫苗的免疫程序，就可获得终身免疫，免受乙型肝炎之害。正是基于1996年我国已有能力生产大量的基因工程乙肝疫苗，我国才有信心遏制这一威胁人类健康最严重、流行最广泛的病种。这是基因工程药物对人类的贡献典例之一。 随着基因工程技术的进展，基因工程药物正在不断增加，创造了可以长期获取更大利润的商机。 1.6 人类基因组计划DNA存在于所有生物的所有生物的所有细胞中，而人是最高级、最复杂、最重要的生物，如果把人的基因组搞清楚，再研究生物，就容易多了。“人类基因组计划”是美国科学家于1985年率先提出的，旨在阐明人类基因组30亿个碱基对的序列，探明所有人类基因及其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我。“人类基因组计划”在研究人类过程中建立起来的策略、思想与技术，构成了生命科学领域新的学科基因组学，可以用于研究微生物、植物及其他生物。它是人类自然科学史上最伟大的创举之一。 人类基因组图谱以及初步分析结果公布之后，科学家纷纷提出人类基因组计划下一步研究的重点和研究