基因组学.ppt.ppt

1 动物基因组 2 第一节基因组学的概念 什么是基因组基因组就是一个物种中所有基因的整体组成 人类基因组有两层意义 遗传信息和遗传物质 要揭开生命的奥秘 就需要从整体水平研究基因的存在 基因的结构与功能 基因之间的相互关系 3 基因组学 基因组学最早是1986年美国霍普金斯大学著名人类遗传学家和内科教授mckusick提出来的 随着人类基因组计划的实施 基因组学逐渐成为一门以结构基因组学为主的高度综合和跨学科的科学 功能基因组学 比较基因组学 环境基因组学 药物基因组学等都纷纷出台 4 基本概念 基因组 genome 一个生物体 细胞器或病毒的整套基因和染色体组成 即全部基因的总称 包括所有的编码区和非编码区 基因组学 genomics 以基因组分析为手段 对所有基因进行基因组作图 核苷酸序列分析 基因定位 时序表达模式和基因功能分析的一门科学分子遗传学的分支学科提供有关生物物种及其细胞功能的进化信息生命科学的前沿和热点领域 5 基因组研究包括的方面 基因表达概况研究 即比较不同组织和不同发育阶段 正常状态与疾病状态 以及体外培养的细胞中基因表达模式的差异基因产物 蛋白质功能研究 包括单个基因的蛋白质体外表达方法蛋白质 蛋白质功能研究 6 基因组学的分类 分类 结构基因组学 structuralgenomics 比较基因组学 comparativegenomics 功能基因组学 functionalgenomics 药物基因组学 medicalgenomics 营养基因组学 nutritionalgenomics 生物信息学 bioinformatics 蛋白质组学 proteomics 7 基本概念 结构基因组学 通过基因作图 核苷酸序列分析确定基因组成 基因定位的科学 将基因组分解成小的易操作的结构区域 构建高分辨率的遗传图 物理图 转录本图 一个生物体基因组的最终图就是它的全部dna序列 人类基因组计划果蝇基因组拟南芥菜基因组 8 遗传连锁图 通过遗传重组所得到的基因线性排列图称为遗传连锁图 它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率 确定它们的相对距离 物理图谱 是利用限制性内切酶将染色体切成数个片段 根据重叠序列把片段连接成染色体 确定遗传标志之间物理距离 碱基对 bp 或千碱基 kb 或兆碱基 mb 的图谱 转录本图谱 由基因转录本mrna反转录建立cdna文库 通过cdna克隆测序得到基因组的表达序列图谱 9 基本概念 比较基因组学 在基因组图谱和测序基础之上 对已知的基因和基因组结构进行比较 了解基因的功能 表达机理和物种的进化的学科 比较分析7种生物的基因组 结果表明 在进化上 古细菌 真菌和真核生物有一个共同的具有自养能力的最近祖先 10 功能基因组学 后基因组学 postgenomics 利用结构基因组学提供的信息和产物 通过在基因组系统水平上全面分析基因的功能基因功能发现 基因表达分析 突变检测 基因组的表达与调控研究使得生物学研究从对单一基因与蛋白质的研究转向对基因组与蛋白质组的系统研究对成千上万的基因表达进行分析和比较 从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述一个细胞的转录表达水平能够精确特异地反映类型 发育阶段以及状态 11 药物基因组学 根据不同个体间的基因组差异与基因多态性 阐明个体间在药物代谢和效应方面发生差别的遗传基础不同的个体间药物的疗效和副作用存在差异促使新药的发现根据个体的遗传背景来优化药物治疗方案 即 个体化治疗 12 营养基因组学 研究对生物营养有重要作用的植物次级代谢途径的相关基因确定并克隆了与铁吸收转运有关的基因与生物素 维生素b1和维生素e合成有关酶的基因 13 生物信息学 以计算机为工具 用数学和信息科学的观点 理论和方法去研究生命现象 对生物信息进行储存 检索和分析的科学以基因组dna序列信息分析作为源头 破译隐藏在dna序列中的遗传语言发现新的基因和新的功能 进行蛋白质空间结构模拟和预测认识生命的起源 进化 遗传和发育的本质揭示人体生理和病理过程的分子基础 为人类疾病的预测 诊断 预防和治疗提供合理有效的方法依据特定蛋白质的功能进行必要的药物设计 14 蛋白质组学 蛋白质组 proteome 是指在一种细胞内存在的全部蛋白质蛋白质组学是研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学功能蛋白质组 functionalproteome 是指在特定时间 特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质 功能蛋白质组是总蛋白质组的一部分 蛋白质组和功能蛋白质组是生命科学的新的研究内容 15 基因组计划 模式微生物基因组计划模式植物基因组计划模式动物基因组计划人类基因组计划 16 第二节通过遗传学方法进行基因组作图 1 基因组作图的方法2 遗传作图中使用的标记3 遗传作图的方法 17 基因组作图的方法 遗传作图物理作图序列作图基因作图 18 遗传图谱 geneticmap 遗传图谱 geneticmap 又称连锁图谱 linkagemap 或遗传连锁图谱 geneticlinkagemap 是指基因组内基因和专一的多态性dna标记 marker 相对位置的图谱 遗传作图 geneticmapping 就是采用遗传学分析方法将基因或其它dna顺序标定在染色体上构建成连锁图 遗传图谱表明基因之间连锁关系和相对距离 早期绘制的经典遗传图谱的单位是重组率 1 的重组率为1个遗传单位 现代遗传图谱的单位为厘摩 centimorgan cm 1cm相当于1 的重组率 约为1000000个碱基对 basepairs bp 19 通过遗传图谱 我们可以大致了解各个基因或dna片断之间的相对距离与方向 如哪个基因更靠近着丝粒 那个更靠近端粒等 遗传距离是通过遗传连锁分析获得的 使用的dna厘摩标志越多 越密集 所得到的遗传连锁图的分辨率就越高 遗传图谱不仅是现阶段定位基因的重要手段 即使在人类基因组全物理图谱建立起来之后 它依然是研究人类基因组遗传与变异的重要手段 20 遗传作图中使用的标记 遗传标记 geneticmarkers 遗传图有特征性的位置标记用于表示基因组中特定顺序所在的位置 这些标记按孟德尔方式遗传 标记位点应是多态的 基因标记与dna标记 21 遗传标记的发展 第一代标记经典的遗传标记 蛋白质和免疫学的标记 70年代中后期 限制酶片段长度多态性 rflp 第二代标记85年 小卫星序列 minisatellite 89年 微卫星序列 microsatellite 第三代标记单核苷酸多态性标记 singlenucleotidepolymorphism snp 22 经典的遗传标记 蛋白质和免疫学的标记 abo血型位点标记hla位点标记存在问题 已知多态的蛋白质很少等位基因的数目有限无法获得足够的信息量检测技术的繁琐等 限制了人类基因组的遗传分析工作 促使人们直接在dna上寻找遗传标记 23 遗传标记中的第一代标记 70年代发展起来的dna重组技术 dna克隆技术和dna探针技术无疑为拓展遗传图谱的构建途径创造了技术条件 也使人类基因定位的方法从细胞及染色体水平过渡到分子水平 dna水平的多态性标记位点作为绘制现代遗传图谱的主要界标 大大提高图谱的精确度 准确性 遗传图谱的绘制也因此进入了一个崭新的时代 现代遗传图谱的概念是由botsteind等 1980 首先提出的 在此基础上 限制性片段长度多态性 rflp 作为遗传图谱的第一代崭新标记得以问世 该系统一经建立就广泛应用到基因组的研究中 基因或基因组可以用重叠的限制性片段来作图 最终可以扩展到整个序列 限制性位点能够用作基因标记 rflps的存在使我们能够用限制性片段构建连锁图谱 限制酶片段长度多态性在基因组中确定的位点数目达到105以上 24 基因标记 表型 phenotype 一个遗传性状必须以两种替换形式或表型存在才能用于遗传学分析 等位基因 allele 每种表型是由不同的等位基因控制 肉眼分辨的表型 颜色 形状等 果蝇遗传图的构建生化表型 微生物 25 人类的生化性状abo血型hla 人类白细胞抗原 复等位基因 multiplealleles hla drbi humanleukocyteantigens drbi 基因位点至少有59个等位基因 注 人类白细胞抗原 hla 是最复杂最具多态性的体系 位于6号染色体 仅其中的dr抗原编码位点有60多个等位基因 26 27 遗传作图的方法 连锁分析是遗传作图的基础 1905 bateson saunder和punnett在同一条染色体上的基因间表现出遗传连锁 geneticlinkage 因为它们都是在同一条长的dna分子上 部分连锁与重组 28 部分连锁与遗传作图 构建遗传图谱的基本原理是真核生物遗传过程中会发生减数分裂 此过程中染色体要进行重组和交换 这种重组和交换的概率会随着染色体上任意两点间相对距离的远近而发生相应的变化 根据概率大小 人们就可以推断出同一条染色体上两点间的相对距离和位置关系 正因为如此 我们得到的这张图谱也就只能显示标记之间的相对距离 我们称这一距离 概率 为遗传距离 cm 由此构建的图谱也称为遗传图谱 29 连锁遗传图的做法 一般以最左端的基因位置为0 如发现有新的基因在更左端的位置时 把0点让给新基因 其余的基因座位作相应移动 重组率在0 50 之间 但图谱上出现50以上的图距 这是由于较远的两基因之间发生偶数次交换 但没有出现重组类型 所以交换值要大于重组率 绘制连锁遗传图时 需根据重组率进行图距的校正 公式为rf 1 2 1 e m rf为重组率m 平均交换数m值说明在两个基因座之间每次减数分裂有8次交换 因每次交换只包括4条染色单体中的两条非姐妹染色体 所以由m转换成的真实图距应为1 2m 30 不同模式生物的连锁分析 有性杂交实验系谱分析dna转移 31 杂交实验的连锁分析 选择已知基因型的亲本 设计杂交方案 获得交配的子代并分析其表型和基因型对于高等真核生物的常规连锁分析并不是直接检查配子 而是检测分别来自两个亲本配子融合形成的二倍体基因型 即进行遗传杂交 两点杂交和多点杂交 32 系谱分析 系谱分析法即对某家庭性状相关成员进行统计 分析性状之间的连锁关系 通过重组率进行相关基因定位 这种方法又称家系分析法 pedigreemethod 不能进行有计划的遗传实验 只能收集家系成员的相关资料进行连锁分析 主要涉及人类和多年生树木 优势对数值 lodscore 分析 lod值是基因连锁可能性的对数 用于判定所研究的两个标记是否在同一染色体上 换句话说就是基因是否连锁 如果优势对数分析确定了连锁 然后可以提供最可能的重组频率程度 理想的情况是资料来自不同系谱 33 细菌的遗传作图 转化 transformation 供体细胞释放的一段dna 通常小于50kb 经受体细胞摄取后整合到基因组中 可借助抗性培养基筛选重组克隆 转导 transduction 通过噬菌体将小片段dna从供体细胞转移到受体细胞 接合转移 conjugation 两个细菌形成物理接触 dna从供体转移到受体 34 细菌的遗传重组 35 rflp连锁图 rflp是第一种用于研究的dna标记 davidbostein 1980 基本设想 由于同源染色体同一区段dna顺序的差异 用限制酶消化时 会得到长度各不相同的限制性片段 经过琼脂糖凝胶电泳分离 可直接显示不同个体同一位点dna组成的差异 由于限制酶的专一性 用不同的限制酶处理同一dna样品时 可以产生与之对应的不同限制性片断 从而提供大量位点多态性信息 36 dna限制酶分析 37 rflp连锁图 我们直接检验由限制图谱获得的基因型 而不是检测其表型的特点 左图表示三个世代限制图谱之间的血缘关系 其限制片段长度多态性 rflp 可以按孟德尔方式遗传 四种等位基因在每代中独立地分离 但图中经限制酶消化后所有等位基因之间的组合在凝胶电泳中都存在 38 基因与分子标记的共分离 共分离 如果限制酶多态性在基因组中自由发生 则有些会在特定基因附近产生 我们可以确定这样的限制性标记 因为该标记与突变表型密切相关 如果比较患病者的和正常人的dna限制图谱 可能发现一个特定的限制性位点通常出现 或者丢失 在患者dna中 原因是限制性标记与表型间100 相关 它暗示限制性标记与突变基因距离很紧 以至于它们在重组中不能分离 39 40 简单序列长度多态性 小卫星dna的核心序列一般为几个到几十个核苷酸 不同个体的不同基因座位重复次数不同 每个重复单位的组成可略有变异 这类重复单位数目分布有限 有些染色体上还未发现这类小卫星dna 它的位置一般在染色体端粒部位 亦已证明 这一序列广泛存在于人体基因组中 41 42 snp作图的一般步骤包括 获取dna序列 从dna序列确定序列标签位点 sequencetaggedsites stss 扫描stss或ests确定候选snps 确定snps 将snps定位于染色体特定位置 43 鸟枪法和重叠群法 基因组计划的基本目标是获得全基因组顺序 在此基础上再对所获得的序列进行解读 获得基因组顺序的主要方法是进行dna测序 然后再将读取的顺序组装 目前的dna测序每次反应仅能读取不到1000bp的长度 已知最小的细菌基因组为580kb 因此基因组测序的第一步是构建基因组图 然后将基因组区段分解逐个测序 最后进行组装 基因组作图的基本构想是 在长链dna分子的不同位置寻找特征性的分子标记 根据分子标记将包括这些序列的克隆进行连锁定位 绘制基因组图 一旦构建好基因组图 即可着手进入全基因组测序 以基因组图指导的测序有2种路线 重叠群法和直接鸟枪法 44 什么是鸟枪法 全基因组随机测序战略主要采用鸟枪法 shotgun 鸟枪法 也俗称 霰弹法 是随机先将整个基因组打碎成小片段进行测序 最终利用计算机根据序列之间的重叠关系进行排序和组装 并确定它们在基因组中的正确位置 鸟枪法 优点是速度快 简单易行 成本较低 可以在较短的时间内通过集中机器和人力的方法获得大量的基因片断 但是用它来测序 最终排序结果的拼接组装比较困难 尤其在部分重复序列较高的地方难度较大 此外有许多序列片段难以定位在确切的染色体上 成为游离片断 同时又会有许多地方由于没有足够的覆盖率而形成空缺 这些缺陷最终导致整个基因图会留下大量的空洞 gap 也影响其准确度 45 重叠群法 以大片断定位的克隆为基础的定向测序战略主要采用克隆步移法或称重叠群法 先构建遗传图 再利用几套高度覆盖的大片段基因组文库 bac pac等 获得精细的物理图 选择合适的bac或pac克隆测序 利用计算机拼装 bac内的空洞基本上都可以利用设计引物等手段填补 形成一条完整的bac序列 然后由相互关联 部分重叠的bac克隆连成一个大的重叠群 contig 理想状况下 整条染色体就是由一个完整的重叠群构成 46 但通常情况下部分bac之间会有物理空洞 physicalgap 这是目前国际上还未克服的难题 利用克隆步移法测序 国际上通行的标准要求bac测序达到十倍覆盖率 使所测的序列达到99 99 以上的准确度 该方法的技术难度较高 尤其大片段基因组文库 bac 和精细物理图构建是技术性极强的工作 此外 费用相对于鸟枪法要稍高一些 完成整个基因组测序周期也要长些 但是 通过这种方法得到的基因组数据是最为准确和精细的数据 也是基因组测序的最终目标 大基因组 完成图 目前大多都是通过这种方法获得的 基因组 完成图 即完全覆盖所测物种的基因组 准确率超过99 99 的全dna序列图 完成图 的覆盖率接近100 准确率更高 达到99 99 47 基因组测序的不同策略 重叠群法所谓重叠群系指相互间存在重叠顺序的一组克隆 根据重叠顺序的相对位置将各个克隆首尾连接 覆盖的物理长度可达百万级碱基对 在单个的重叠群中 采用鸟枪法测序 然后在重叠群内进行组装 这是一种由上至下 uptodown 的测序策略 直接鸟枪法首先进行全基因组鸟枪法测序 再以基因组图的分子标记为起点将鸟枪法dna片段进行组装 高密度的基因组图分子标记可以检测组装的dna片段是否处在正确的位置 并校正因重复顺序的干扰产生的序列误排 这是一种由下至上 bottomtoup 的测序策略 48 49 遗传标记中的第三代标记 单核苷酸多态性标记 singlenucleotidepolymorphsmsnp 这种标记在人类基因组中可达到300万个 平均每1000个碱基对就有一个 这种标记数目多 覆盖密度大 它的开发和应用摒弃了遗传标记分析技术的 瓶颈 凝胶电泳 为dna芯片技术应用于遗传作图提供了基础 50 基因组图的绘制可为基因组的全面测序提供工作框架 由于一些分子标记同基因座位紧密连锁 为靶基因的定位克隆提供了可能 根据靶基因所在基因组图中的位置 可以尽快获知重要基因的顺序 正是基于这些理由 人类基因组计划最初6年的工作重心主要放在人类基因组图的绘制上 51 遗传标记中的第二代标记 发现 小卫星序列minisatellite 1985年 微卫星序列microsatellite 1989年 microsatellitemarker又称简单串连重复 shorttandemrepeat str 最重要的优点是高度多态性 提供的信息量相对很大 另外可用pcr技术使操作实现自动化 20世纪80年代后期 人们开始应用微卫星序列 microsatellite ms 绘制图谱 1994年底 美 法完成了以rflp及微卫星 为标志的遗传图谱 图谱包含了5826位点 覆盖4000cm 分辨率高达0 7cm 1996年法国报道了完全以微卫星dna标志构建的遗传连锁图 包含2335位点 分辩率为1 6cm 52 第三节 通过物理方法进行基因组作图 1 概念以及简介2 限制酶作图 restrictionmapping 3 荧光原位杂交 fluorescentinsituhybridization fish 4 序列标记位点 sequencetaggedsite sts 物理作图的进展及其应用 53 比较显示了遗传学图与物理图谱的差异 后者是通过dna测序确定的 值得注意的是在遗传学图中最上面的两个遗传标记 glk1和cha1的顺序是错误的 两个图谱间其他几对标记的相对位置也有差异 54 3 1物理作图的概念以及简介 为什么需要物理作图技术 为什么不能直接从遗传作图进入测序阶段呢 主要有两个原因 a 遗传图谱分辨率有限 由于人类及其大多数高等真核生物来说 不可能获得巨大数量的后代 因此可用于研究的减数分裂体就少很多 连锁分析就受限制 导致标记密度的减小 从而影响遗传作图 b 遗传图谱精确度有限 1992年 酿酒酵母三号染色体全序列发表 人们对比遗传作图和dna测序所显示的标记的实际位置 发现重组热点的存在对遗传作图的影响 在遗传图谱中甚至出现一对基因的顺序被颠倒的情况 55 3 1物理作图的概念以及简介 物理作图是利用杂交分析和pcr等分子生物学技术检测dna分子 对有显著特征的序列进行定位 现在 常用三种重要的物理作图的方法来检验和补充遗传图谱 限制酶作图 restrictionmapping 荧光原位杂交 fluorescentinsituhybridization fish 序列标记位点 sequencetaggedsite sts 56 57 3 2限制酶作图 restrictionmapping 限制酶作图最简单的方法是比较一个dna分子被两种识别不同的靶序列的限制酶切割所产生的两套片断的大小 如上图 使用了ecor 和bamh 首先 用两种限制酶中的一种对dna分子进行消化 再用另一种进行消化 这样 我们就可以确定每种酶的限制位点的数目 但是切点之间的相对位置不能确定 58 3 2限制酶作图 restrictionmapping 限制酶作图的规模受到限制片段大小的限制 如果使用的限制酶在dna上切点相对较少 限制酶作图就比较容易 但如果切点较多 作图时所需要测定的片段大小和需要比较的单酶消化 双酶消化和部分消化片段的数量也会增加 当消化产物中含有的片段多到一定程度时 凝胶中的一些单一条带会重叠在一起 使得错误检测或完全遗漏的机会增加 59 3 3荧光原位杂交 fish fish的发展史 染色体原位杂交技术是根据核酸分子碱基互补配对的原理 有放射性或非放射性标记的外源核酸探针 与染色体上变性处理后的单链dna互补配对 再经过一系列的检测手段将待测的核酸序列在染色体上的位置显示出来的技术 原位杂交技术创建于六十年代末期 gall和pardue 1969 把经过放射性同位素标记的rdna定位到爪蟾染色体上的核仁组织区 标志着染色体原位杂交技术的建立 langer等 1982 首先采用生物素标记的探针进行了染色体原位杂交 标志着非放射性原位杂交技术 nonisotopicinsituhybridization 的建立 在荧光素物质出现后 开始使用荧光素检出杂交信号 杂交结果在荧光显微镜下观察 pinkeletal 1986 即荧光原位杂交 fluorescenceinsituhybridization 简称为fish 技术的建立 60 fish的分类 1 fish 根据使用的探针的不同分bac fish和yac fish 以大片段bac与yac克隆作为染色体原位杂交的探针 发展出了的bac fish和yac fish技术 gish genomicinsituhybricization gish 是80年代末90年代初发展起来的一种原位杂交技术 它最初应用于动物方面的研究 pinkeletal 1986 但很快在植物中得到推广应用 它用来自一个物种的总基因组dna作为标记探针 以适当浓度的另一物种总基因组dna进行封阻 在靶染色体上进行原位杂交 相对于标记dna探针 高浓度封阻dna优先与靶染色体上共有保守序列杂交 剩下的外源种特异性序列主要被标记探针所杂交 以总基因组dna为探针 3 伸展dna纤维上的原位杂交 dnafiber fish wiegant等 1992 和heng等 1992 首先利用化学方法对染色体进行线性化 再以此线性化的染色体dna纤维为载体进行fish 使fish的分辨率显著提高 这就是最初的纤维fish 在10 1000kb以上的线性dna分子可被伸展为约2 3kb m 因而可把长度结果 m级 直接转换为dna片段大小 kb 61 fish的步骤 植物 注 在染色体制片中 动物细胞直接滴片或涂片 植物细胞要除细胞壁 主要用酶解 压片等方法 植物根尖 酶解 染色体制片 烤片 rna酶处理 变性 乙醇脱水 bio dig 探针标记 纯化 变性共变性 37 复性 洗脱 荧光抗体反应 镜检 62 应用 重要的功能基因定位 1 以重要的功能基因小片段或含重要的功能基因大dna片段定位染色体上 dna片段越长结果可靠性程度高 在动物中可将300bpdna片段定位到染色体上 植物中普遍认为要10kb以上的dna片段才有可靠性 1995年 jiang等人运用bac fish首次将xa 21成功的定位到植物 水稻 染色体上 1997年 nakamura等人构建与稻瘟病基因pi ta2连锁的800kb的bac连接群 通过bac fish将pi ta2定位在水稻第12号染色体的近着丝粒区域中 同年 gomez用来源于玉米cdnash2基因筛选高粱bac文库 63 应用 核型分析与动物和人不同 植物染色体多数趋于具中央着丝粒和亚中间着丝粒的 近端着丝粒的染色体很少 核型分析比较困难 许多重要的经济作物不仅是多倍体 而且有的染色体非常小 形态相似 用传统的核型分析技术很难识别 用染色体特异的bac 重复序列和着丝粒标记进行染色体核型分析 64 探针的标记 用连接有生物素 地高辛的一种核苷酸替代要检测的dna序列中的部分碱基 与southerndna有些相似 探针种类 人工合成的核苷酸序列 dna克隆 基因组总dna 流式细胞分拣或微切割的染色体 pcr产物等 探针的标记方法 a nicktranslation nicktranslation用到dnase 和dnapolymerase两种酶 dnase 在dna序列双链的每条单链上随机产生切口 dnapolymerase有三种功能 从切口处5 至3 降解 3 至5 合成以及3 至5 校对功能 在这两种酶的作用下使连接有生物素 地高辛的一种核苷酸替代原来的碱基 b pcr标记 c randomprimerlabeling 65 杂交和检测 杂交 变性后的染色体制片和探针在37 复性 探针与染色体上的目的dna结合 通过不同严谨度的洗脱 非特异的结合解脱检测 用不同荧光素偶联的抗生物素 地高辛的抗体与杂交后的制片进行一步或多步抗原 抗体反应 使目的信号放大并带有荧光素标记镜检 在荧光显微镜的不同波长的激发光下产生不同颜色把不同标记 生物素和地高辛 的dna区分开来 66 67 68 69 70 3 4序列标记位点 sts 作图 目前最有效的物理作图技术 也是能对大基因组作出最详尽图谱的技术 是sts作图 一个序列标记位点 sts 是一段短的dna序列 通常长度在100到500bp 易丁识别 仅存在于待研究的染色体或基因组中 作一套sts图谱需要收集来自单条染色体或一个完整基因组的重叠的dna片段 在下图中 从单条染色体中制备一组dna片段 使染色体上每一点平均有5条片段对应 71 上述的两个前提易于满足 因此可以通过多种途径获得sts 最常见的来源是 表达序列标记表达序列际记 expressedscquencetagest 是通过互补dna cdna 克隆分析获得的短序列 sslp具有多态性的sslp在遗传作图中可被用作sts 可通过连锁分析定位 来为物理图谱提供直接联系 随机基因组序列可以通过对科隆的基因组dna的随机小片段进行测序或在数据库中搜寻贮存序列获得 72 用于sts作图的dna片段sts作图过程中所必需的第二个要素是可覆盖待研究的染色体或基因组的dna片段群 这样的片段有时也称作作图试剂 mappingreagent 目前通过两种途径来获得作图试剂 放射杂交 克隆文库 73 放射杂交体是指人细胞经x线照射 染色体断裂成碎片段与仓鼠细胞融合杂交细胞体 含5 10mb人dna片段 但并非所有的企鼠细胞都能接受染色休碎片 因此需要采用某种方式来鉴定杂交体 74 克隆文库 与制备放射杂交体组一样 克隆文库可来自基因组dna 也可来自某一类染色体 与放射杂交体组相比 用克隆文库进行sts作图时有一个优点 单独的克隆可提供测序的dna 可构建物理图谱 也适用于确定含有重叠dna片段的克隆 75 第四节基因组测序与序列组装 基因组计划的最终目标是获得所研究的生物的完整的dna顺序 最佳状况是将物理图谱和遗传图谱进行有机整合 以便于确定基因以及其他重要的序列在dna顺序中的位置 这里主要介绍基因组测序中所采用的技术和策略 主要内容 1 dna测序的方法2 dna顺序的组装3 基因组顺序的其他路线4 人类基因组的测序和组装 76 4 1dna顺序的方法 dna测序技术主要有两种方法 都是在20世纪70年代中期发明的 a 链终止法 thechainterminationmethod 是通过合成与单链dna互补的多核苷酸链来读取待测dna分子的顺序 b 化学降解法 chemicaldegradationmethod 是将双链dna分子用化学试剂处理 产生切口 用同位素标记进行测序 77 链终止法测序的原理 78 链终止法对dna多聚酶的要求 a 高酶活性b 无5 3 外切核酸酶活性c 无3 5 外切核酸酶活性5 3 外切核酸酶使dna聚合酶去除已存在的链3 5 外切核酸酶使dna聚合酶校正自身错误 79 链终止法要求单链作为模板 a 将dna克隆到质粒载体中b 以m13载体克隆单链dnac 以噬菌体克隆dnad pcr产生单链dna pcr制备单链dna 80 通过m13载体获得单链dna 通过在m13载体中克隆获得单链dnam13有两种形式 双链复制型和噬菌体颗粒中存在的单链模型 81 链终止法中引物的影响 引物决定了模板链的测序起点 一般来说 是采用克隆位点附近载体上的一段顺序 a 通用引物 与载体dna中附近插入片段的顺序退火 可引入新链的合成 b 内部引物 提供一系列端部以及内部可完成长序列顺序的克隆 82 83 4 2dna顺序的组装 主要有三种方法将大量短的dna顺序组装起来 鸟枪法 克隆重叠群法 引导鸟枪法 84 利用鸟枪法得到流感嗜血杆菌基因组序列的方法 85 通过覆盖不同序列重叠群之间间隙的序列拼接流感嗜血杆菌的全基因组序列 86 克隆重叠群的序列组装 克隆重叠群法是获得真核生物基因组序列的传统方法 也是可用于测已有物理或遗传图谱的微生物基因组序列 在进行克隆重叠群中 必须使用大片段dna克隆载体 如噬菌体p1载体 细菌人工染色体 bacterialartificialchromosome bac 酵母人工染色体 yeastartificialchromosome yac p1来源的人工染色体 p1 derivedartificialchromosome pac 87 噬菌体p1载体 与 载体相似 由于p1载体的基因组要大于 噬菌体基因组 并且其颗粒也比噬菌体大 故可以p1载体克隆更长的dna片段 bac 是基于大肠杆菌的野生型f质粒设计的 bac可用于克隆300kb左右的片段 pac 结合p1载体和bac所设计的 其容量也可以达到300kb 在搭建克隆dna片段重叠群的最简单的方法就是从文库中的一个克隆开始 进行染色体步移 chromosomewalking 88 yac载体的工作原理 89 染色体步移的原理 在开始时 使用其中的一个克隆的插入片段做探针 与文库中的所有其他克隆杂交 90 基因组顺序的其他路线 a est顺序 est顺序的优点 1 mrna可直接反转录为cdna 易于构建cdna文库 2 获取est的次数少 量少 一次cdna测序就可以获得est顺序 500bp的cdna顺序就可以鉴定其所在的基因 3 无需反复检测est顺序的准确性 b 浏览顺序 sequenceskimming 粗略分析初步顺序结果从中寻找基因顺序 91 c 克隆指纹图谱 clonefingerprinting 1 重复dna指纹图谱 repetitivednafingerprint 将一系列限制片段印迹后 用特异针对于一类或多类基因组范围内重复的探针进行southernblot 2 重复dna的pcr或散布重复元件pcr interspersedrepeatelementpcr ire pcr 使用在基因组范围内重复序列处退火的寡核苷酸作为引物 扩增两个两个相邻重复片段间的单拷贝序列 重复序列在基因组上不是均匀分布 通过它为其他克隆作为比较的指纹 在人类基因组中就有alu元件具有这样的作用 3 sts含量作图 stscontentmapping 可将克隆重叠群定位于标有sts的物理图谱上 文库中的每一个克隆都在各个sts处进行pcr反应 如果sts在基因组中是单拷贝的 我们就可以得到pcr产物的所有克隆均含有相互重叠的插入子 92 a 限制图谱 b 重复dna指纹图谱 c 重复dna的pcr d sts含量作图 93 人类基因组测序中的主要方法 bac克隆法 est顺序快速克隆基因 94 人类基因组测序中的伦理问题 人类基因组计划一开始就有争议 目前 随着大规模测序的进行 许多伦理句题也随之产生 主要的一个争议就是谁将拥有人类dn入序列 对很多人来说 dna序列的归属只是一个观念问题 但是 从人类基因组包含的信息中可获得非常可观的经济利益 例如 我们可以用基因序列指导新药的开发和针对癌症或其他疾病的治疗方案 人类基因组计划一直支持伴随着基因组测序而产生的伦理 法律 社会句题的研究 在美国更是如此 尤其是 必须足够谨慎以确保基因组序列不被应用于某个个人 克隆并测序的dna只能取自己完全同意以这种方法使用其材料的个人 并且要保证匿名 当它的文库毁坏 需要用新材料检测现存的物理图时 就需要对研究成果近行一定量的重复对比 人们已接受并认为这样的重复上作是必要的 而且必须格外小心以维持和增强公众对人类基因组计划的信任 95 第五节基因组序列的诠释 人们研究基因组的最终目的不是为了得到基因组的全部序列 而是诠释基因组所包含的信息和基因组功能 在这一部分中 我们主要探讨利用什么方法来获得基因组的功能以及什么样的基因组功能 1 在基因组中搜寻基因2 基因功能的测定 96 在基因组中搜寻基因 在获得基因组或dna序列后 可以采用人工或计算机序列筛选的方法来获得基因 目前 使用比较多的方法是orf openingreadingfram es 扫描 orf openingreadingframes 每个编码蛋白的基因都含有orf 它是由一系列密码子组成 通常以atg开始 taa tga tag结束 通过寻找起始密码子和终止密码子的orf序列是寻找基因的一种重要的方法 寻找orf的成功的关键在于终止子在dna序列中出现的频率 97 终止子出现的频率与cg含量之间的关系 98 在基因组中搜寻基因 适用于高等真核生物基因组的orf扫描方法 a 密码子偏倚 codonbias 密码子偏倚是指特定生物的基因中并非平均地使用每一个密码子 如人类基因组中的密码子偏倚 99 适用于高等真核生物基因组的orf扫描方法 b 寻找外显子 内含子边界 exon intronbound aries 上游的外显子 内含子边界通常是 5 aggtaagt 3 gt不发生改变 下游的外显子 内含子边界通常是 5 pypypypypypyncag 3 py t或c n 任意核苷酸 100 适用于高等真核生物基因组的orf扫描方法 c 上游调控序列 upstreamcontrolseque nce 上游调控序列和外显子 内含子边界一样具有显著特征 这些特征是参与基因表达的dna结合蛋白的识别信号 除了这三种方法以外 寻找同源性序列也为基因筛选提供了补充 101 基因定位目前 已经有多种实验方法来定位基因 如northernblot zooblot等 northernblot和zooblot可以判断dna片段中是否含有基因 但是不能给出基因定位信息 获得基因定位信息的最容易的方法是cdna测序 cdna测序受两个方面的影响 一是相关cdna在cdna文库中出现的频率 二是cdna的完整性 102 精确定位转录末端的方法 目前对于精确定位转录末端 多采用race rapidamplificationofcdnaends 103 104 105 6 2基因功能的测定 一 利用计算机分析基因功能 1 利用同源性确定基因功能同源基因都拥有一个共同的祖先基因 它们之间有许多相似的序列 同源基因可以分为2类 种间同源基因或直系基因 orthologousgene 这是指不同物种之间的同源基因 它们来自物种分化以前的共同祖先 种内同源基因或平行基因 paralogousgene 同一物种内的同源基因 它们常常是多基因家族的不同成员 其共同祖先可能存在于物种形成以后 也可能存在于物种形成之前 106 同源基因一般不会有完全一致的核苷酸序列 因为不同的基因或不同的生物都会独立地发生随机突变 但它们有相似的序列 大部分未突变的核苷酸位置是相同的 当一个新基因的序列被确认后 根据同源性可以从数据库中查找已知序列的同源基因 根据进化的相关性 可以根据已知的同源基因推测新基因的功能 同源性分析可以给出整个基因或其中某一区段功能的有关信息 2 同源性分析在酵母基因组计划中的应用 酵母基因组大约含有6000个基因 30 是通过传统遗传学分析得到的 另外70 是用同源性分析获得 107 二 用实验分析确定基因功能 1 基因失活在基因功能分析的作用基因的功能是一个过程 是从基因到表型的一系列生理生化反应过程 现在的基因功能研究与传统的遗传分析正好相反 传统的遗传分析是从表型出发最终到达基因 正向遗传学 而在基因组计划中研究基因功能则是从基因出发 最终到达表型 反向遗传学 因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标基因相关的表型 基因失活是基因功能分析的主要手段 108 基因剔除 knock out 将一段无关的dna片段用来取代目标基因是最简单的基因失活方法 其主要原理是 用一段无关的核苷酸序列取代目标基因的中间序列 并将其导入生物体内或目的细胞内 如果该基因所控制的表型变化了 就从反面验证了目标基因的功能 109 反义rna技术反义rna由基因的负链 模板链的互补链 编码 可以与由功能基因转录而成的正义rna形成双链结构 干扰mrna的翻译 从而干扰基因的表达 将基因的编码序列反向插入表达载体 转化目标生物 获得转基因个体或品系后 进一步分析表达的反义rna在生理生化或形态发生中所起的作用 由此判别目标基因的功能 转座子插入突变将转座子随机插入功能基因内 使其失活 也可以用于基因功能研究 110 3 基因的超表达用于功能检测 在正常情况下 基因产物的数量是有限制的 必须与其它基因的产物平衡 某一基因产物的过量和不足都会破坏这种平衡 造成生长和发育的异常 有两种技术可以使细胞中某一基因过量表达 增加基因的拷贝数 采用强启动子 111 4 酵母菌双杂交系统 真核生物中 rna的转录必须有称为转录因子的蛋白质的参与 转录因子与基因上游的特定dna序列结合 然后激活rna聚合酶 起始rna的合成 转录因子有2个重要的功能区域 一个与启动子区域的dna序列结合 另一个与rna聚合酶的激活有关 有些转录因子中的这2个片段即使分割开来 仍然可以在同一个细胞内相互作用 装配成一个完整的 有功能的转录因子 在酵母菌双杂交系统中 将编码这2个功能域的dna分别构建在2个独立的表达载体上 在一个表达载体中 与dna结合功能域的基因片段与待测蛋白质的基因连接成融合基因 在另一个载体中 rna聚合酶激活功能域的基因片段与未知的dna序列连接成融合蛋白基因 将这2个表达载体同时转化一个细胞 并在细胞内表达 如果dna结合功能域蛋白与同rna聚合酶激活功能域蛋白之间能够互作 就会启动报告基因的表达 112 第七节比较基因组学 伴随着基因组的研究 相关信息出现了爆炸性增长 迫切需要对大量基因组数据进行处理 比较基因组学作为一门重要的工具学科孕育而生 比较基因组学是通过对系统发育中的代表性物种之间的全方位基因和基因家族的比较分析 构建系统发育的遗传图谱 来揭示基因 基因家族的起源和功能及其在进化过程中复杂化和多样化的机制 113 果蝇基因组 果蝇基因组全长180mb 2 3是euchromatio 1 3是hetrochromatin wgs定位3114 8mb blastsearch确定有14113个转录产物 功能基因 science 287 2185 2195 2000 114 比较基因组学定义 利用不同物种基因组之间功能区域顺序上 组织结构上的同源性 克隆新基因 揭示基因功能 阐明物种进化关系及基因组的内在结构 这便是比较基因组学 115 比较基因组学的应用 揭示非编码功能序列新基因的发现功能性snp的发现阐述物种间的进化史阐明人类疾病过程的分子机制 116 比较基因组学与进化 古细菌产甲烷球菌与原核生物有着共同的染色体组织与结构 如环状基因组 基因的操纵子结构等 其能量产生和固氮基因与原核生物也有很高的同源性 该基因组中与细胞分裂有关的蛋白质及20多个编码无机离子运输蛋白的orf与细菌基因同源 而且其调控模式也类似于原核生物 然而 产甲烷球菌在细胞遗传信息传递 尤其是转录和翻译系统 以及分泌系统方面与真核生物同源 说明该细菌与真核生物亲缘关系较近 117 比较基因组学提供的结果表明 在进化系统树上 古细菌与真核生物亲缘关系比原核生物更近 在自养生物的三个分支 细菌 古细菌和真核生物中 细菌的分化发生较早 118 比较基因组学的具体应用方法和策略 确定基因组序列的进化关系染色体片段的分析物种序列的优化选择对dna序列的信息注释序列的比对分析 119 比较基因组学研究举例 原核模式生物比较基因组学酿酒酵母基因组人类基因组 120 模式生物比较基因组研究特点 模式生物基因组一般都比较小 但编码基因的比例较高 重复序列和非编码序列较少 是一些 压缩 的基因组 2模式生物基因组中g c 含量高 同时cpg岛的比例也比较 3在模式生物特别在人的基因组中发现了重复 duplication 4在各种不同的物种中 大多数的重要生物学功能是由相当数量的同源序列基因 orthologous 蛋白承担 5同线 synteny 连锁的同源基因在不同物种基因组中有相同连锁关系 6生物体的复杂性一般表现在 生物学 的复杂性 与基因组的c值大小及基因数量未必一定呈线性关系 121 模式生物基因组的研究 尿殖道支原体是已知最小的基因组 由此可能确定能自我复制的细胞必需的一套最少的核心基因 流感嗜血杆菌的基因组为1 83mb 而尿殖道支原体的基因组只有0 58mb 二者相差3倍多 那么 基因组大小影响了基因数目还是基因尺度 122 流感嗜血杆菌基因大小平均900bp 尿殖道支原体的基因为1040bp 基因大小差不多 流感嗜血杆菌中平均1042bp有1个基因 尿殖道支原体中平均1235bp有1个基因 可见基因组尺度减小并不引起基因密度的增加和基因本身尺寸的减小 二者差别在于基因数量上 流感嗜血杆菌基因组有1743个orf 而尿殖道支原体只有470个orf 123 通过对尿殖道支原体与流感嗜血杆菌这两个亲缘关系较远的生物基因组的比较 选取其共同的基因 共240个 再加上一些其他基因 最后组成一套含256个基因的最小基因组 124 最简单的真核生物 酿酒酵母基因组 单细胞真核生物酿酒酵母基因组为12 068kb 比单细胞的原核生物和古细菌大一个数量级 酿酒酵母基因组共有5887个orf 这比原核生物和古细菌要多很多 酿酒酵母的基因密度为1个基因 2kb 密度小于原核生物流感嗜血杆菌和尿殖道支原体 酿酒酵母是最小的真核基因组 裂殖酵母其次 其密度是1 2 3kb 简单多细胞生物线虫的基因密度为1 30kb 第二 酿酒酵母只有4 的编码基因有内含子 而裂殖酵母有40 编码基因有内含子 125 人类基因组基因的三条推测依据 1 根据已测定大片段dna中orf的比例 2 cpgisland的个数 56 的已知基因5 都与cpg相连 而人基因组中有45000个islands 3 ests已经报道的是第22染色体和第21染色体 第21染色体全长33 65mb 长臂上有33 546mb 仍有7个缺口 长约3kb 99 7 thednasequenceofhumanchromosome22 nature402 489 495 1999 thednasequenceofhumanchromosome21 nature405 311 319 2000 21q上有127个已知基因 98个推测的基因59个pseudogenes chromosome22中有545个编码基因第21 22染色体