氧化石墨烯负载多柔比星对多发骨髓瘤细胞的杀伤作用.doc

www.CRTER.org邢丽娜，等. 氧化石墨烯负载多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用氧化石墨烯负载多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用邢丽娜，张学军，王 颖，牛志云，王福旭，温树鹏(河北医科大学第二医院血液内科，河北省石家庄市 050000)引用本文：邢丽娜，张学军，王颖，牛志云，王福旭，温树鹏. 氧化石墨烯负载多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用J.中国组织工程研究，2016，20(38):5636-5641.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.002 ORCID: 0000-0003-3976-6575(邢丽娜)文章快速阅读：氧化石墨烯负载多柔比星的抗肿瘤作用邢丽娜，女，1984年生，满族，河北省承德市人，2009年河北医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事血液病研究。中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)38-05636-06稿件接受：2016-07-09正常对照组(1) CCKK-8测定细胞活性(2) 流式细胞仪测定细胞凋亡(3) 流式细胞仪测定细胞周期氧化石墨烯负载多柔比星组人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226多柔比星组氧化石墨烯负载多柔比星具有较强的毒性作用，可诱导人多发性骨髓瘤细胞凋亡氧化石墨烯组文题释义：氧化石墨烯：为一种纳米材料，在生物医学领域有广泛应用，生物相容性比较好，吸附能力比较强，并且具有功能化和修饰作用，能够吸附和缓释药物。氧化石墨烯具有载药性能，主要用于负载抗癌药物，氧化石墨烯对药物的装载率比其他纳米材料高，是恶性肿瘤患者生物治疗和靶向治疗比较好的选择。氧化石墨烯的安全性：体外关于氧化石墨烯对细胞的毒性作用的研究存在争议，一般认为氧化石墨烯对细菌具有毒性作用，在高浓度条件下能够引起细胞凋亡。关于氧化石墨烯的体内研究认为氧化石墨烯对细胞的毒性比较小，对器官脏器没有毒性作用。由于氧化石墨烯具有良好的生物相容性，良好的靶向作用和载药性能，在体内比较安全，因此是负载抗肿瘤药物的比较好的载体。摘要背景：研究发现氧化石墨烯对正常细胞的毒性比较低，但有关氧化石墨烯负载多柔比星抗肿瘤药物后对恶性肿瘤细胞是否有影响的研究不多。 目的：探讨氧化石墨烯负载多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用。 方法：取对数生长期人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226，分4组培养，其中3组分别加入氧化石墨烯负载多柔比星、多柔比星、氧化石墨烯，对照组不干预。培养24 h，CCK-8方法检测细胞活性，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果与结论：对照组细胞质透亮清晰，多数为饱满形态；氧化石墨烯组细胞质较透亮，少数细胞出现皱缩；多柔比星组细胞形态不均一，细胞出现皱缩，有凋亡小体出现；氧化石墨烯负载多柔比星组细胞体积明显缩小，皱缩较明显，出现凋亡小体；氧化石墨烯负载多柔比星组、多柔比星组、氧化石墨烯组细胞存活率均低于对照组(P 0.05)，氧化石墨烯负载多柔比星组细胞存活率明显低于氧化石墨烯组(P 0.05)；氧化石墨烯负载多柔比星组、多柔比星组细胞凋亡率高于氧化石墨烯组、对照组(P 0.05)；4组间细胞周期比较差异无显著性意义；结果表明，氧化石墨烯负载多柔比星具有较强的毒性作用，可诱导人多发性骨髓瘤细胞凋亡。关键词：生物材料；纳米材料；氧化石墨烯；多柔比星；多发性骨髓瘤；细胞；凋亡；细胞毒性 主题词：多柔比星；多发性骨髓瘤；组织工程5637 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 Graphene oxide loaded with doxorubicin: a killer for multiple myeloma cellsXing Li-na, Zhang Xue-jun, Wang Ying, Niu Zhi-yun, Wang Fu-xu, Wen Shu-peng (Department of Hematology, Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China)AbstractBACKGROUND: Cytotoxicity of graphene oxide to normal cells is relatively low, but whether graphene oxide loaded with doxorubicin has some effects on malignant cells is rarely reported. OBJECTIVE: To explore the cytotoxicity of graphene oxide loaded with doxorubicin on multiple myeloma cells.METHODS: Multiple myeloma cell line RPMI8226 in logarithmic phase was selected, cultured and divided into four groups, including graphene oxide loaded with doxorubicin, doxorubicin and graphene oxide groups as well as control group with no intervention. After 24 hours of culture, the cell activity was detected by cell counting kit-8 method, and the cell cycle and apoptosis were detected using flow cytometry.RESULTS AND CONCLUSION: Plump-shaped cells with translucent and clear cytoplasm were found in the control group; cells with relatively translucent cytoplasm, and even a few shrunken cells appeared in the graphene oxide group; cellular morphology was in a heterogeneity, apoptotic bodies appeared in the doxorubicin group; the cells was significantly reduced in size, presenting more obvious shrinkage and apoptotic bodies in the group of graphene oxide loaded with doxorubicin. The cell survival rate in the graphene oxide loaded with doxorubicin, doxorubicin and graphene oxide groups was significantly lower than that in the control group (P 0.05), and this indicator was significantly lower in the group of graphene oxide loaded with doxorubicin than the graphene oxide group (P 0.05). The apoptotic rate in the group of graphene oxide loaded with doxorubicin and doxorubicin group was significantly higher than those in the graphene oxide and control groups (P 0.05), respectively. Additionally, there were no significant differences in the cell cycle among groups. These results show that graphene oxide loaded with doxorubicin has a stronger cytotoxicity, and can induce apoptosis in human multiple myeloma cells.Subject headings: Doxorubicin; Multiple Myeloma; Tissue EngineeringCite this article: Xing LN, Zhang XJ, Wang Y, Niu ZY, Wang FX, Wen SP. Graphene oxide loaded with doxorubicin: a killer for multiple myeloma cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(38): 5636-5641.Xing Li-na, Master, Attending physician, Department of Hematology, Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China5639ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction多发性骨髓瘤是一种血液系统恶性肿瘤，患此病患者几乎都有复发的风险，被看成是一种不能治愈的恶性肿瘤，寻找新的治疗多发性骨髓瘤的方法具有重要意义。多柔比星能够阻止DNA及RNA的合成，为周期非特异性治疗药物，对肿瘤细胞具有杀伤作用，在多发性骨髓瘤的治疗中具有重要作用，但多柔比星的不良反应较大，在杀伤恶性细胞的同时对正常细胞也具有杀伤作用1。纳米药物载体能够提高多柔比星的治疗效果，降低不良反应。氧化石墨烯为纳米材料的一种，生物相容性较好，在生物传感器、药物载体方面有广泛应用，在医学及生物材料学方面具有良好的应用前景2-6。氧化石墨烯对正常细胞的毒性较低7-9，对肺癌细胞也具有低毒性10，但氧化石墨烯负载多柔比星抗肿瘤药物后，对恶性肿瘤细胞是否有影响是血液内科比较关注的一个问题。实验通过制备氧化石墨烯负载多柔比星，观察其对多发性骨髓瘤细胞的影响，结果发现氧化石墨烯对多发性骨髓瘤细胞的毒性较低，对多发性骨髓瘤细胞的生长周期和细胞凋亡没有影响，氧化石墨烯负载多柔比星不影响多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的毒性作用及诱导细胞凋亡的能力。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 体外细胞学对照观察实验。1.2 时间及地点 实验于2013年7月至2014年9月在河北医科大学第二医院实验室完成。1.3 材料 RPMI8226人多发性骨髓瘤细胞株，购自于协和医科大学细胞中心。1.4 实验方法 制备氧化石墨烯：将5 g膨胀石墨、5 g硝酸钠、 30 g高锰酸钾与230 mL浓硫酸混合，然后置于273 K温度下，24 h后置入308 K温度下搅拌，去离子水稀释，温度升高值371 K时保持15 min，然后加入过氧化氢，离心，加入去离子水和HCl洗涤，便得到氧化石墨烯。氧化石墨烯吸附多柔比星：将6 mg氧化石墨烯加入10 mL多柔比星稀释液中震荡得到。氧化石墨烯负载多柔比星对骨髓瘤细胞影响实验的主要试剂和仪器：试剂和仪器来源多柔比星浙江海正药业有限公司石墨青岛亨得利石墨有限公司高锰酸钾、浓硫酸北京中山金桥生物技术公司RPMI1640培养液、PBS美国Gibco公司硝酸钠北京中山金桥生物技术公司CCK-8日本同仁公司青霉素、链霉素沈阳东药集团公司胎牛血清美国 Hyclone公司二氧化碳培养箱、离心机德国 Heraeus公司倒置显微镜日本Olympus公司流式细胞仪美国BD公司RPMI8226人多发性骨髓瘤细胞株的培养和传代：将RPMI8226人多发性骨髓瘤细胞株接种于RPMI1640培养液中，置入二氧化碳培养箱中进行培养，每隔2 d进行1次换液，每隔4 d进行1次传代培养，取生长良好的对数期生长细胞进行实验。RPMI8226人多发性骨髓瘤细胞株分组干预：将生长良好的对数生长期RPMI8226人多发性骨髓瘤细胞，置入离心管中离心，培养基重悬细胞，调节细胞浓度为5107 L-1，在培养箱中培养2 h，接种到细胞培养板上，分4组培养：氧化石墨烯负载多柔比星组加入氧化石墨烯负载多柔比星(氧化石墨烯60 mg/L+多柔比星 2.5 mg/L)，多柔比星组加入多柔比星(2.5 mg/L)，氧化石墨烯组加入氧化石墨烯(60 mg/L)，对照组不予处理，继续培养24 h，观察细胞形态。1.5 主要观察指标不同材料对多发性骨髓瘤细胞的毒性：分组干预 24 h后，在每组中加入CCK-8继续培养2 h，通过用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其黄色光吸收值，可间接反映活细胞数量。测量每孔的吸光度值，每组取5孔，求平均值。细胞存活率=实验组A值/对照A值。不同材料对多发性骨髓瘤细胞周期的影响：分组干预24 h后离心，弃去上清液，PBS重悬细胞，离心，弃去上清液，加入碘化丙啶染色，采用流式细胞仪进行检测。不同材料对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响：分组干预24 h后离心，弃去上清液，PBS重悬细胞，加入Annexin V-FITC，加入工作也PI进行培养，采用流式细胞仪进行检测。1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行分析，多组间均数比较采用LSD检验，两两均数比较采用t 检验，取P=0.05为显著标准。2 结果 Results 2.1 不同材料对多发性骨髓瘤细胞形态的影响 对照组细胞质透亮清晰，多数为饱满形态；氧化石墨烯组细胞质较透亮，少数细胞出现皱缩；多柔比星组细胞形态不均一，细胞出现皱缩，并有凋亡小体出现；氧化石墨烯负载多柔比星组细胞体积明显缩小，皱缩较明显，出现凋亡小体，见图1。2.2 不同对多发性骨髓瘤细胞活性的影响 氧化石墨烯负载多柔比星组、氧化石墨烯组、多柔比星组、对照组的细胞存活率分别为(64.36.5)%、(85.30.9)%、(74.51.3)%、100%。 4组细胞存活率比较差异有显著性意义(F=11.583，P 0.05)，两两之间比较发现：氧化石墨烯负载多柔比星组、多柔比星组、氧化石墨烯组的细胞存活率均低于对照组(P 0.05)，氧化石墨烯负载多柔比星组细胞存活率明显低于氧化石墨烯组(P 0.05)。结果表明，氧化石墨烯对多发性骨髓瘤细胞具有毒性作用，但细胞存活率在80%以上，其毒性作用较低；多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的毒性作用较大，氧化石墨烯对多柔比星的毒性作用没有太大影响。 2.3 不同材料对多发性骨髓瘤细胞周期的影响 氧化石墨烯负载多柔比星组、多柔比星组和氧化石墨烯组细胞周期G0/G1、S和G2/M之间比较差异均无显著性意义(P 0.05)。两两之间比较：石墨烯负载多柔比星组细胞周期G0/G1、S和G2/M与多柔比星组、氧化石墨烯组、对照组比较差异无显著性意义(P 0.05)，氧化石墨烯组细胞周期G0/G1、S和G2/M和对照组、多柔比星组比较差异无显著性意义(P 0.05)，见表1。表明氧化石墨烯负载多柔比星、多柔比星和氧化石墨烯均不影响多发性骨髓瘤细胞的细胞周期。 2.4 不同材料对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响 氧化石墨烯负载多柔比星组、氧化石墨烯组、多柔比星组、对照组的细胞凋亡率分别为(15.40.8)%、(5.41.2)%、(14.52.1)%、(5.60.9)%。 4组细胞凋亡率比较差异有显著性意义(F=9.584， P 0.05)，氧化石墨DCB A图1 各组多发性骨髓瘤细胞的形态(200)Figure 1 Morphology of multiple myeloma cells in each group (200)图注：图中A为对照组，细胞质透亮清晰，多数为饱满形态；B为氧化石墨烯组，细胞质较透亮，少数细胞出现皱缩；C为多柔比星组，细胞形态不均一，细胞出现皱缩，并有凋亡小体出现；D为氧化石墨烯负载多柔比星组，细胞体积明显缩小，皱缩较明显，出现凋亡小体。表1 氧化石墨烯负载多柔比星对多发性骨髓瘤细胞周期的影响 (s，%)Table 1 Effect of oxidation graphene loaded with doxorubicin on the cell cycle of multiple myeloma cells组别G0/G1SG2/M氧化石墨烯负载多柔比星组28.315.860.48.711.38.2氧化石墨烯组31.13.9多柔比星组31.55.7对照组34.65.9F0.9781.2642.747P0.6840.5740.086烯负载多柔比星组和多柔比星组细胞凋亡率比较差异无显著性意义(P 0.05)，氧化石墨烯负载多柔比星组、多柔比星组细胞凋亡率高于氧化石墨烯组、对照组(P 0.05)。表明氧化石墨烯不引起多发性骨髓瘤细胞的凋亡，多柔比星可诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡，氧化石墨烯不影响多柔比星对多发性骨髓瘤细胞的凋亡作用。3 讨论 Discussion多发性骨髓瘤是浆细胞不断恶性增殖的一种血液系统恶性肿瘤，目前的治疗主要为分阶段治疗：诱导治疗：对于符合移植条件的患者，在移植前先给予诱导治疗，诱导治疗药物主要有地塞米松、长春新碱、硼替佐米及多柔比星等11-14。移植治疗：对于经诱导治疗，病情稳定或缓解的患者，可给予移植治疗，包括自体造血干细胞移植和异基因造血干细胞移植15-17。巩固及维持治疗：干细胞移植后需给予巩固和维持治疗，缩小残留灶，提高缓解率，主要药物有硼替佐米、沙利度胺和地塞米松等18-22。复发后治疗：对于移植后复发的患者，考虑给予化疗治疗，常采用硼替佐米、沙利度胺和地塞米松联合方案进行化疗23-24。虽然多发性骨髓瘤的治疗方法不断改进，但其治愈率仍较低，大多数会面临复发的风险。多柔比星是治疗多发性骨髓瘤的常用药物，能阻止DNA和RNA合成，对多发性骨髓瘤细胞具有杀伤作用25-26，但多柔比星在杀伤恶性细胞的同时也杀伤正常细胞，有骨髓抑制、心脏毒性的不良反应27-31。研究降低多柔比星毒性作用的药物具有重要意义。氧化石墨烯为一种纳米材料，在生物医学领域有广泛应用32-33，生物相容性比较好，吸附能力比较强，并且具有功能化和修饰作用，能够吸附和缓释药物。氧化石墨烯具有载药性能，主要用于负载抗癌药物，是恶性肿瘤患者生物治疗和靶向治疗比较好的选择。多柔比星在氧化石墨烯的载药率达400%左右34，氧化石墨烯负载药物后具有靶向作用，可降低抗肿瘤药物对正常细胞的毒性作用35-36。氧化石墨烯负载药物后对药物具有缓释作 用37，药物释放时间长。对于氧化石墨烯的安全性研究发现，体外关于氧化石墨烯对细胞的毒性作用的研究存在争议38-39，一般认为氧化石墨烯对细菌具有毒性作用，在高浓度条件下能够引起细胞凋亡。关于氧化石墨烯的体内研究认为氧化石墨烯对细胞的毒性比较小，对器官脏器没有毒性作用。由于氧化石墨烯具有良好的生物相容性，良好的靶向作用和载药性能，在体内比较安全，因此是负载抗肿瘤药物的比较好的载体。实验制备氧化石墨烯负载多柔比星，研究其对多发性骨髓瘤细胞的影响，结果发现：氧化石墨烯组细胞质比较透亮，少数细胞出现皱缩；多柔比星组细胞形态不均一，细胞出现皱缩，并有凋亡小体出现；氧化石墨烯负载多柔比星组细胞体积明显缩小，皱缩比较明显，出现凋亡小体。氧化石墨烯负载多柔比星组细胞存活率低于对照组(P 0.05)，多柔比星组细胞存活率低于对照组(P 0.05)，氧化石墨烯组细胞存活率低于对照组(P 0.05)，氧化石墨烯负载多柔比星组细胞存活率明显低于氧化石墨烯组(P 0.05)，氧化石墨烯负载多柔比星组细胞存活率低于多柔比星组，但差异无统计学意义。多发性骨髓瘤细胞在经过氧化石墨烯负载多柔比星、多柔比星和氧化石墨烯处理后的细胞周期之间比较无明显差异，石墨烯负载多柔比星组细胞周期和对照组细胞周期无差异，多柔比星组细胞周期和对照组细胞周期无差异，氧化石墨烯组细胞周期和对照组细胞周期无差异。氧化石墨烯负载多柔比星组、多柔比星组、氧化石墨烯组细胞凋亡率和对照组比较差异显著，氧化石墨烯细胞凋亡率和对照组比较无差异，氧化石墨烯负载多柔比星组细胞凋亡率和多柔比星组比较无差异，氧化石墨烯负载多柔比星组和多柔比星组的细胞凋亡率均高于氧化石墨烯组和对照组(P 2 years of follow-up. Blood.2010;116(5):304924 Hjorth M,Hjertner ,Knudsen LM,et al.Thalidomide and dexamethasone vs. bortezomib and dexamethasone for melphalan refractory myeloma: a randomized study.Eur J Haematol. 2012;88(6): 485-49625 Mosieniak G,Sliwinska MA,Alster O,et al.Polyploidy Formation in Doxorubicin-Treated Cancer Cells Can Favor Escape from Senescence.Neoplasia. 2015; 17(12):882-893. 26 Wang LF,Su SW,Wang L.Tert-butylhydroquinone ameliorates doxorubicin-induced cardiotoxicity by activating Nrf2 and inducing the expression of its target genes.Am J Transl Res.2015;7(10):1724-1735. 27 Ge W,Yuan M,Ceylan AF,et al.Mitochondrial aldehyde dehydrogenase protects against doxorubicin cardiotoxicity through a transient receptor potential channel vanilloid 1-mediated mechanism.Biochim Biophys Acta.2015.pii:S0925-4439(15)00368-3. 28 Vyas D,Lopez-Hisijos N,Gandhi S,et al. Doxorubicin-Hyaluronan Conjugated Super-Paramagnetic Iron Oxide Nanoparticles (DOX-HA-SPION) Enhanced Cytoplasmic Uptake of Doxorubicin and Modulated Apoptosis, IL-6 Release and NF-kappaB Activity in Human MDA-MB-231 Breast Cancer Cells.J Nanosci Nanotechnol. 2015; 15(9): 6413-6422.29 朱晓峰,汪安友,蔡晓燕.脂质体多柔比星对初治多发性骨髓瘤疗效及安全性评估J.安徽医药, 2015,19(2): 371-373.30 高慧萍.多柔比星脂质体联合低剂量沙利度胺治疗多发性骨髓瘤的临床分析J.临床药物治疗杂志, 2015,13(5): 41-43.31 梁锦湄,朱旻,任浩洋.多柔比星脂质体制剂与非脂质体制剂的不良反应/事件评价J.中国新药杂志, 2013,22(9): 1100-1104.32 Biju V,Itoh T,Ishikawa M,et al.Delivering quantum dots to cells: bioconjugated quantum dots for targeted and nonspecific extracellular and intrac