miR175p通过靶向抑制MICB表达降低肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性.doc

miR175p通过靶向抑制MICB表达降低肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性 doi:10.3969/j.issn.1000鄄484X.2019.07.018miR鄄17鄄5p通过靶向抑制MICB表达降低肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性张志波摇杨兰钫摇李国平摇姚向庆摇(福建医科大学附属第一医院,福州350004)摇摇摇R392摇摇文献标志码摇A摇摇摇1000鄄484X (2019)07鄄0858鄄07作者简介:张志波,男,博士,副主任医师,主要从事肝胆胰外科临床与基础实验研究。 摘摇要摇目的:探讨miR鄄17鄄5p在HCC细胞系HepG2细胞对NK细胞介导的细胞毒性敏感性中的调控作用。 方法:使用含野生型MICB基因3忆UTR序列、突变型MICB基因3忆UTR序列、miR鄄17鄄5p mimic序列、miR鄄17鄄5p鄄NC序列、anti鄄miR鄄17鄄5p序列的质粒载体分别或共转染HCC细胞系HepG2,使用丙戊酸钠处理转染或未转染细胞。 应用荧光素酶活性测定检测miR鄄17鄄5p对MICB的调控作用。 应用实时荧光定量PCR检测细胞或组织中miR鄄17鄄5p及MICB mRNA表达情况,利用蛋白免疫印迹法检测MICB蛋白表达情况。 对比转染质粒后各组细胞中miR鄄17鄄5p和MICB mRNA及蛋白的表达情况,分析TargetScan预测和荧光素酶活性测定结果、miR鄄17鄄5p与MICB蛋白在HCC组织中的表达及与临床病理特征的关系、miR鄄17鄄5p与MICB蛋白在HCC组织中表达的相关性,并对比各组MICB蛋白表达和NK细胞介导的细胞毒性、丙戊酸钠各组NK细胞毒性。 结果:淤与miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,miR鄄17鄄5p鄄mimic组HepG2细胞中miR鄄17鄄5p表达水平较高,MICB mRNA和蛋白表达水平均较低(P0郾05);与anti鄄miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,anti鄄miR鄄17鄄5p组HepG2细胞中miR鄄17鄄5p表达水平均较低,MICB mRNA和蛋白表达水平均较高(P0郾05);与miR鄄17鄄5p鄄NC+MICB3忆UTR鄄Wt组相比,miR鄄17鄄5p鄄mimic+MICB3忆鄄UTR鄄Wt组荧光素酶活性较低(P0郾05)。 于与对应癌旁非肿瘤组织相比,miR鄄17鄄5p在HCC组织中的表达水平较高,而MICB蛋白表达水平较低(P0郾05)。 miR鄄17鄄5p和MICB蛋白的表达与肿瘤直径、远处转移、TNM分期、分化程度等临床病理特征有关(P0郾05)。 在HCC肿瘤组织中miR鄄17鄄5p与MICB蛋白表达水平呈明显负相关(P0郾05)。 盂与miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,miR鄄17鄄5p鄄mimic组NK细胞毒性、MICB蛋白表达水平均较低(P0郾05);与miR鄄17鄄5p鄄mimic+MICB3忆UTR鄄Mut组相比,miR鄄17鄄5p鄄mimic+MICB鄄3忆UTR鄄Wt共转染组中NK细胞毒性和MICB蛋白表达水平均较高(P0郾05);与anti鄄miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,anti鄄miR鄄17鄄5p组NK细胞毒性和MIBC蛋白表达均较高(P0郾05)。 榆与丙戊酸钠+miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,丙戊酸钠+miR鄄17鄄5p鄄mimic组细胞中MICB表达水平较低(P0郾05)。 在不同效靶比时,与Ctrl组相比,丙戊酸钠组NK细胞毒性较高(P0郾05)。 与丙戊酸钠+miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,丙戊酸钠+miR鄄17鄄5p鄄mimic组NK细胞毒性较低(P0郾05)。 结论:miR鄄17鄄5p通过靶向MICB降低HepG2细胞对NK细胞介导的细胞毒性敏感性,从而抑制NK细胞对肝癌细胞的毒性。 关键词摇肝细胞癌;HepG2细胞系;自然杀伤细胞;miR鄄17鄄5p;主要组织相容性复合物玉类链相关基因BmiR鄄17鄄5p reducingsensitivity of hepatoma cells to NK cells byinhibitingMICB expressionZHANGZhi鄄Bo,YANG Lan鄄Fang,LI Guo鄄Ping,YAO Xiang鄄Qing郾The FirstAffiliated Hospitalof FujianMedical U鄄niversity,Fuzhou350004,ChinaAbstract摇Objective:To investigatethe regulatoryeffect of miR鄄17鄄5p on NK cell鄄mediated cytotoxicityin HCCcell lineHepG2cells郾Methods:A plasmidvector containingthe wildtype MICB gene3忆UTR sequence,the mutantMICBgene3忆UTRsequence,the miR鄄17鄄5p mimicsequence,the miR鄄17鄄5p鄄NC sequence,the anti鄄miR鄄17鄄5p sequenceand theanti鄄miR鄄17鄄5p鄄NCsequence respectively,or co鄄transfected HCCcell lineHepG2郾Treatment oftransfected oruntransfected cellswith sodiumvalproate郾Real timefluorescence quantitativePCR wasused todetect the expressions of miR鄄17鄄5p and MICB mRNAin cellsortissues郾The expressionof MICB protein wasdetected byWestern blot郾The expressionsof miR鄄17鄄5p,MICB mRNA and protein in eachgroupafter transfectionwere pared郾The resultsof TargetScanprediction andluciferase activityassay wereanalyzed,as wellas theexpressionsof miR鄄17鄄5p andMICB proteinin HCC tissues and their relationshipswith clinicopathologicalcharacteristics,thecorrelation betweenthe expressionof miR鄄17鄄5p andMICB proteinin HCCtissues郾The MICB protein expressionand NKcell mediatedcytotoxicityin eachgroup werepared,as wellas the toxicity of NK cellsin eachgroup ofvalproate郾Results:淤Compared withmiR鄄17鄄5p鄄NC group,miR鄄17鄄5p鄄mimic group miR鄄17鄄5p expressionlevel washigher,MICB mRNAand protein expression levelswerelower(P0郾05)郾Compared withanti鄄miR鄄17鄄5p鄄NC group,the expressionof miR鄄17鄄5p in anti鄄miR鄄17鄄5p groupwas lower,and theexpressionof MICB mRNAandprotein washigher(P0郾05)郾The luciferaseactivity of miR鄄17鄄5p鄄mimic+MICB3忆鄄UTR鄄Wt group858中国免疫学杂志2019年第35卷was significantlylower thanthat ofmiR鄄17鄄5p鄄NC+MICB3忆UTR鄄Wt group(P0郾05)郾于Theexpression levelofmiR鄄17鄄5p in HCCtissueswas significantlyhigher thanthat inthe adjacentnon鄄tumor tissues,andthe expressionlevel of MICB proteinwas significantlylower(P0郾05)郾The expressionofmiR鄄17鄄5p andMICB proteinwas correlatedwith tumordiameter,distant metastasis,TNM stage,differentiation andother clinicopathologicalfeatures(P0郾05)郾There wasa significantnegativecorrelation betweenmiR鄄17鄄5p andMICB proteinexpression in HCC tumortissues(P0郾05)郾盂Compared withgroupmiR鄄17鄄5p鄄NC,the NKcytotoxicity andthe levelof MICBproteinexpressionin groupmiR鄄17鄄5p鄄mimic werelower(P0郾05)郾Compared withthe miR鄄17鄄5p鄄mimic+MICB3忆UTR鄄Mut group,thetoxicity of NK cells andtheexpressionof MICBproteininthe miR鄄17鄄5p鄄mimic+MICB鄄3忆UTR鄄Wt cotransfection groupwere higher(P0郾05)郾Compared withgroup anti鄄miR鄄17鄄5p鄄NC,the NKcytotoxicity andMIBC proteinexpressioninanti鄄miR鄄17鄄5p groupwere higher(P0郾05)郾榆Compared withsodium valproate+miR鄄17鄄5p鄄NC group,theexpressionlevelofMICB in valproate+miR鄄17鄄5p鄄mimic groupwas lower(P0郾05)郾Compared withthe controlgroup,the NKcytotoxicity ofsodium valproate washigher atdifferent targetratios(P0郾05)郾Compared withthe sodium valproate+miR鄄17鄄5p鄄NC group,the NKcy鄄totoxicity ofsodium valproate+miR鄄17鄄5p鄄mimic groupwas significantlylower(P0郾05)。 肝癌、癌旁组织和正常肝组织的获取均经受试者知情同意,并签署知情同意书。 研究经本院伦理委员会批准。 1郾2摇方法1郾2郾1摇细胞培养摇对NK细胞毒性敏感的人肝细胞癌HepG2细胞系购自中国科学院细胞库,冻存在本实验室,以进行后续的复苏,待后续实验使用。 将细胞系维持在含有10%胎牛血清(FBS,Life Tech鄄nologies),100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的958张志波等摇miR鄄17鄄5p通过靶向抑制MICB表达降低肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性摇第7期DMEM培养基(Sigma鄄Aldrich公司)中,置于37益5%CO2的潮湿培养箱中培养。 依赖于NKG2D受体的自然杀伤细胞NK鄄92MI细胞系购自中国科学院细胞库,置于含200U/ml重组人IL鄄 2、0郾1mmol/L巯基乙醇、12郾5%马血清和10%FBS的琢鄄MEM培养基中培养。 1郾2郾2摇瞬时转染和处理摇构建含野生型MICB基因3忆UTR序列和突变型MICB基因3忆UTR序列的pCHECK2鄄MICB鄄3忆UTR鄄Wt和pCHECK2鄄MICB鄄3忆UTR鄄Mut的荧光素酶报告基因表达载体。 miR鄄17鄄5p相关表达质粒包括:miR鄄17鄄5p mimic及其阴性对照miR鄄17鄄5p鄄NC、anti鄄miR鄄17鄄5p及其阴性对照anti鄄miR鄄17鄄5p鄄NC质粒购自Genecopoeia公司。 实验一:根据Lipofectamine2000(Invitrogen)制造商说明书,将miR鄄17鄄5p mimic、anti鄄miR鄄17鄄5p及其相应阴性对照质粒分别转染至HepG2细胞系。 转染48h后,收集细胞进行Western blot或qRT鄄PCR分析确定转染效率。 实验二:根据Lipofectamine2000制造商说明书,将miR鄄17鄄5p mimic、anti鄄miR鄄17鄄5p及其相应阴性对照质粒及MICB鄄3忆UTR鄄Wt、MICB鄄3忆UTR鄄Mut质粒共转染至HepG2细胞中。 实验三:根据制造商说明书将miR鄄17鄄5pmimic、miR鄄17鄄5p鄄NC转染至HepG2细胞中培养24h后,在培养体系中加入1mmol/L丙戊酸钠(Sigma鄄Aldrich)孵育24h,再进行后续实验。 1郾2郾3摇荧光素酶报告基因测定摇分别用miR鄄17鄄5pmimic、anti鄄miR鄄17鄄5p及其相应阴性对照质粒与转染MICB鄄wt或MICB鄄mut荧光素酶报告基因表达载体的HepG2细胞系进行共转染。 转染48h后收集细胞,使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega)进行分析。 使用GloMax荧光读数器(Promega)检测荧光素酶活性。 共转染海肾萤光素酶组成型表达的pCHECK鄄2载体作为内部对照。 1郾2郾4摇NK细胞介导的细胞毒性测定摇采用CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega)评估NK鄄92MI介导的细胞毒性。 以质粒转染或未转染的HepG2细胞作为靶细胞,将NK鄄92MI细胞作为效应细胞,将靶细胞以1伊104个细胞/孔至96孔板上,分别以8颐 1、4颐 1、2颐1的效靶比,将NK鄄92MI细胞接种至HepG2细胞系中,于37益下共孵育4h后,收集上清液,于490nm处检测乳酸脱氢酶(LDH)活性。 LDH是细胞裂解时释放的稳定胞质溶酶。 1郾2郾5摇实时荧光定量PCR(qRT鄄PCR)摇使用TRIzol试剂(Invitrogen)从细胞和组织中提取总RNA。 使用Reverse TranscriptionKit(TaKaRa)将RNA逆转录为cDNA。 使用SYBR Green(TaKaRa)进行实时PCR分析。 以茁鄄Actin或U6作为内参。 利用ABI7500系统(Applied Biosystems)进行qRT鄄PCR反应。 分别以茁鄄actin和U6作为内参,用2-驻驻Ct法计算miR鄄17鄄5p和MICB相对表达水平。 qRT鄄PCR反应条件:95益45s,56益30s,72益3min,共40个循环。 引物设计如下:MICB:forward5忆鄄ACCT鄄GGCTATGAACGTCACA鄄3忆,reverse5忆鄄CCCTCTGAG鄄ACCTCGCTGCA鄄3忆;miR鄄17鄄5p:5忆鄄ACTACCTGCACTG鄄TAAGCACTTTG鄄3忆;茁鄄actin:forward5忆鄄CCACGAAAC鄄TACCTTCAACTC鄄3忆,reverse5忆鄄TCATACTCCTGCT鄄GCTTGCTGATCC鄄3忆;U6:5忆鄄CAAATTCGTGAAGCGT鄄TCCATAT鄄3忆。 1郾2郾6摇蛋白免疫印迹摇使用补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和苯甲基磺酰氟尿苷(Roche)的哺乳动物蛋白质提取试剂RIPA(Beyotime)裂解细胞。 通过10%SDS鄄PAGE分离50滋g蛋白质提取物,转移至0郾22mm硝酸纤维素膜(Sigma)中,并与特异性抗体一起孵育。 使用Quantity One软件(LifeTechnologies)评估相对蛋白表达水平。 MICB和茁鄄actin抗体购自Abcam。 1郾2郾7摇丙戊酸钠各组干预及NK细胞介导的细胞毒性测定摇设置对照组(Ctrl组,HepG2细胞培养24h)、丙戊酸钠组(HepG2细胞培养24h后加入1mmol/L丙戊酸钠)、丙戊酸钠+miR鄄17鄄5p鄄NC组(将miR鄄17鄄5p鄄NC转染至HepG2细胞培养24h后加入1mmol/L丙戊酸钠)、丙戊酸钠+miR鄄17鄄5pmimic组(将miR鄄17鄄5p mimic转染至HepG2细胞培养24h后加入1mmol/L丙戊酸钠),均孵育24h后参照1郾2郾4方法测定NK细胞介导的细胞毒性。 1郾2郾8摇观察指标摇淤对比转染质粒后各组细胞中miR鄄17鄄5p和MICBmRNA及蛋白的表达情况;于分析TargetScan预测和荧光素酶活性测定结果;盂分析miR鄄17鄄5p与MICB蛋白在HCC组织中的表达及与临床病理特征的关系;榆分析miR鄄17鄄5p与MICB蛋白在HCC组织中表达的相关性;虞对比各组MICB蛋白表达和NK细胞介导的细胞毒性;愚对比丙戊酸钠各组NK细胞毒性。 1郾3摇统计学处理摇本研究所有数据均采用用统计学软件SPSS21郾0进行分析。 计量资料采用x依s进行描述,两组间比较行t检验,多组间比较行F检验,采用双变量相关分析法进行相关性分析,当P0郾05时,差异具有统计学意义。 068中国免疫学杂志2019年第35卷2摇结果2郾1摇转染质粒后各组细胞中miR鄄17鄄5p和MICB的表达情况摇如图1A所示,与miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,miR鄄17鄄5p鄄mimic组miR鄄17鄄5p表达水平较高,差异有统计学意义(P0郾05);与anti鄄miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,anti鄄miR鄄17鄄5p组miR鄄17鄄5p表达水平均较低,差异有统计学意义(P0郾05)。 如图1B、C所示,与miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,miR鄄17鄄5pmimic组HepG2细胞中,MICB mRNA和蛋白表达水平均较低,差异均有统计学意义(P0郾05)。 与anti鄄miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,anti鄄miR鄄17鄄图1摇转染质粒后各组细胞中miR鄄17鄄5p和MICB的表达情况Fig.1摇Expression ofmiR鄄17鄄5p andMICB ineach groupafterplasmid transfectionNote:Compared withBlank group,*郾P0郾05;pared withmiR鄄17鄄5p鄄NC group,#郾P0郾05;pared withanti鄄miR鄄17鄄5p鄄NCgroup,吟郾P0郾05郾图2摇miR鄄17鄄5p通过MICB3忆UTR内的结合位点下调MICB基因表达Fig.2摇miR鄄17鄄5p down鄄regulates MICBgene expressionthroughbinding sitewithin MICB3忆UTRNote:*郾P0郾05郾5p组HepG2细胞系中,MICB mRNA和蛋白表达水平均较高,差异均有统计学意义(P0郾05)。 2郾2摇miR鄄17鄄5p通过MICB3忆UTR内的结合位点下调MICB基因表达摇根据TargetScan预测(图2A),在MICB mRNA的3忆鄄UTR中存在miR鄄17鄄5p的靶位点。 利用荧光素酶活性测定发现(图2B),与miR鄄17鄄5p鄄NC+MICB3忆UTR鄄Wt组相比,miR鄄17鄄5p鄄mimic+MICB3忆鄄UTR鄄Wt组荧光素酶活性较低(P0郾05)。 而miR鄄17鄄5p鄄NC+MICB3忆UTR鄄Mut组与miR鄄17鄄mimic+MICB3忆鄄UTR鄄Mut组的荧光素酶活性差异无统计学意义。 2郾3摇miR鄄17鄄5p与MICB蛋白在HCC组织中的表达及与临床病理特征的关系摇与正常组织和对应癌旁非肿瘤组织相比,miR鄄17鄄5p在HCC组织中的表达水平较高(图3A),而MICB蛋白表达水平较低(图3B),差异均有统计学意义(P0郾05)。 肿瘤直径5cm时,miR鄄17鄄5p表达水平显著高于肿瘤直径5cm,差异有统计学意义(P0郾05)。 与淋巴结无转移患者相比,当出现淋巴结转移时HCC肿瘤组织中miR鄄17鄄5p的表达较高,而MICB蛋白表达水平较低,差异均有统计学意义(P0郾05)。 TNM芋/郁期患者miR鄄17鄄5p表达水平显著高于TNM玉/域期患者,而MICB蛋白表达水平显著低于TNM玉/芋期患者,差异均有统计学意义(P0郾05)。 随肿瘤分化程度的降低,miR鄄17鄄5p表达水平逐渐增加,而MICB蛋白表达水平逐渐降低,差异均有统计学意义(P0郾05)。 2郾4摇miR鄄17鄄5p与MICB蛋白在HCC组织中表达的相关性摇在HCC肿瘤组织中随miR鄄17鄄5p表达水平的增加,MICB蛋白表达水平逐渐降低。 相关性分析结果显示,二者呈明显负相关(P0郾05),见图4。 图3摇miR鄄17鄄5p与MICB在HCC组织中的表达情况Fig.3摇MICB expressioninHCCtissuesNote:*郾P0郾05;#郾P0郾05郾168张志波等摇miR鄄17鄄5p通过靶向抑制MICB表达降低肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性摇第7期2郾5摇miR鄄17鄄5p通过靶向MICB减弱NK细胞介导的细胞毒性摇不同效靶比时,在HepG2细胞中,与miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,miR鄄17鄄5p鄄mimic组NK细胞毒性较低,差异有统计学意义(P0郾05)。 与miR鄄17鄄5p鄄mimic+MICB3忆UTR鄄Mut组相比,miR鄄17鄄5p鄄mimic+MICB鄄3忆UTR鄄Wt共转染组中NK细胞毒性较高,差异有统计学意义(P0郾05,图5A)。 免疫组化结果显示,与miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,miR鄄17鄄5p鄄mimic组HepG2细胞中MICB蛋白表达水平较低,差异有统计学意义(P0郾05)。 与miR鄄17鄄5p鄄mimic+MICB3忆UTR鄄Mut组相比,miR鄄17鄄5p鄄mimic+MICB3忆UTR鄄Wt组中MICB蛋白表达水平较高,差异有统计学意义(P0郾05,图5B)。 另外,与anti鄄miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,anti鄄miR鄄17鄄5p组NK细胞毒性较高,图4摇HCC组织中miR鄄17鄄5p和MICB蛋白表达水平的相关性分析Fig.4摇Correlation analysisofmiR鄄17鄄5pandMICBprotein expressioninHCCtissues差异有统计学意义(P0郾05,图5C)。 免疫细化结果显示,与anti鄄miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,anti鄄miR鄄17鄄5p组MICB蛋白表达水平较高,差异有统计学意义(P0郾05,图5D)。 2郾6摇miR鄄17鄄5p的上调抑制丙戊酸钠对NK细胞毒性的增强摇与Ctrl组相比,丙戊酸钠组MICB表达水平较高,差异有统计学意义(P0郾05)。 与丙戊酸钠+miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,丙戊酸钠+miR鄄17鄄5p鄄mimic组细胞中MICB表达水平较低,差异有统计学意义(P0郾05,图6A)。 进一步研究HDAC抑制剂图5摇miR鄄17鄄5p通过靶向MICB减弱NK细胞介导的细胞毒性Fig.5摇miR鄄17鄄5p attenuatesNKcell鄄mediated cytotoxicitybytargeting MICBNote:*郾P0郾05郾表1摇miR鄄17鄄5p与MICB蛋白与HCC患者临床病理特征的关系(x依s)Tab.1摇Relationship betweenmiR鄄17鄄5p,MICBproteinand clinicopathologicalfeatures inpatients withHCC(x依s)Features nmiR鄄17鄄5p t/F PMICBproteint/F PAge50years231郾88依0郾120郾9920郾3250郾70依0郾041郾8830郾065逸50years371郾91依0郾110郾68依0郾04Sex Male241郾90依0郾110郾0001郾0000郾69依0郾040郾0001郾000Female361郾90依0郾100郾69依0郾03Tumor diameter5cm412郾34依0郾150郾52依0郾03Distant metastasisYes351郾62依0郾1021郾6450郾0000郾83依0郾0721郾8400郾000No252郾29依0郾140郾49依0郾04Differentiated degreeHigh181郾15依0郾08414郾3660郾0001郾08依0郾09637郾4150郾000Middle171郾93依0郾150郾62依0郾03Low252郾42依0郾170郾45依0郾04TNM stages玉/域241郾17依0郾0532郾3000郾0001郾00依0郾0644郾4500郾000芋/郁362郾39依0郾180郾48依0郾03268中国免疫学杂志2019年第35卷图6摇miR鄄17的上调抑制丙戊酸钠对NK细胞毒性的增强Fig.6摇Upregulation ofmiR鄄17inhibits enhancedcytotoxi鄄cityofsodiumvalproateonNKcellsNote:*郾P0郾05郾对NK细胞毒性的增强作用是否与miR鄄17表达调控有关。 在不同效靶比下,与Ctrl组相比,丙戊酸钠组NK细胞毒性较高,差异有统计学意义(P0郾05)。 与丙戊酸钠+miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,丙戊酸钠+miR鄄17鄄5p鄄mimic组NK细胞毒性较低,差异有统计学意义(P0郾05,图6B)。 3摇讨论微小RNA(miRNA)作为一种非编码RNA在肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和免疫逃逸等多种生物进程中具有重要作用9。 已有研究证实,miR鄄17鄄5p在结直肠癌、胃癌、肝癌等多种癌症中的表达失调10,11。 本研究数据发现,在HCC肿瘤组织中,miR鄄17表达水平显著升高,且高miR鄄17鄄5p水平与TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度有关,提示miR鄄17高表达促进肿瘤发生发展。 然而miR鄄17鄄5p在肝癌疾病进展中的机制尚不清楚。 NK细胞作为体内重要的淋巴细胞之一,在天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用。 NK细胞的功能受其表面活化性或抑制性受体的调节。 活化性或抑制性受体通过介导NK细胞的不同识别模式,传递活化或抑制信号,在抗感染、抗肿瘤及免疫调节等方面发挥重要免疫功能12。 NKG2D是NK细胞最主要的活化性受体之一,能特异地与肿瘤细胞表面的相应配体MICB结合而使NK细胞活化,从而激活NK细胞对肿瘤细胞的毒性作用,在肿瘤免疫监视中发挥重要作用。 当肿瘤细胞表面MICB发生结构改变或表达被抑制时,导致NK细胞无法活化,使其对肿瘤细胞的毒性作用被抑制,无法清除肿瘤细胞,从而引起肿瘤免疫逃逸的发生13。 肿瘤细胞存在多种机制逃避NK细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用14。 在肝脏恶性肿瘤的微环境中,肿瘤抗原、微环境中的细胞因子以及其他免疫细胞的相互作用均可逃避NKG2D介导的识别,导致NK细胞无法活化、清除肿瘤细胞能力被抑制,从而参与肿瘤细胞免疫逃逸发生。 近来研究发现15,多种miRNA参与NK细胞介导的抗肿瘤免疫逃逸调节过程。 临床证据证实,miRNAs通过抑制NKG2D配体MICB的表达,参与NK细胞的肿瘤免疫逃逸16,17。 miRNA作为多基因多靶点调控的上游调控因子,能够通过与目的靶基因mRNA的碱基特异性配对,引起目的靶基因mRNA降解或抑制其翻译,从而在转录后水平调控目标基因的表达。 miRNAs在生物进程中的调控作用是十分复杂,一个miRNA能够调控多个目标基因,且同一个目标基因可同时受多个miRNA调控。 生物学预测发现,在MICB mRNA的3忆鄄UTR中存在miR鄄17鄄5p的靶位点。 本研究进一步采用荧光素酶报告基因测定证实,miR鄄17鄄5p是靶向MICB的调节分子之一,能够通过与MICBmRNA3忆UTR内的位点结合,下调MICB基因表达,miR鄄17鄄5p过表达能够显著抑制HepG2细胞中内源性MICB的表达。 另外,在HCC肿瘤组织中,miR鄄17鄄5p与MICB表达呈显著负相关,进一步证实MICB是肝细胞癌中miR鄄17的直接靶标之一。 已报道包括miR鄄20a、miR鄄 93、miR鄄106b、miR鄄302c、miR鄄520c等多种miRNAs能够靶向调控MICBmRNA的3忆鄄UTRs调节MICB的蛋白表达水平18。 研究发现,miR鄄10b通过靶向MICB mRNA的3忆鄄UTR,使Hela、PC鄄 3、DU145等多种肿瘤细胞表面MICB表达被抑制,导致NKG2D识别减少,从而减少NK细胞对肿瘤细胞的毒性作用19。 本研究发现,NK细胞毒性测定和蛋白免疫印迹结果显示,在不同效靶比时,miR鄄17鄄5p过表达均能够降低HepG2细胞系中NK细胞介导的细胞毒性,同时能够抑制MICB表达,而抑制miR鄄17鄄5p表达则能够增加NK细胞介导的细胞毒性,同时促进MICB表达,提示miR鄄17鄄5p能够调控HepG2细胞对NK细胞毒性的敏感性,且这一作用与其对MICB的靶向调控有关。 进一步进行研究发现,与Ctrl组比较,丙戊酸钠组细胞中MICB蛋白表达水平较高,NK细胞毒性也较高;与丙戊酸钠+miR鄄17鄄5p鄄NC组相比,丙戊酸钠+miR鄄17鄄5p鄄mimic组细胞中MICB蛋白表达水平较低,NK细胞毒性也较低,miR鄄17鄄5p的上调可抑制MIBC蛋白的表达,从而抑制丙戊酸钠对NK介导的细胞毒性。 这些结果表明,miR鄄17鄄5p过表368张志波等摇miR鄄17鄄5p通过靶向抑制MICB表达降低肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性摇第7期达通过抑制细胞表面MICB表达,从而降低HepG2细胞对依赖于NKG2D配体的NK细胞所介导的细胞毒性敏感性,进而抑制NK细胞对肝癌细胞的免疫清除,保护HCC细胞免受NK细胞攻击。 已证实HDAC抑制剂如丁酸钠和丙戊酸钠能够通过上调NKG2D配体MICB表达,增强肿瘤细胞对NK细胞介导的细胞毒性敏感性20。 为进一步探讨miR鄄17鄄5p在调节HepG2细胞对NK细胞毒性敏感性中的作用,本研究检查了miR鄄17鄄5p是否参与HDAC抑制剂丙戊酸钠介导的NK细胞毒性增强过程。 结果发现,丙戊酸钠处理能够显著抑制HepG2细胞中miR鄄17鄄5p的表达,增加MICB的表达,从而增强NK细胞毒性。 而miR鄄17过表达能够抑制丙戊酸钠诱导MICB表达的增强,使HepG2细胞对NK细胞介导的细胞毒性敏感性降低。 这些数据表明,miR鄄17鄄5p下调是HDAC抑制剂介导NK细胞毒性增强的可能机制之一。 提示,靶向miR鄄17鄄5p可能成为改善HCC中基于NK细胞抗肿瘤疗法的新策略。 综上所述,miR鄄17鄄5p通过靶向MICB降低HepG2细胞对NK细胞介导的细胞毒性敏感性,导致NK细胞的抗肿瘤免疫活性被抑制,从而抑制NK细胞对肝癌细胞的免疫清除,保护肝癌细胞免受NK细胞攻击,参与肿瘤细胞免疫逃逸过程。 由于本研究所涉及的仪器、试剂较多,经费有限,且工作量较大,因而只探讨了miR鄄17鄄5p对MICBmRNA及蛋白表达的影响及其影响人肝癌细胞株HepG2对NK细胞介导的细胞毒性的机制,并未涉及对MICA和ULBP1鄄4的影响研究,而miR鄄17鄄5p是否能通过调控MICA及ULBP1鄄4影响人肝癌细胞株HepG2对NK细胞介导的细胞毒性的敏感性仍需进一步实验研究,可作为下一步工作的重点和方向。 参考文献:1摇李摇博,王春凤,杨桂连郾自然杀伤细胞在机体免疫中的作用及机制研究进展J.中国免疫学杂志,xx,35 (5):719鄄721郾Li B,Wang CF,Yang GL郾Research progresson therole andmechanismof naturalkiller cellsin bodyimmunityJ.Chin JImmunol,xx,35 (5):719鄄721郾2摇王莉新,吴文斌郾NK细胞的免疫监视作用及肿瘤免疫逃逸J.细胞与分子免疫学杂志,xx,33 (3):418鄄422郾Wang LX,Wu WB郾Immune surveillanceof NKcells andtumorimmune escapeJ.Chin JCell MolImmunol,xx,33 (3):418鄄422郾3摇Schmiedel D,Tai J,Yamin R,et al.The RNAbinding proteinIMP3facilitates tumorimmune escapeby downregulatingthestress鄄induced ligandsULPB2andMICBJ.Elife,xx,16 (5):e13426郾4摇Zhang C,Wang Y,Zhou Z,et al.Sodium butyrateupregulatesexpression of NKG2D ligandMICA/BinHeLa andHepG2celllines andincreases theirsusceptibility toNK lysisJ.CancerImmunol ImmunotherapyCii,xx,58 (8):1275鄄1285郾5摇Xie J,Liu M,Li Y,et al.Ovarian tumor鄄associated microRNA鄄20adecreases naturalkillercellcytotoxicity bydownregulating MICA/B expressionJ.Cell MolImmunol,xx,11 (5):495鄄502郾6摇Wu J,Zhang XJ,Shi KQ,et al.Hepatitis Bsurface antigeninhibitsMICA andMICB expressionvia inductionof cellularmiRNAs inhepatocellularcarcinoma cellsJ.Carcinogenesis,xx,35 (1):155鄄163郾7摇Bonauer A,Dimmeler S郾The microRNA鄄1792cluster:Still amiRacle?J.Cell Cycle,xx,8 (23):3866鄄3873郾8摇中国抗癌协会肝癌专业委员会郾原发性肝癌的临床诊断与分期标准J.中华肝脏病杂志,xx,9 (6):324鄄324郾Committee ofliver cancer,Chinese anti鄄cancer association郾Criteriafor clinicaldiagnosis andstaging ofprimary livercancerJ.Chin JHepatol,xx,9 (6):324鄄324郾9摇Svoronos AA,Engelman DM,Slack FJ郾OniR ortumorsuppressor?the duplicityof MicroRNAsin cancerJ.CancerRes,xx,76 (13):3666鄄3670郾10摇陈摇昊,周摇鹏,徐晶晶,等郾miR鄄17鄄92基因簇增强前列腺癌DU145细胞的迁移、侵袭能力及对顺铂的耐药性J.中国癌症杂志,xx,27 (2):95鄄101郾Chen H,Zhou P,Xu JJ,et al.miR鄄17鄄92cluster increasesthemigration andinvasion abilitiesof DU145prostate cancercellsand enhancesthe cisplatinresistanceJ.China Oncolog,xx,27 (2):95鄄101郾11摇Fuziwara CS,Kimura ET郾Insights intoRegulation of the miR鄄17鄄92Cluster ofmiRNAs i