CN101780190A一种含龙血竭提取物的药物制剂的质量控制方法

CN101780190A一种含龙血竭提取物的药物制剂的质量控制方法 (10)申请公布号101780190A (43)申请公布日xx.07.21101780190A*101780190A* (21)申请号xx10009644.6 (22)申请日xx.01.20A61K36/889(xx.01)G01N21/33(xx.01)G01N30/36(xx.01)A61P37/02(xx.01) (71)申请人江苏康缘药业股份有限公司地址22xx江苏省连云港市经济技术开发区泰山北路58号 (72)发明人萧伟屠鹏飞王振中刘涛徐玉玲毕宇安邹艳萍章晨峰吴云孙永城 (54)发明名称一种含龙血竭提取物的药物制剂的质量控制方法 (57)摘要本发明提供了一种含龙血竭药材提取物的药物制剂的质量控制方法，该方法可以采用以下四种质量控制方法的任意一种或几种 (1)采用紫外-可见分光光度法对7，4-二羟基黄酮进行含量测定； (2)采用高效液相色谱法对龙血素B进行含量测定； (3)采用高效液相色谱法进行指纹图谱检测； (4)采用高效液相色谱法，结合溶出度测定法进行溶出度检测。 本发明提供的质量控制方法，准确，精密，稳定性好，能够有效地控制含龙血竭药材提取物的药物制剂的质量。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书5页说明书24页附图4页*101780190A*101780190A101780190A101780192A1/5页21.一种含有龙血竭药材提取物的药物制剂的质量控制方法，其特征在于采用以下方法中的任意一种或几种 (1)采用紫外-可见分光光度法检测，药物制剂每单位剂量含总酚以7，4-二羟基黄酮计，不得低于165.0mg； (2)采用高效液相色谱法检测，药物制剂每单位剂量含龙血素B不得低于1.50mg； (3)采用高效液相色谱指纹图谱检测，药物制剂的标准指纹图谱有8个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.400.60，2号峰0.420.65，3号峰0.550.78，4号峰0.600.85，5号峰0.700.95，6号峰0.821.15，S号峰1.00，7号峰1.011.30，其中S号峰为龙血素B的色谱峰； (4)采用高效液相色谱法，结合溶出度测定法检测，本品45分钟时的溶出量以龙血素B计，不得少于75。 2.如权利要求1所述总酚的含量测定方法，其特征在于a.对照品溶液的制备取7，4-二羟基黄酮，加无水乙醇制成对照品溶液；b.标准曲线的制备量取不同剂量的对照品溶液，加无水乙醇，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，摇匀，再加盐酸；照紫外-可见分光光度法，测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.供试品溶液制备与测定法取本品，加无水乙醇溶解；取聚酰胺，加入上述溶液10ml，挥干乙醇，装入层析柱，用1030的乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇洗脱，收集洗脱液；量取该溶液置棕色量瓶中，加无水乙醇，量取该溶液置棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，再加盐酸，摇匀，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。 3.如权利要求2所述总酚的含量测定方法，其特征在于a.对照品溶液的制备取7，4-二羟基黄酮适量，加无水乙醇制成1ml中含2040g的溶液，即得；b.标准曲线的制备量取对照品溶液0ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液1ml，三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，以第一份为空白；照紫外-可见分光光度法，在750800nm处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.供试品溶液制备与测定法取本品，研细，约取515mg，置25ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取聚酰胺13g，置蒸发皿中，加入上述溶液10ml，拌匀，置热水浴上挥干乙醇，装入层析柱，用1030的乙醇4060ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇80120ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，量取该溶液5ml，置25ml棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液1ml，三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，在750800nm处测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。 4.如权利要求3所述含量测定方法，其特征在于a.对照品溶液的制备取7，4-二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙权利要求书101780190A101780192A2/5页3醇制成每1ml中含32g的溶液，即得；b.标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6的铁氰化钾溶液1ml，0.9三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典xx年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在780nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；c.供试品溶液制备与测定法取本品12mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置70水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用20的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6的铁氰化钾溶液1ml，0.9三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；d.测定结果本品每单位剂量含总酚以7，4-二羟基黄酮计，不得低于165.0mg。 5.如权利要求1所述龙血素B的含量测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1冰醋酸水溶液为流动相；b.对照品溶液的制备称取龙血素B对照品，加甲醇制成对照品溶液；c.供试品溶液的制备取本品，研细，称定，置烧瓶中，加乙醚，加热回流，滤过，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解，摇匀，再精密吸取少量至量瓶中，用甲醇稀释，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。 6.如权利要求5所述龙血素B的含量测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1冰醋酸水溶液比例为30505070为流动相，流速0.51.5ml/min，检测波长为250300nm；b.对照品溶液的制备称取干燥的龙血素B对照品适量，加甲醇制成1ml含40g的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取本品，研细，取约0.10.3g，称定，置烧瓶中，加乙醚，置水浴锅表面，加热回流，滤过，用乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各520l，注入液相色谱仪，测定，即得。 7.如权利要求6所述的含量测定方法，其特征在于照中国药典xx年版一部附录VI D的高效液相色谱法测定a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1冰醋酸水溶液比例为4060为流动相，流速1.0ml/min，检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰权利要求书101780190A101780192A3/5页4计，应不低于10000；b.对照品溶液的制备精密称取60减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含40g的溶液，作为对照品溶液；c.供试品溶液的制备取本品0.2g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置60水浴锅表面，加热回流30分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10l，注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果本品每单位剂量含龙血素B不得低于1.50mg。 8.如权利要求1所述指纹图谱测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A0.1的磷酸与B乙腈，梯度洗脱；b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品，加甲醇制成参照物溶液；c.供试品溶液的制备取本品，研细，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液，滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得。 9.如权利要求8所述指纹图谱测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A0.1的磷酸与流动相B乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70线性下降至20，流动相B从30线性上升至80，5060min时，流动相A保持在20，流动相B保持在80；流速为0.41.0ml/min，检测波长为250300nm；b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含50g的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取本品内容物，研细，取约0.30.8g，置锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各520l，分别注入液相色谱仪，测定，即得。 10.如权利要求9所述的指纹图谱的应用，其特征为参照中国药典xx版一部附录VID的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A0.1的磷酸与B乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70线性下降至20，流动相B从30线性上升至80，5060min时，流动相A保持在20，流动相B保持在80；流速为0.7ml/min，检测波长为280nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000；b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加50甲醇制成每1ml含50g的溶液，即得参照物溶液；c.供试品溶液的制备取本品内容物，研细，取约0.5g，置锥形瓶中，精密加入50甲权利要求书101780190A101780192A4/5页5醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45m的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10l，分别注入液相色谱仪，测定，即得；e.测定结果供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度应大于0.80。 11.如权利要求1所述溶出度测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法，结合溶出度测定法进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1磷酸水溶液为流动相；b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成参照物溶液，c.供试品溶液的制备取本品，以十二烷基硫酸钠与氢氧化钠溶液为溶剂，旋转使溶出，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；d.测定法精密量取供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。 12.如权利要求11所述指纹图谱测定方法，其特征在于参照高效液相色谱法，结合溶出度测定法进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1磷酸水溶液比例为50554550为流动相；检测波长为275280nm；b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含1020g的溶液；c.供试品溶液的制备按照中国药典xx年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法，取本品，以0.1十二烷基硫酸钠0.025mol/L的氢氧化钠溶液100ml为溶剂，转速为每分钟6585转，经45分钟时，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；d.测定法精密量取供试品溶液520l，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。 13.如权利要求12所述指纹图谱测定方法，其特征在于参照中国药典xx年版一部附录VI D的高效液相色谱法，结合中国药典xx年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法进行测定a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1磷酸水溶液比例为5347为流动相；检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000；b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含15g的溶液，c.供试品溶液的制备按照中国药典xx年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法，取本品，以0.1十二烷基硫酸钠0.025mol/L的氢氧化钠溶液100ml为溶剂，转速为每分钟75转，经45分钟时，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；d.测定法精密量取供试品溶液10l，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；e.测定结果按外标法以峰面积计算每单位剂量的溶出量，本品45分钟时的溶出量以龙血素B计，不得少于75。 14.如权利要求113所述的龙血竭药材提取物的药物制剂，其特征在于该药物制剂权利要求书101780190A101780192A5/5页6的剂型为包括但不仅限于胶囊剂、片剂、丸剂、软胶囊的常规药物制剂。 权利要求书101780190A101780192A1/24页7一种含龙血竭提取物的药物制剂的质量控制方法技术领域0001本发明属于中药分析领域，涉及一种含中药材提取物药物制剂的质量控制方法，特别涉及一种含龙血竭药材提取物的药物制剂的质量控制方法。 技术背景0002龙血竭为百合科剑叶龙血树Dranaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen的含脂木材经提取得到的树脂。 主产于广西、云南。 据本草纲目记载，性温、平，味甘、咸，无毒，入血分，归肺、脾、肾三经，具有活血化瘀、消肿止痛、收敛止血，软坚散结、生肌敛疮等显著功效。 现代医学研究证实，龙血竭具有改善机体微循环、调整机体新陈代谢、改善机体免疫功能等作用。 0003含龙血竭药材提取物的药物制剂(以下简称“龙血通药物制剂”)的处方为龙血竭提取物300g，制备方法为取淀粉加沸水搅拌制成20淀粉浆，将淀粉浆加入龙血竭提取物中，制成颗粒，干燥，装入胶囊或压片或制丸，制成1000粒(片)，即得；本品每粒(片)装0.33g。 0004本品为红棕色至红褐色颗粒；气微，味淡。 龙血通药物制剂具有活血化瘀，通脉舒络的功效，用于中风血瘀证，证见半身不遂，口舌歪斜，言语謇涩或不语，偏身麻木，头晕目眩，舌质紫黯或有瘀点瘀斑，苔薄白或白腻，脉弦或涩；本品口服，一次2粒，一日3次。 0005本发明的申请人于xx年9月12日申请了名称为一种龙血竭总黄酮制剂的制备方法及其质量控制方法的专利，专利申请号为02129687.1，此件专利提供了龙血竭总黄酮制剂的质量控制方法，包括对龙血素B进行薄层鉴别，采用分光光度法对龙血素B和7，4-二羟基黄酮进行含量测定，采用高效液相色谱法对7，4-二羟基黄酮进行含量测定，这些方法可以对龙血通药物制剂进行质量控制，但是检测的项目较少，而且薄层鉴别和分光光度法的准确度不够好，本发明在原有技术的基础上增加了对总酚的含量测定，增加了采用较为准确的高效液相色谱法对龙血素B进行含量测定的方法，不仅如此，本发明还提供了一种龙血通药物制剂溶出度的测定方法，此外，本发明还提供了龙血通药物制剂的标准指纹图谱与该图谱的应用方法，可以更加有效地控制龙血通药物制剂的质量。 发明内容0006本发明的目的是提供一种对龙血通药物制剂中总酚和龙血素B两种指标成分进行含量测定的方法。 0007本发明的目的还在于提供了龙血通药物制剂的标准指纹图谱，并提供了该图谱的应用方法。 0008本发明的目的还在于提供了龙血通药物制剂的溶出度测定方法。 0009上述的龙血通药物制剂，其特征在于药物剂型为包括但不仅限于胶囊剂、片剂、丸剂、软胶囊的常规药物制剂。 0010本发明的目的是通过下列方式实现的说明书101780190A101780192A2/24页80011一种含有龙血竭药材提取物的药物制剂(龙血通药物制剂)的质量控制方法，可以采用以下方法中的任意一种或几种0012 (1)采用紫外-可见分光光度法检测，药物制剂每单位剂量含总酚以7，4-二羟基黄酮计，不得低于165.0mg；0013 (2)采用高效液相色谱法检测，药物制剂每单位剂量含龙血素B不得低于1.50mg；0014 (3)采用高效液相色谱指纹图谱检测，药物制剂的标准指纹图谱有8个共有峰，各共有峰的相对保留时间分别为1号峰0.400.60，2号峰0.420.65，3号峰0.550.78，4号峰0.600.85，5号峰0.700.95，6号峰0.821.15，S号峰1.00，7号峰1.011.30，其中S号峰为龙血素B的色谱峰；0015 (4)采用高效液相色谱法，结合溶出度测定法检测，本品45分钟时的溶出量以龙血素B计，不得少于75。 0016所述龙血通药物制剂中总酚的含量测定方法为0017a.对照品溶液的制备取7，4-二羟基黄酮，加无水乙醇制成对照品溶液；0018b.标准曲线的制备量取不同剂量的对照品溶液，加无水乙醇，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，摇匀，再加盐酸稀释；照紫外-可见分光光度法，测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；0019c.供试品溶液制备与测定法取本品，加无水乙醇溶解；取聚酰胺，加入上述溶液10ml，挥干乙醇，装入层析柱，用1030的乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇洗脱，收集洗脱液；量取该溶液置棕色量瓶中，加无水乙醇，量取该溶液置棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液，铁氰化钾溶液，三氯化铁溶液，再加盐酸，摇匀，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。 0020上述总酚的含量测定方法的优选为0021a.对照品溶液的制备取7，4-二羟基黄酮适量，加无水乙醇制成1ml中含2040g的溶液，即得；0022b.标准曲线的制备量取对照品溶液0ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，3.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液1ml，三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，以第一份为空白；照紫外-可见分光光度法，在750800nm处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；0023c.供试品溶液制备与测定法取本品，研细，约取515mg，置25ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取聚酰胺13g，置蒸发皿中，加入上述溶液10ml，拌匀，置热水浴上挥干乙醇，装入层析柱，用1030的乙醇4060ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇80120ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，量取该溶液5ml，置25ml棕色量瓶中，加十二烷基磺酸钠溶液2ml，铁氰化钾溶液1ml，三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，在750800nm处测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得。 0024上述总酚含量测定方法的优选为说明书101780190A101780192A3/24页90025a.对照品溶液的制备取7，4-二羟基黄酮适量，精密称定，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml中含32g的溶液，即得；0026b.标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6的铁氰化钾溶液1ml，0.9三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照中国药典xx年版一部附录VB的紫外-可见分光光度法，在780nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；0027c.供试品溶液制备与测定法取本品12mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置70水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用20的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6的铁氰化钾溶液1ml，0.9三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取含量，计算，即得；0028d.测定结果本品每单位剂量含总酚以7，4-二羟基黄酮计，不得低于165.0mg。 0029所述龙血素B的含量测定方法为0030采用高效液相色谱法测定0031a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1冰醋酸水溶液为流动相；0032b.对照品溶液的制备称取龙血素B对照品，加甲醇制成对照品溶液；0033c.供试品溶液的制备取本品，研细，称定，置烧瓶中，加乙醚，加热回流，滤过，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解，摇匀，再精密吸取少量至量瓶中，用甲醇稀释，摇匀，滤过，即得供试品溶液；0034d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。 0035上述龙血素B的含量测定方法的优选为0036高效液相色谱法测定0037a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1冰醋酸水溶液比例为30505070为流动相，流速0.51.5ml/min，检测波长为250300nm；0038b.对照品溶液的制备称取干燥的龙血素B对照品适量，加甲醇制成1ml含40g的溶液，作为对照品溶液；0039c.供试品溶液的制备取本品，研细，取约0.10.3g，称定，置烧瓶中，加乙醚，置水浴锅表面，加热回流，滤过，用乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；0040d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各520l，注入液相色谱仪，测定，即得。 说明书101780190A101780192A4/24页100041上述龙血素B的含量测定方法的优选为0042照中国药典xx年版一部附录VID的高效液相色谱法测定0043a.色谱条件和系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-1冰醋酸水溶液比例为4060为流动相，流速1.0ml/min，检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000；0044b.对照品溶液的制备精密称取60减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含40g的溶液，作为对照品溶液；0045c.供试品溶液的制备取本品0.2g，精密称定，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置60水浴锅表面，加热回流30分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得供试品溶液；0046d.测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10l，注入液相色谱仪，测定，即得；0047e.测定结果本品每单位剂量含龙血素B不得低于1.50mg。 0048所述龙血通药物制剂指纹图谱测定方法为0049采用高效液相色谱法测定0050a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A0.1的磷酸与B乙腈，梯度洗脱；0051b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品，加甲醇制成参照物溶液；0052c.供试品溶液的制备取本品，研细，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液，滤过，即得供试品溶液；0053d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得。 0054上述龙血通药物制剂指纹图谱测定方法的优选为0055采用高效液相色谱法测定0056a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A0.1的磷酸与B乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70线性下降至20，流动相B从30线性上升至80，5060min时，流动相A保持在20，流动相B保持在80；流速为0.41.0ml/min，检测波长为250300nm；0057b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含50g的溶液，即得参照物溶液；0058c.供试品溶液的制备取本品内容物，研细，取约0.30.8g，置锥形瓶中，加入甲醇，超声处理，滤过，取续滤液用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；0059d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各520l，分别注入液相色谱仪，测定，即得；0060上述龙血通药物制剂指纹图谱测定方法的优选为0061参照中国药典xx版一部附录VID的高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行测定0062a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为A0.1的磷酸与B乙腈，梯度洗脱，洗脱顺序为050min时，流动相A从70线性下降至说明书101780190A101780192A5/24页1120，流动相B从30线性上升至80，5060min时，流动相A保持在20，流动相B保持在80；流速为0.7ml/min，检测波长为280nm，理论板数按参照物龙血素B峰计算，不低于6000；0063b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加50甲醇制成每1ml含50g的溶液，即得参照物溶液；0064c.供试品溶液的制备取本品内容物，研细，取约0.5g，置锥形瓶中，精密加入50甲醇25ml，250W、40KHz超声处理30min，滤过，取续滤液用0.45m的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；0065d.测定法精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10l，分别注入液相色谱仪，测定，即得；0066e.测定结果供试品指纹图谱与标准指纹图谱经计算软件计算，相似度应大于0.80。 0067所述溶出度测定方法为0068采用高效液相色谱法，结合溶出度测定法进行测定0069a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1磷酸水溶液为流动相；0070b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成参照物溶液，0071c.供试品溶液的制备取本品，以十二烷基硫酸钠与氢氧化钠溶液为溶剂，旋转使溶出，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；0072d.测定法精密量取供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。 0073上述溶出度测定方法的优选为0074参照高效液相色谱法，结合溶出度测定法进行测定0075a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1磷酸水溶液比例为50554550为流动相；检测波长为275280nm；0076b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含1020g的溶液；0077c.供试品溶液的制备按照中国药典xx年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法，取本品，以0.1十二烷基硫酸钠0.025mol/L的氢氧化钠溶液100ml为溶剂，转速为每分钟6585转，经45分钟时，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；0078d.测定法精密量取供试品溶液520l，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。 0079上述溶出度测定方法的优选为0080参照中国药典xx年版一部附录VID的高效液相色谱法，结合中国药典xx年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法进行测定0081a.色谱条件与系统适应性用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1磷酸水溶液比例为5347为流动相；检测波长为278nm，理论塔板数按龙血素B峰计，应不低于10000；0082b.参照物溶液的制备取龙血素B对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含15g的溶液，说明书101780190A101780192A6/24页120083c.供试品溶液的制备按照中国药典xx年版二部附录XC第三法中的溶出度测定法，取本品，以0.1十二烷基硫酸钠0.025mol/L的氢氧化钠溶液100ml为溶剂，转速为每分钟75转，经45分钟时，取溶液适量，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；0084d.测定法精密量取供试品溶液10l，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；0085e.测定结果按外标法以峰面积计算每单位剂量的溶出量，本品45分钟时的溶出量以龙血素B计，不得少于75。 0086对上述质量控制方法的研究与说明0087 一、对总酚含量测定的研究说明0088 1、系统适应性研究0089 (1)仪器与试药高效液相色谱仪，紫外检测仪，记录仪，柱箱，7，4-二羟基黄酮对照品，纯度为98.23，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；0090 (2)测定方法的选择根据化学成分研究结果，采用三氯化铁-铁氰化钾显色法测定总酚类化合物的含量；0091 (3)对照品的选择经研究，选择7，4-二羟基黄酮作为本品含量测定的对照品；0092 (4)供试品制备方法与测定方法经研究，确定供试品制备方法为取本品12mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；取80100目的聚酰胺2g，置蒸发皿中，精密加入上述溶液10ml，拌匀，置70水浴上挥干乙醇，装入内径为1.5cm层析柱，用20的乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，再用无水乙醇100ml洗脱，收集洗脱液并定容至100ml，摇匀，精密量取该溶液10ml置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml棕色量瓶中，加0.3的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6的铁氰化钾溶液1ml，0.9三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，即得供试品溶液；0093本发明中0.3的十二烷基磺酸钠溶液的配置方法为取0.3g十二烷基磺酸钠，置100ml容量瓶中，加50乙醇溶液微热使溶解，放冷，加50乙醇溶液定容至刻度，即得。 0094 2、7，4-二羟基黄酮线性关系和回归方程0095 (1)对照品溶液的制备精密称取7，4-二羟基黄酮10mg，置25ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml，置25ml棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每1ml中含7，4-二羟基黄酮32g)；0096 (2)标准曲线的制备精密量取对照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置25ml量瓶中，加无水乙醇至5ml，加0.3的十二烷基磺酸钠溶液2ml，0.6的铁氰化钾溶液1ml，0.9三氯化铁溶液1ml，摇匀，置避光处放置5min，再加0.1M的盐酸定容至刻度，摇匀，置避光处放置35分钟，以第一份为空白；照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)，在780nm处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；测定结果见表1，标准曲线见附图1；0097回归方程y0.0995x+0.0790098其中x为浓度(g/ml)，y为吸收度，相关系数r0.9996。 0099表17，4-二羟基黄酮标准曲线0100说明书101780190A101780192A7/24页130101 3、精密度试验0102取龙血通药物制剂，按供试品制备方法制备成供试品溶液，在6分钟内，连续测定6次，结果见表2，结果表明精密度良好。 0103表2精密度试验结果01040105 4、稳定性试验0106取龙血通药物制剂，按供试品制备方法制备成供试品溶液，分别在不同时间测定其吸收度，结果见表3，表明供试品溶液在06分钟吸收度保持相对稳定。 0107表3样品稳定性考察数据01080109 5、重复性试验0110取龙血通药物制剂，按供试品制备方法制备成供试品溶液，测定，结果见表4，结果表明样品测定重现性好。 0111表4重复性试验01120113 6、加样回收试验0114取同一批号已知含量的龙血通药物制剂(含量为225.6mg/粒)6份，每份约6mg，精密称定，置25ml棕色容量瓶中，分别加入7，4-二羟基黄酮对照品5mg，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，按样品测定方法测定，计算总酚的含量和加样回收率，结果见表5，表明本方法准确性高。 0115表5加样回收试验结果0116说明书101780190A101780192A8/24页140117 7、十批样品含量测定0118取本品十批进行含量测定，测定结果见表6。 0119表6十批样品含量01200121限度确定根据龙血通药物制剂10批20个数据的含测结果，规定本品按干燥品计算，含龙血素B不得少于165.0mg/粒(片)。 0122 二、龙血素B含量测定方法的研究与说明0123 1、系统适应性研究0124 (1)仪器与试药0125高效液相色谱仪，紫外检测器；龙血素B对照品，供含量测定用；乙腈(色谱纯)，水(超纯水)；0126 (2)色谱条件0127流动相的选择经研究，选择乙腈-1HAC比例为4060系统作为流动相；0128测定波长的选择经研究，将测定波长定为278nm；0129柱温30；0130系统适用性研究经研究，在系统实验中龙血素B的理论塔板数不得低于4000。 0131 2、供试品溶液、对照品溶液的制备和阴性供试液的制备0132 (1)供试品溶液的制备经研究，确定供试品制备方法为精密称取龙血通药物制剂内容物0.1g，置50ml圆底烧瓶中，加30ml乙醚，置60水浴锅表面，加热回流30分钟，滤过，用少量乙醚清洗容器和滤器，滤液和洗液合并，挥干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至50ml，摇匀，滤过，即得；0133 (2)对照品溶液的制备精密称取60减压干燥至恒重的龙血素B对照品适量，加甲醇制成每1ml含40g的溶液，作为对照品溶液；0134 (3)阴性供试液的制备取阴性样品(除主药外的辅料制得的样品)，参照供试液制备方法，制成阴性供试液。 0135 3、方法学考察0136 (1)线性关系考察0137标准品溶液的制备精密称取60减压干燥至恒重的龙血素B16.78mg置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液储备液；分别吸取对照品溶液0.5，1，2，4，6，8ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；分别进样10l，以进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，见表7和附图2；说明书101780190A101780192A9/24页150138线性关系和回归方程回归方程为Y28388X-11375；0139r1；线性范围为8.39134.24g/ml。 0140表7龙血素B标准曲线实验数据01410142 (2)精密度试验0143取C86.72ug/ml的标准品，连续进样6次测定峰面积，结果见表8，结果表明精密度较好。 0144表8精密度试验结果01450146 (3)稳定性试验0147取样品，分别在配置后 0、 1、 2、 4、 8、12小时测定，结果见表9，表明供试品在12小时内稳定。 0148表9稳定性考察数据01490150 (4)重复性试验0151精密称取同一批号样品5份，测定，每次进样10l，结果见表10，结果表明方法重复性较好。 0152表10重复性试验结果01530154 (5)加样回收试验0155精密称取样品(龙血素B含量为4.78mg/g)5份，每份0.1g，分别加入浓度为0.1678mg/ml的龙血素B对照品溶液2ml，按照供试品溶液制备方法制备，测定，计算回收率，结果见表11，平均回收率为99.95。 0156表11加样回收试验结果说明书101780190A101780192A10/24页1601570158 (6)样品含量测定及含量0159取十批本品，按说明书中含量测定项下龙血素B的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进行十批成品中龙血素B的含量测定，结果见下表12。 0160表12龙血通药物制剂中龙血素B含量测定01610162限度确定根据龙血通药物制剂10批20个数据的含测结果，规定本品按干燥品计算，含龙血素B不得少于1.50mg/粒(片)。 0163 三、指纹图谱测定方法的研究与说明0164 1、概述0165龙血通药物制剂由龙血竭单味药材组成，具有活血化瘀，通脉舒络的功效，用于血瘀引起的中风。 为了更全面、有效的控制龙血通药物制剂的质量，提高中药口服制剂的质量控制水平，让临床用药安全及疗效更加有所保证，发明人参照中药注射剂指纹图谱的要求，对龙血通药物制剂指纹图谱进行了研究，经过对供试品制备方法的考察及测定指纹图谱的仪器，色谱柱、流动相、检测波长等条件进行系统的优选，建立了指纹图谱测定条件并进行了方法学考察。 在对多批龙血通药物制剂指纹图谱检测结果的基础上，逐渐积累数据，提出了龙血通药物制剂的指纹图谱标准草案，作为本品指纹图谱标准，从而达到能够更全面、有效地控制药物制剂质量的目的。 0166对所测得的指纹图谱的辨认，发明人采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统，经多次试验研究，且通过与计算相对保留时间及相对保留峰面积的方法相比较，所得出的评价结论基本一致，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价指纹图谱的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。 所以发明人采用该软件做为龙血通药物制剂指纹图谱相似度计算软件。 0167 2、指纹图谱标准研究说明0168 (1)参照物溶液的制备说明书101780190A101780192A11/24页170169根据对龙血通药物制剂成分的分析，选择龙血素B作为参照物；0170 (2)供试品溶液的制备0171经研究，最终确定龙血通药物制剂指纹图谱测定供试品的制备方法为取装量差异项下的龙血通药物制剂内容物，混匀，研细，取约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加50甲醇25ml，超声(250W、40KHz)30min，过滤，取续滤液做为供试品溶液，即得。 0172 (3)检测方法0173仪器和试剂0174仪器高效液相色谱仪，多波长紫外-可见检测器，全自动进样器，色谱工作站，色谱柱，流动相为A0.1的磷酸和B甲醇，梯度洗脱，洗脱顺序为0175时间(min)A(0.1磷酸)B(乙腈)017607030017750208001786020800179流速为0.7ml/min；检测波长为280nm；论板数按参照物(龙血素B)峰计算，应不低于6000；0180试剂甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。 0181色谱柱0182经试验考察，发现Waters XterraC188色谱柱对制剂中各成分分离效果最好，因此选择用该类型色谱柱作为龙血通药物制剂指纹图谱测定专用色谱柱。 0183测定波长发明人检测了五个波长下的指纹图谱，经比较分析，确定280nm为指纹图谱的检测波长，在该波长下的指纹图谱中，除已知成分龙血素B能够较好的检测出外，其它成分指纹峰也能被较好地体现，且各峰分离度好，基线较平稳、重复性好；0184 (4)稳定性试验0185取龙血通药物制剂成品，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，每隔3小时测定一次其指纹图谱，共测6次，结果见表13，以0小时进样所得指纹图谱为对照计算相似度，相似度结果均不小于0.99，表明供试品溶液15小时内成分是稳定的，符合指纹图谱的技术要求。 0186表13稳定性分析结果0187(参照文件名为龙血通药物制剂对照图谱.Scp)0188时间数据文件相似度(参照)相似度(对照)对照图谱龙血通药物制剂对照图谱.Scp1.0000.9570小时SIG