CN101954077A一种用于增强肿瘤化疗药物化疗效果的表达质粒佐剂及其制备方法

CN101954077A一种用于增强肿瘤化疗药物化疗效果的表达质粒佐剂及其制备方法 (10)申请公布号101954077A (43)申请公布日xx.01.26101954077A*101954077A* (21)申请号xx10280657.X (22)申请日xx.09.14A61K39/39(xx.01)A61K48/00(xx.01)A61K31/513(xx.01)C12N15/113(xx.01)C12N15/867(xx.01)A61P35/00(xx.01) (71)申请人中国人民解放军第二军医大学地址xx33上海市翔殷路800号 (72)发明人孙树汉商京丽魏伟 (74)专利代理机构上海德昭知识产权代理有限公司31204代理人丁振英 (54)发明名称一种用于增强肿瘤化疗药物化疗效果的表达质粒佐剂及其制备方法 (57)摘要本发明涉及生物医学领域。 5-FU广泛应用于消化道恶性肿瘤的化学治疗，但在大肠癌化疗中原发和获得性耐药现象很普遍；细胞凋亡是化疗药物发挥作用的重要途径，APAF-1作为调节蛋白主要参与凋亡的线粒体途径的信号转导。 miR-23a可与其靶基因APAF1结合，从而降低APAF1的表达，降低因化疗通过线粒体途径引起的凋亡，从而增强肿瘤对化疗药物的耐受性；若能使体内miR-23a的表达量下降可以引起凋亡细胞数增加，从而增强化疗药物的敏感性。 本发明提供一种用于增强化疗药物特别是5-FU化疗效果的PLKO-anti-miR-23a疫苗佐剂，经体外实验证明可以明显增强因化疗药物5-FU引起的结肠癌细胞的凋亡水平，体内试验表明可以明显增强5-FU的化疗效果，抑制肿瘤生长，增强免疫缺陷鼠的生存期。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表1页附图2页101954077A1/1页21.一种用于增强肿瘤化疗药物化疗效果的质粒佐剂，它以慢病毒载体质粒PLKO.1为基本骨架，含有颈环结构的如SEQ IDNO1所示的正义链序列和如SEQ IDNO2所示的反义链序列的质粒。 2.根据权利要求1所述的用于增强肿瘤化疗药物化疗效果的质粒佐剂，其中所述的肿瘤化疗药物是5-氟尿嘧啶或在肿瘤化疗中可以引起miR-23a表达增加的化疗药物。 3.一种如权利要求1或2所述的用于增强肿瘤化疗药物化疗效果的质粒佐剂的制备方法，具体步骤如下具有颈环结构的表达miR-23a抑制剂序列正义链5CCGGTATCACATTGCCAGGGATTTCCCTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGATTTTTTG3(SEQ IDNO1)反义链5AATTCAAAAAATCACATTGCCAGGGATTTCCCTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGAT A3(SEQ IDNO2)在序列的两端加上能与载体末端匹配结合酶切位点的粘性末端，将带有颈环结构的序列经人工合成后，将核苷酸序列重悬于双蒸水中，浓度为1ug/ul。 将此管核苷酸序列退火合成双联。 退火体系为-5ul ofSense oligo-5ul ofAntisense oligo-5ul of10x NEBbuffer2-35ul ddH2O共50ul体系，于95水浴中孵育4分钟，在盛有1500ml水的烧杯中于70孵育10分钟，然后自然降至室温，形成双链结构。 将慢病毒载体质粒PLKO.1经酶切位点AgeI和EcoRI酶切后，将双链寡核苷酸序列克隆入酶切后的PLKO.1载体中。 权利要求书101954077A1/6页3一种用于增强肿瘤化疗药物化疗效果的表达质粒佐剂及其制备方法技术领域0001本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种用于增强化疗药物化疗效果的PLKO-anti-miR-23a表达质粒佐剂及其制备方法。 背景技术00025-氟尿嘧啶(5-FU)广泛应用于消化道恶性肿瘤的化学治疗，由于它疗效确切，一直处于其他化疗药无法替代的地位，但一些病例对该药物为主的化疗并不敏感。 5-FU是治疗大肠癌，胃癌，胆管癌常用的药物，单药治疗的有效率仅20左右。 化疗药的联合使用(如5-FU+长春新碱+司莫司汀)，使晚期大肠癌的化疗有效率明显提高，患者中位生存时间明显延长。 尽管如此，大肠癌化疗中原发和获得性耐药现象很普遍。 基因遗传多态性，使患者对化疗敏感性存在个体化差异。 如何选择合适的化疗方案和选择增强化疗效果的佐剂使患者从治疗中受益，非常重要。 0003细胞凋亡是化疗药物发挥作用的重要途径。 细胞有增殖、分化和凋亡三种特性，在正常情况下，三者相互协调，保持平衡。 肿瘤组织除了具有增殖活性以外，肿瘤细胞凋亡率减少，将使肿瘤细胞净生长率提高，预后则更差。 根据细胞凋亡发生的过程分为两条途径一条是死亡受体途径，即通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase；一条是线粒体途径，即通过线粒体释放凋亡蛋白酶激活因子激活caspases。 这些活化的caspase蛋白可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。 线粒体在细胞凋亡发生机制中起关键作用，它不仅可以自身释放细胞色素C等物质介导凋亡，还可以和其他凋亡诱导因子共同作用而改变自身的活动状态，从而更好的调节细胞凋亡。 APAF-1(凋亡肽诱导因子1)作为调节蛋白主要参与线粒体途径的信号转导。 APAF-1广泛分布于人脑、心、肝、脾、肺、胰、肾、胸腺、小肠、结肠、骨骼肌、卵巢、睾丸、外周血白细胞等多种组织和细胞内。 在化疗药物作用下，线粒体功能障碍导致细胞色素C释放；释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与APAF-1结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡体，caspase-9随即被激活；被激活的caspase-9能激活其它的caspase，如caspase-3等；caspase-3又激活DNA断裂因子，导致静息状态的核酸内切酶活化，最终引起DNA断裂，引起细胞凋亡。 0004microRNA(miRNA)是一类长度约2125碱基的非编码蛋白质单链小分子RNA，广泛存在于多细胞生物和病毒体内，主要通过核酸序列互补匹配结合到特定的靶mRNA上，抑制靶mRNA翻译过程或降解靶mRNA，是一种起负调控作用的分子。 目前越来越多的研究显示，miRNA广泛参与了生物体多种生理过程，且相关研究报道也表明其表达及功能失调可能影响肿瘤发生、发展和化疗等多种病理现象。 目前，对于miRNA干预肿瘤化疗的报道逐渐增多。 例如FANYIN MENG等人证实在胆管癌的化疗中抑制miR-21和miR-200b的表达可以增强化疗药物的敏感性(FANYIN MENG，ROGERHENSON，MOLLY LANG，HANIA WEHBE，SHAILMAHESHWARI，JOSHUA T.MENDELL，JINMAI JIANG，THOMAS D.SCHMITTGEN，and TUSHARPATEL GASTROENTEROLOGYxx；1302113-2129)。 Chan JA，Krichevsky AM，等研究者发现说明书101954077A2/6页4miR-21可以通过干扰凋亡相关基因的表达增强神经胶质瘤的耐药性(Chan JA，Krichevsky AM，Kosik KS.MicroRNA-21is anantiapoptotic factorin humanglioblastomacells.Cancer Res.xxJul15；65 (14)6029-33.)。 0005hsa-mir-23a(Mature sequenceMIMAT0000078)是一种在人胆管癌、胃癌、结肠癌和乳腺癌等肿瘤经过化疗药物5-FU处理后高表达的miRNA。 目前对于hsa-mir-23a的报道，例如在胆管癌中，mir-23a的表达显著上调，(FANYIN MENG，ROGER HENSON，MOLLY LANG，HANIAWEHBE，SHAIL MAHESHWARI，JOSHUA T.MENDELL，JINMAI JIANG，THOMAS D.SCHMITTGEN，and TUSHARPATEL GASTROENTEROLOGYxx；1302113-2129)；在结肠癌经过5-FU化疗处理后，miR-23a的表达明显升高，(Lorena Rossi，Enzo Bonmassar，Isabella Faraoni，Modification ofmiRgene expressionpattern inhuman coloncancer cellsfollowing exposureto5-fluorouracil invitro PharmacologicalResearch56 (xx)248-253)；miR-23a通过对于LMNB1表达的调节增强神经胶质瘤的形成和髓鞘形成，从而促进神经胶质瘤细胞的增殖(Shu-Ting Lin，Ying-Hui Fu，miR-23regulation oflaminB1is crucialforoligodendrocyte developmentand myelinationDiseaseModels&Mechanisms2，178-188 (xx)doi10.1242/dmm.001065)。 0006至今未见一种用于增强肿瘤化疗效果的表达miRNA-23a抑制剂的表达质粒佐剂的研究和应用来增强肿瘤的化疗效果的报道。 发明内容0007本发明的目的在于提供一种用于增强肿瘤化疗药物化疗效果的表达质粒佐剂及其制备方法。 0008本发明设想，miR-23a可与其靶基因APAF1结合，从而降低APAF1基因的表达，降低因化疗引起的线粒体途径的凋亡。 从而增强肿瘤对化疗药物的耐受性。 相反，过表达miR-23a的抑制剂，使体内miR-23a的表达量下降可以引起凋亡细胞数增加，从而增强化疗药物5-FU的敏感性。 因此本发明拟在体内或肿瘤中直接转入miR-23a的抑制剂表达质粒可以增强肿瘤的化疗敏感性。 0009本发明提供一种用于增强肿瘤化疗药物化疗效果的表达质粒佐剂，它以慢病毒载体质粒PLKO.1为基本骨架，含有颈环结构的正义链5CCGGTATCACATTGCCAGGGATTTCCCTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGATTTTTTG3和反义链5AATTCAAAAAATCACATTGCCAGGGATTTCCCTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGAT A3序列的质粒。 0010上述质粒可稳定表达与miR-23a成熟体序列(AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC)互补的表达质粒。 该表达质粒的表达序列克隆入其他的表达载体中进行表达也可构建其他的表达质粒佐剂。 0011上述的肿瘤化疗药物是5-氟尿嘧啶(5-FU)或在肿瘤化疗中可以引起miR-23a表达增加的化疗药物。 0012当本发明的表达质粒佐剂与5-FU联合应用时，可提高肿瘤针对5-FU的敏感性，提高肿瘤的化疗效果。 同时该疫苗可以自己引起细胞凋亡增加，故也可以与其他化疗药物联合应用来增强化疗效果。 该疫苗可以作为增强化疗效果的表达质粒佐剂来应用。 0013本发明提供了一种用于增强肿瘤化疗药物化疗效果的表达质粒佐剂，是通过瘤内说明书101954077A3/6页5直接注射该质粒或通过局部植入缓释泵将质粒注入到瘤体内，让该佐剂在肿瘤体内不断扩增并表达miR-23a的抑制剂，从而使抑制剂与肿瘤内部的miR-23a结合，抑制肿瘤内因化疗药物的压力而引起miR-23a的过表达，从而在于化疗药物联合应用时增强肿瘤药物的敏感性，增强化疗效果。 本发明的质粒佐剂的应用方式包括瘤内注射，肌肉注射，皮下注射，静脉注射，腹腔注射，粘膜吸收，胃肠道吸收等应用方式。 可以与化疗药物联合应用也可以在肿瘤局部瘤内注射。 0014本发明还提供了一种用于增强肿瘤化疗药物化疗效果的质粒佐剂的制备方法，具体步骤如下0015具有颈环结构的表达miR-23a抑制剂序列0016正义链5CCGGTATCACATTGCCAGGGATTTCCCTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGATTTTTTG3(SEQ IDNO1)0017反义链5AATTCAAAAAATCACATTGCCAGGGATTTCCCTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGAT A3(SEQ IDNO2)0018在序列的两端加上能与载体末端匹配结合酶切位点的粘性末端，将带有颈环结构的序列经人工合成后，将核苷酸序列重悬于双蒸水中，浓度为1ug/ul。 将此管核苷酸序列退火合成双联。 0019退火体系为0020-5ul ofSense oligo0021-5ul ofAntisense oligo0022-5ul of10x NEBbuffer20023-35ul ddH2O0024共50ul体系，于95水浴中孵育4分钟，在盛有1500ml水的烧杯中于70孵育10分钟，然后自然降至室温，形成双链结构。 将慢病毒载体质粒PLKO.1经酶切位点AgeI和EcoRI酶切后，将双链寡核苷酸序列克隆入酶切后的PLKO.1载体中。 转化入大肠杆菌感受态中，大量扩增目的序列。 经测序鉴定正确后进行下一步的应用检测。 0025本发明经动物实验结果表明1.在体外转染人结肠癌细胞系中通过转染表达后，进一步通过realtime PCR鉴定miR-23a的表达改变情况，进一步确定该质粒表达的miRNA-23a抑制剂序列在体外稳定表达(如图3所示)。 2.在免疫缺陷鼠中接种移植瘤，通过直接瘤内注射该佐剂或通过建立稳转PLKO-anti-miR23a的结肠癌细胞株，并接种在免疫缺陷鼠中进一步观察对化疗效果的改变的影响。 再次证明该疫苗佐剂在体内稳定表达，并对肿瘤的化疗起到了增强作用。 因此证明了PLKO-anti-miR23a可以作为疫苗佐剂在肿瘤化疗中发挥明显的抗肿瘤作用。 3.本发明提供的通过大肠杆菌大量扩增表达miR23a抑制剂的质粒，为成熟的质粒体外扩增的方法，目前有成熟的体外扩增技术和分离纯化方法。 4.用大肠杆菌体外扩增miR23a抑制剂的质粒，生产简单，成本低廉，给病人体内注射操作方便，植入缓释泵后可以反复注入质粒，对病人创伤性小。 5.与其他肿瘤化疗药物相比，直接瘤内注射副作用小。 附图说明0026图1是PLKO-anti-miR23a表达质粒重组战略图；说明书101954077A4/6页60027图2是重组质粒测序结果图。 0028图3体外转染重组质粒后经realtime PCR鉴定miR-23a表达改变的统计图。 具体实施方式0029下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述，但本发明的实施不仅限于此。 0030实施例1重组质粒PKLO-anti-miR23a的构建0031设计具有颈环结构的表达miR-23a抑制剂序列0032正义链5CCGGTATCACATTGCCAGGGATTTCCCTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGATTTTTTG30033反义链5AATTCAAAAAATCACATTGCCAGGGATTTCCCTCGAGGGAAATCCCTGGCAATGTGAT A30034在序列的两端加上能与载体末端匹配结合酶切位点的粘性末端，将带有颈环结构的序列经人工合成后，将核苷酸序列重悬于双蒸水中，浓度为1ug/ul。 将此管核苷酸序列退火合成双联。 0035退火体系为0036-5ul ofSense oligo0037-5ul ofAntisense oligo0038-5ul of10x NEBbuffer20039-35ul ddH2O0040共50ul体系，于95水浴中孵育4分钟，在盛有1500ml水的烧杯中于70孵育10分钟，然后自然降至室温，形成双链结构。 将慢病毒载体质粒PLKO.1(Openbiosystems USA)经酶切位点AgeI和EcoRI酶切后，将双链寡核苷酸序列克隆入酶切后的PLKO.1载体中(如图1所示)。 转化入大肠杆菌感受态中，挑单克隆进一步扩增目的序列。 委托Invitrogen公司测序鉴定正确后进行下一步的应用检测(如图2所示)。 0041实施例2重组质粒PKLO-anti-miR23a的大量制备(采用碧云天生物技术公司的质粒大抽试剂盒)00421.取过夜菌至50毫升离心管内，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。 再重复一次，每管共收集100毫升过夜菌沉淀。 00432.每管加入5毫升溶液I，重悬细菌沉淀。 确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。 确认溶液I中已添加了RNase A。 最高速度涡旋10-20秒或更长时间，悬起沉淀。 一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。 如果没有涡旋仪，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开。 00443.每管加入5毫升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，室温放置3-5分钟，使细菌完全裂解，溶液透明。 00454.每管加入5毫升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。 00465.最高速(5,000rpm)室温离心10-20分钟。 如果速度较高例如10,000rpm左右，一般离心10分钟已经足够。 离心时可以准备好质粒纯化柱，自制漏斗等，并在纯化柱上标上记号。 00476.将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。 最高速离心2分钟，倒说明书101954077A5/6页7弃收集管内液体。 质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。 倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。 00487.在质粒纯化柱内加入7毫升溶液IV，最高速离心2分钟，洗去杂质，倒弃收集管内液体。 加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。 倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。 00498.最高速再离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。 注意倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液IV。 微量的溶液IV会影响质粒的质量。 00509.将质粒纯化柱置于50毫升离心管上，加入2毫升溶液V至管内柱面上，放置2分钟。 也可以用重蒸水或MiliQ级纯水替代溶液V，但是水的pH应不小于6.5。 溶液V加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。 10.最高速离心2分钟，所得液体中加入10毫升溶液VI，混匀后加到原质粒纯化柱内。 加入溶液VI后必须混匀！可颠倒混匀，混匀后切勿离心。 005111.最高速离心2分钟，倒弃收集管内液体。 005212.在质粒纯化柱内加入15毫升溶液IV，最高速离心2分钟，进一步洗去杂质，倒弃收集管内液体。 加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。 倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。 005313.最高速再离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。 注意倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液IV。 微量的溶液IV会影响质粒的质量。 005414.将质粒纯化柱置于50毫升离心管上，加入2毫升溶液V至管内柱面上，放置2分钟。 005515.最高速离心2分钟，所得液体即为超纯质粒。 005616.DNA定量分析，用适量体积的TE缓冲液稀释DNA溶液。 用紫外分光光度计测量器OD260和OD2