微生物发酵产丁二酸研究.doc

第一章 文献综述1.1丁二酸的简介1.1.1丁二酸的简介丁二酸(Succinic acid)，化学名称为乙烷-1,2-二羧酸。其分子结构如图1-1所示。图1-1丁二酸的分子结构在常温的情况下，纯琥珀酸是固体，呈无色无味的晶体。它的熔点及沸点分别是185C及235C。它形成的阴离子称为琥珀酸根离子，是三羧酸循环其中的一分子，且是能够在以下化学反应中放出电子予电子传递链。琥珀酸已被美国 FDA 认定为GRAS(一般认为安全)，这使得它可以用于多种用途。它是厌氧代谢的发酵产物之一琥珀酸广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品、塑料等行业，也可以作为 C4 平台化合物，合成一些重要的化工产品如丁二醇、四氢呋喃、-丁内酯、n-甲基吡咯烷酮(NMD)、2-吡咯烷酮等，全世界市场需求量超过276000 t/a. 另外，琥珀酸还可用来合成可降解的生物聚合物，如聚丁烯琥珀酸酯(PBS)和聚酰胺，这使琥珀酸的市场需求量高达 27000000t/a，被美国能源部认为是未来12 种最有价值的生物炼制产品之一。利用微生物发酵法转化可再生资源（葡萄糖,木糖等）生产琥珀酸, 由于原料来源广泛且价格低廉, 污染小, 环境友好, 且在发酵过程中可吸收固定CO2, 能有效缓解温室效应, 开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径, 近年来成为研究的热点1-2。1.1.2丁二酸制备方法的简介丁二酸的主要制备方法有：化学法和生物发酵法。化学合成法丁二酸的化学合成方法主要有石蜡氧化法、轻油氧化法、催化加氢法、丁二腈水解法等。石蜡氧化法：传统的生产方法，石蜡在钙、锰催化下深度氧化得到混合二元酸氧化石蜡，后者通过热水蒸汽蒸馏，去除不稳定羟基油溶性酸和酯后，水相中含有丁二酸，干燥后得到丁二酸的结晶。石蜡氧化法工艺比较成熟，但收率和纯度都不高，且有污染催化加氢法:以顺丁烯二酸或顺丁烯二酸酐为原料，采用载有活性炭的镍或贵金属为催化剂，在大约130 140，230105I)a条件下催化加氢得到。顺丁烯二酸或顺丁烯二酸酐的催化加氢体系可分为多相和均相，其中多相催化体系又可分为气相催化加氢体系和液相催化加氢体系。催化加氢法是目前世界上用得最广泛的丁二酸工业合成方法，其转化率高，产率高，产品纯度良好，无明显副反应，但操作条件要求较高，成本高，工艺复杂，且污染严重。电化学法:以顺丁烯二酸或顺丁烯二酸酐为原料，电解还原得到丁二酸。电解槽主要分为隔膜和无隔膜两种，工作电极有铅、铅合金、石墨、不锈钢、铜、钛、二氧化钛电极等。电化学还原顺丁烯二酸合成丁二酸主要有两种方式：直接电还原和间接电还原。直接电还原是直接在电极表面由电子进攻双键或活性氢还原生成丁二酸。 间接阴极电还原主要以Ti i4+为媒质，间接还原顺丁烯二酸合成丁二酸3。发酵法.1发酵菌种丁二酸是一些厌氧和兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中间物。一般情况下，丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌能够分泌丁二酸。据报道，一些乳酸菌(LactobaciIlus)也能在特定的培养基上不同程度地产生丁二酸。国外在20世纪90年代就开始发酵生产丁二酸的研究， 目前报道的发酵产丁二酸的菌种主要Anaerobiospirillum succiniciproducens4、Actinobacillus succinogenes5 、Mannheimia succiniciproducens6和重组E. coli7-9，另外还有如Corynebacterium glutamicum、Mannheimia succiniciproducens10等菌种。由于天然菌株的产丁二酸能力非常低，发酵产物多种多样，对糖或丁二酸的耐受性比较差，因此必须运用生物工程技术对现有的菌种进行改造11。.2重组大肠杆菌产发酵丁二酸野生大肠杆菌产丁二酸的代谢途径：一般认为, 野生型E. coli 在有氧环境中, 琥珀酸仅作为TCA 循环中的中间产物, 没有积累; 但在厌氧环境下, 进行混合酸发酵（图1）, 并认为存在六条途径可以代谢生成琥珀酸（图2）。其中, 琥珀酸主要的产生途径为葡萄糖经过糖酵解途经生成磷酸烯醇式丙酮酸, 并进而代谢合成草酰乙酸、苹果酸、富马酸, 最终以琥珀酸的形式积累。在此合成途径中, 每1 mol 葡萄糖生成2 mol NADH, 生成1 mol 琥珀酸需要消耗 2 mol 的NADH, 而生成乳酸、甲酸和乙酸则只需消耗1mol 的NADH 甚至不需要消耗NADH, 因此, 在野生大肠杆菌中, 琥珀酸由于需要更多的还原力, 积累很少。 图1 大肠杆菌厌氧混合酸发酵途径12Fig. 1 Pathways of anaerobic mixed acid fermentation for Escherichia coli图2 大肠杆菌K-12 发酵产丁二酸途径Fig. 2 Pathways for the formation of the fermentation product succinate in Escherichia coli K-1213 Note: 1: PEP carboxykinase; 2: Malate dehydrogenase; 3: Fumarase;4: Fumarate reductase; 5: PEP carboxylase; 6: Aspartate: glutamate transaminase; 7: Aspartase; 8: Succinic semialdehyde dehydrogenase; 9: -aminobutyrate: glutamate transaminase; 10: Glutamate decarboxylase;11: Isocitrate lyase13产琥珀酸大肠杆菌基因改造策略：1增强琥珀酸代谢途径中关键酶：a 超量表达内源性基因：苹果酸酶催化苹果酸与丙酮酸之间的反应,正常生理条件下该酶催化动力学上有利的苹果酸转化为丙酮酸的正向反应, 但苹果酸酶在特定的菌种中有可能催化从丙酮酸到苹果酸的逆向反应, 原因是该反应方向在热力学上是有利的。大肠杆菌中编码苹果酸酶的基因sfcA, 在E. coli双突变株NZN111 中超量表达后, 由于该菌株缺乏乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂解酶活性, 导致丙酮酸的大量积累, 使苹果酸酶逆向催化生成苹果酸,并以琥珀酸作为最终还原产物而大量积累。PEP 羧化酶基因(ppc)和PEP 羧化激酶基因(pck)催化PEP 与草酰乙酸(OAA)之间的反应。Millard等人发现PEP 羧化酶可能是大肠杆菌厌氧混合酸发酵中催化PEP 至OAA 最主要的酶, 而当ppc 缺陷时, PEP 羧化激酶可催化该反应。富马酸还原酶是厌氧琥珀酸合成途径中另外一个关键酶, 其核苷酸序列、氨基酸序列与琥珀酸脱氢酶相似, 均可催化富马酸与琥珀酸之间的反应,仅与底物之间的亲和力有所差异。b引入外源性基因：在大肠杆菌中过量表达内源性基因取得了很好的效果, 且由于稀有密码子少等原因容易表达, 但发展空间较小, 目前很多研究者尝试在E. coli中引入外源基因, 尤其是大肠杆菌自身不含的酶基因来构建新的代谢途径(如pyc 基因)以提高琥珀酸收率及生产强度。2 敲除或失活琥珀酸竞争途径中的酶：野生型大肠杆菌厌氧混合酸发酵过程中主要产物为乳酸, 甲酸和乙酸, 若要获得高浓度的琥珀酸积累, 则必需减少这些副产物的生成, 使更多的代谢流流向琥珀酸14。1.2重复批次发酵简介重复批次发酵，即在发酵结束后回收发酵液中的细胞，转入新鲜培养基，继续发酵，进行重复批次生产。重复批次发酵可以延长了菌体的发酵时间，提高了产物的总产量，达到了细胞重复利用的效果。重复批次发酵在乙醇生产过程中应用较多，如李15等人利用自絮凝酵母重复批次发酵乙醇，获得了连续生产高浓度乙醇的工艺。大肠杆菌发酵丁二酸后期，由于产物抑制作用，产物增加不再明显，但是细胞仍具有较高发酵能力。因此，回收细胞，进行重复批次发酵具有重要意义。根据丁二酸发酵液的主要特点，回收发酵液中菌体，进行了重复批次发酵。每批次发酵采用细胞转化的方法，即将回收的细胞悬浮无菌水中，仅补加葡萄糖和碳酸镁，然后进行厌氧发酵，并考察了细胞浓度、初始葡萄糖浓度、pH调节剂对细胞转化的影响。相比于两阶段发酵，细胞转化节约了氮源和细胞生长期的能量消耗。重复批次转化循环利用菌体，延长丁二酸发酵时间，提高丁二酸总产量，有利于丁二酸的工业化生产。参考文献1 詹晓北, 朱一晖, Donghai Wang琥珀酸发酵生产工艺及其产品市场. 食品科技, 2003, 2: 4449. 2 王大勋, 马铁宁. 从深度氧化石蜡中提取琥珀酸. 化学工程师, 2003, 96(3): 1516.3 薛锋. 丁二酸合成研究进展. 安徽化工，：1008553X(2009)050010044 陈设，詹晓北，郑志永，等Anaerobiospinllum succiniciproducens 厌氧发酵产丁二酸的培养基优化研究lJ1现代化工，2006，26(2)：2712765朱蕾蕾，刘宇鹏，郑璞，等一株丁二酸产生菌的筛选及鉴定【J】微生物通报，2007 34(1)：8083 . 6Lee P C，Lee S Y，Hong S H ，et a1Isolation and characterizationof a new succinic acidproducing bacterium ，Mannheimia SUciniciproducens MBEL55E，from bovine rumenJApp1Microbio1 Biotechno12002，58：663666 7Hodge D B，Andersson CDetoxification requirements for bioconversionof softwood dilute acid hydrolyzates to succinic acidJEnzyme and Microbial Technology ，2009：3093168Donnelly M I，Sanville M，NghiemC Y，et a1Method to producesuccinicacid from raw hydrolysatesUS Patent 6743610，20049Wu H，Li Z M，Zhou L，et a1Enhanced anaerobic succinic duction by Eschedch coil NZN1 1 1 aerobically grown on gluconeogeniccarbon sources【J】Enzyme and Microbial Technology.10张玉秀，王姣，王丹，齐峰. 大肠杆菌产琥珀酸基因工程研究进展. 中国生物工程杂志, 29(7): 108117.11谢鑫，陈可泉，刘忠敏，姜岷，韦萍.产丁二酸大肠杆菌的构建及其厌氧发酵.生物工程学报，24（1）：101-105.12Clark DP. The fermentation pathways of Escherichia coli.FEMS Microbiology Reviews, 1989, 63(3): 223234.13 Van der Werf MJ, Guettler MV, Jain MK, et al. Environmentaland physiological factors affecting the succina product ratio during carbohydrate fermentation by Actinobacillus sp. 130Z. Arch Microbiology, 1997, 167(6):332342.14 姜 岷,马江锋, 陈可泉, 王益娜 ,于 丽. 重组大肠杆菌产琥珀酸研究进展.微生物学通报, 36(1): 12012415Li F, Zhao XQ, Ge XM, Bai FW. An innovative consecutive batch fermentation process for very high gravity ethanol fermentation with self-flocculating yeast. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 84: 10791086.16 Willke T, Vorlop KD. Industrial bioconversion of renewable resources as an alternative to conventional chemistry. Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 66: 131142. 17 Schilling, LB. Chemicals from alternative feedstocks in the United States. FEMS