MM_FS_CNJ_0138 出口肉及肉制品中柱晶白霉素残留量检验方法.DOC

MM_FS_CNJ_0138出口肉 肉制品 柱晶白霉素 残留量 杯碟法 MM_FS_CNJ_0138 出口肉及肉制品中柱晶白霉素残留量检验方法1.适用范围 本方法适用于出口猪肉中柱晶白霉素残留量的检验。2.原理概要 用磷酸盐缓冲液(pH8.00.1)提取试样中柱晶白霉素残留，离心分层，取上清液，使与藤黄八叠球菌作用，进行杯碟法检测，用标准曲线法定量。3.主要试剂和仪器3.1.主要试剂 磷酸盐缓冲液(pH8.00.1)：精确称取13.3g无水磷酸二氢钾，溶解于900mL水中。另取6.2g氢氧化钾，溶解于100mL水中。将二者混合均匀，121高压灭菌15min； 生理盐水：称取8.5g氯化钠，溶解于1000mL水中，121高压灭菌15min； 柱晶白霉素标准品：1562IU/mg，由中国兽药监察所提供，密封避光，防潮保存在4冰箱中； 试验菌种：藤黄八叠球菌(Sarcinalutea)，由卫生部药品生物制品检定所提供，菌号28001； 营养肉汤：见附录A中A1； 保存用培养基：见附录A中A2； 基层及菌种层用培养基：见附录A中A3； 柱晶白霉素标准储备液：称取柱晶白霉素标准品64mg(精确至0.1mg)，用水溶解并定容至100mL，配制成1000 IU/mL的标准储备液，于4冰箱保存，可使用4天； 柱晶白霉素标准工作液：取一定量柱晶白霉素标准储备液，用磷酸盐缓冲液(pH8.00.1)配制成0.100,0.312,0.625,1.250,2.500,5.000IU/mL的溶液，作为制备标准曲线的标准工作液，其中1.250IU/mL的溶液作为参考浓度溶液。以上标准工作液均须当日配制。3.2.仪器 培养皿：玻璃或塑料皿，内径为90mm，底部平整光滑，具陶瓦盖； 牛津杯：不锈钢管，内径(60.1)mm，外径(80.1)mm，高度(100.1)mm； 游标卡尺：测量范围0200mm，精度0.02mm； 绞肉机； 均质器：转速不低于10000r/min； 离心机：转速不低于4000r/min； 恒温箱：(361)，搁板必须保持水平； 高压灭菌器； 电热烤箱：(1701)； 恒温水浴锅； 其他：玻璃板、移液管、滴管、离心管等。4.抽样和制样4.1.检验批以不超过2500件为一检验批。同一检验批的商品应具有相同特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。4.2.抽样数量批量，件最低抽样数，件1251261005101250102515001550110001710012500204.3.抽样方法 按规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品，如无小包装或小包装大于2kg，则用灭菌刀具从取出的包装中，每件割取不少于100g作为原始样品。原始样品总量不少于2kg，混合后放入清洁容器内，加封，标明标记，及时送交实验室。4.4.试样制备 从原始样品中取出部分代表性样品，将可食部分放入绞碎机中绞碎，充分混匀，用四分法缩分至不少于500g作为试样。装入清洁容器内，加封后，标明标记。4.5.试样保存 将试样于18以下冷冻保存。注：在抽样及制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。5.过程简述5.1.样液制备 称取10g(精确至0.1g)试样于均质器内，加入磷酸盐缓冲液(pH8.00.1)10.0mL，搅匀，放置60min，以900010000r/min均质2min后，移入离心管中离心30min(4000r/min)，取上清液作为样液。5.2.菌悬液的制备 将试验菌种用营养肉汤于3235培养1824h后，转接至琼脂试管斜面，于3235培养1824h，然后加入适量灭菌生理盐水，将菌苔洗下，制成菌悬液。在4保存，可使用2周。5.3.菌悬液用量的确定 制作检定平板前应先用0.312IU/mL标准工作液对加有不同量菌悬液的平板进行预测试，经培养后能产生直径10mm清晰、完整的抑菌圈的最佳菌悬液用量。5.4.平板制备 于无菌平皿中加入20mL熔化的培养基，保持水平，待其凝固。然后，将锥形瓶中培养基熔化并冷却至4550，加入适量(从5.3预测得)的菌悬液(5.2)，充分混合，取4mL注入上述基层培养基上，均匀覆盖其表面，保持水平，待其凝固。5.5.标准曲线的制备 按照SN 017992中的6.1进行。5.6.测定 每个试样用三个检定平板。如不需定量测定时，在每个平板上，置4只灭菌的牛津杯，对角2只注满样液，剩余的2只分别注满1.250和0.312 IU/mL柱晶白霉素标准工作液；如需定量时，须置6只灭菌的牛津杯，间隔注满样液和1.250 IU/mL(作为参考浓度溶液)柱晶白霉素标准工作液，于(361)培养(171)h。注：如测定结果呈阳性，即所显抑菌圈的平均直径10mm时，必要时，尚需进行确证试验(可用薄层色谱法)，以证明抑菌物确系柱晶白霉素。6.结果计算 如样液抑菌圈的直径10mm，即报告为“阴性”。如样液抑菌圈的平均直径10mm者，则分别测量及算出三个检定平板上1.250 IU/mL标准工作液和样液的抑菌圈直径的平均值。经校正后，于标准曲线上查出样液中相应的柱晶白霉素浓度值。通过式(1)，可得出试样中柱晶白霉素的含量：Xc(1)m式中：X试样中柱晶白霉素含量，IU/g； c由标准曲线上查得样液中柱晶白霉素浓度，IU/mL； m每毫升最终样液所代表的试样量，g。注：如试样中柱晶白霉素含量以mg/kg表示时，可将式(1)所计算得的X值乘以1000/t,t为柱晶白霉素标准品以IU/mg计的效价。7.测定低限、回收率7.1.测定低限 本方法的测定低限为0.312IU/g。7.2.回收率