课题3　血红蛋白的提取和分离

血红蛋白的提取和分离 色谱法又称色谱分析 色谱分析法 层析法 是一种分离和分析方法 色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配 以流动相对固定相中的混合物进行洗脱 混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动 最终达到分离的效果 凝胶色谱法分离蛋白质的原理 1 概念 在一定的范围内 能对抗外来少量强酸 强碱不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用 具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 缓冲溶液 2 作用 能够抵制 的溶液的 的影响 维持PH基本不变 外界的酸或碱 pH值 3 缓冲溶液的配制 通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成 调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液 1 2 使用比例 在不同pH范围内 4 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是 目的是 磷酸缓冲液 利用缓冲液模拟细胞内的pH环境 保证血红蛋白的正常结构和功能 1 概念 指 在 作用下发生迁移的过程 电泳 2 原理 许多重要的生物大分子 如 等都具有 在 下 这些基团会带上 在电场的作用下 这些带电分子会向着与其 移动 电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身 的不同使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 多肽 核酸 可解离的基团 正电或负电 所带电荷相反的电极 带电性质的差异 大小 形状 迁移速度 一定的pH 带电粒子 电场 3 分类 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定 通常用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 其中 不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 蛋白质相对分子质量 分子大小 蛋白质的提取和分离一般分为四步 1 样品处理 收集到血红蛋白溶液 2 粗分离 透析 透析除去分子较小的杂质 3 纯化 通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去 4 纯度鉴定 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 二 实验操作 为什么用猪 牛 羊的红细胞来提取血红蛋白 猪 牛 羊的红细胞无细胞核和众多的细胞器 结构简单 且含丰富的血红蛋白 蛋白质的提取和分离一般分为四步 1 样品处理 血液 血浆 水分 固体物质 血浆蛋白 无机盐磷脂葡萄糖等 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 最多 血红蛋白 两个a 肽链 两个 一肽链 四个亚铁血红素基团 在红细胞的组成中 约90 是血红蛋白 它由四个肽链组成 包括两个 肽链和两个 肽链 每条肽链环绕一个亚铁血红素基团 可携带一分子氧或一分子二氧化碳 血红蛋白因含血红素而呈现红色 血红蛋白 血红蛋白 两个 肽链 两个 肽链 四个亚铁血红素基团 肽链 肽链 亚铁血红素基团 1 洗涤红细胞 洗涤的目的是什么 血液100mL 低速离心2min 红细胞 血浆 重复洗涤3次 直至上清液没有黄色 5倍体积生理盐水 去除杂蛋白 以利于后续步骤的分离纯化 一 样品处理和粗提取 红细胞 洗涤过程 1 洗涤时能用蒸馏水代替生理盐水吗 2 洗涤次数太少 可能有什么后果 3 离心速度过高或时间过长 可能有什么后果 不能 生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂 在未洗净血浆中的杂蛋白之前 红细胞如果提前破裂 就可能使血红蛋白与杂蛋白混在一起 加大了分离的难度 会导致无法除去血浆蛋白 会使白细胞等一同沉淀 达不到分离的效果 2 释放血红蛋白 阅读思考 1 释放血红蛋白过程中 在洗涤好的红细胞加入了哪些物质 2 为了加速释放过程 采取了什么措施 目的分析 蒸馏水的作用是 加入甲苯的作用是 充分搅拌的目的是 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 有机溶剂无色透明的甲苯层 脂类物质白色脂溶性物质沉淀层 血红蛋白溶液红色透明液体 红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物 3 分离血红蛋白 将试管中的液体用 过滤 除去 于 中静置片刻后 分出下层的 脂溶性物质沉淀层 滤纸 分液漏斗 红色透明液体 4 透析 粗分离 将血红蛋白溶液装入透析袋并置于磷酸缓冲液中 pH为7 0 透析12小时 除去分子较小的杂质 目的 二 纯化 凝胶色谱操作 1 凝胶色谱柱的制作 2 凝胶色谱柱的装填 3 样品的加入和洗脱 2 凝胶色谱制作 1 凝胶色谱柱的制作 取长40厘米 内径1 6厘米的玻璃管 两端需用砂纸磨平 底塞的制作 打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网 再用100目尼龙纱包好 100目 即每平方吋100个孔 2 凝胶色谱柱填料的处理 方法 固定 将色谱柱处置垂直固定在支架上 装填 配置凝胶悬浮液 计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀后 配成 一次性的缓慢倒入 内 装填时轻轻敲动色谱柱 使凝胶装填均匀 洗涤平衡 装填完毕后 立即用缓冲液洗脱瓶 在 高的操作压下 用300ml的20mmol l的磷酸缓冲液 pH为7 0 充分 12小时 蒸馏水 凝胶悬浮液 色谱柱 洗涤平衡 50cm 注意 1 凝胶色谱柱的装填时尽量紧密 以降低凝胶颗粒之间的间隙 2 在装填凝胶色谱柱时 不得有气泡存在 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 降低分离效果 调整缓冲液面 打开下端出口 使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐 关闭出口 滴加透析样品 用 将1ml 的样品小心加到色谱柱的 打开出口 样品完全渗进凝胶层 关闭出口 小心加入磷酸缓冲液 打开出口 用磷酸缓冲液洗脱 收集 待 接近色谱柱底端时 用试管收集流出液 每 收集一试管连续收集 吸管 透析液 顶端 5ml 红色的蛋白质