RNA提取 休眠 碳水化合物 基因表达 SSH论文

RNARNA 提取论文 自然休眠期油桃花芽碳水化合物变化规律提取论文 自然休眠期油桃花芽碳水化合物变化规律 及相关基因的表达分析及相关基因的表达分析 中文摘要 本研究以十年生露天和三年生盆栽 曙光 油桃 Prunus persica var nectarine cv Shuguang 花芽为试材 主 要研究了桃树花芽 RNA 提取 碳水化合物代谢及其相关基因的季节 性表达及低温处理下相关基因的表达变化 利用抑制差减杂交技术 SSH 以休眠期花芽 RNA 为 Tester 以休眠解除期花芽 RNA 为 Driver 构建花芽休眠相关基因的差减 cDNA 文库 主要结论如下 1 经改良 CTAB 法提取的油桃花芽 RNA 电泳检测条带清晰 28S 与 18S 亮度比约为 2 1 说明 RNA 完整性较好 核酸分光光度计检测 A 260 A 280 为 2 0 左右 说明无蛋白等杂质残留 能满足基因表 达分析等后续试验的要求 而 Trizol 试剂盒法所提取的 RNA 几乎检 测不到条带 难以达到进一步试验的要求 2 休眠期间可溶性糖 主 要是蔗糖 含量尤其是在内休眠后期显著增加 淀粉含量则呈相反趋 势 在内休眠后期含量降低 预示着内休眠的结束 葡萄糖和果糖含量 稍有降低 变化不大 糖代谢相关基因 AGPase HisH3 HK1 SuSy UGPase 表达明显不同 AGPase 无明显 变化 HisH3 和 HK 英文摘要 RNA extraction of nectarine floral buds and the seasonal expression of carbohydrate metabolism and related genes were examined using ten year old field grown Shuguang nectarine the expression of related genes under low temperature treatment were detected using three year old potted Shuguang nectarine A subtractive cDNA library was developed to study genes associated with the dormant floral buds in nectarine by using the RNA from dormant floral buds as tester and that from burst floral buds as driver The 关键词 RNA 提取 休眠 碳水化合物 基因表达 SSH 英文关键词 RNA extraction dormancy carbohydrate gene expression SSH 目录 自然休眠期油桃花芽碳水化合物变化规律及相关基因 的表达分析 符号缩写及中英文对照 4 10 摘要 10 11 Abstract 11 12 1 引言 13 39 1 1 休眠概述 13 23 1 1 1 休眠的进程与分类 13 15 1 1 1 1 休眠的研究进程 13 14 1 1 1 2 休眠的分类 14 15 1 1 2 休眠机理研究进程 15 18 1 1 2 1 休眠的诱导 15 17 1 1 2 2 休眠的解除 17 18 1 1 3 芽休眠研究 18 23 1 1 3 1 激素调节学说 18 19 1 1 3 2 呼吸代谢途径 学说 19 20 1 1 3 3 光系统控制学说 20 21 1 1 3 4 代谢物的调节学说 21 22 1 1 3 5 基因表达 学说 22 23 1 2 碳水化合物及其相关基因的研究 23 27 1 2 1 碳水化合物及其代谢概述 23 24 1 2 2 碳水化合物代谢相关酶 24 26 1 2 3 休眠过程 中碳水化合物研究 26 27 1 3 木本植物 RNA 提取 27 30 1 3 1 CTAB 法 27 28 1 3 2 热硼酸 法 28 1 3 3 异硫氰酸胍法 28 1 3 4 试剂盒法 28 30 1 4 植物体内差异表达基因的筛选 30 33 1 4 1 mRNA 差异显示技术 30 31 1 4 2 RNA 随机引物聚合酶链式反应 31 1 4 3 代表 性差示分析 31 32 1 4 4 基因表达的序列分析 32 1 4 5 抑制消减杂交 32 1 4 6 基因芯片技术 32 33 1 5 本研究所用方法 SSH 33 38 1 5 1 SSH 技术流程 33 34 1 5 2 SSH 技术体系评价 34 1 5 3 SSH 技术在分离植物差异表达基因中的应用 34 38 1 5 3 1 应用 SSH 技术分离组织特异性表达基因 36 1 5 3 2 应用 SSH 技术分离与次生代谢物合成相关的特异表达基因 36 37 1 5 3 3 应用 SSH 技术分离与诱导型表达有关的 抗性相关基因 37 38 1 5 3 3 1 生物胁迫诱导的差异 基因研究 37 38 1 5 3 3 2 非生物胁迫诱导的差异基 因研究 38 1 6 研究目的与意义 38 39 2 材料与方法 39 54 2 1 实验材料与处理 39 2 2 测定方法 39 42 2 2 1 自然休眠进程的确定 39 40 2 2 2 RNA 提取 40 41 2 2 2 1 改 良 CTAB 法 40 41 2 2 2 2 Trizol 试剂盒法 41 2 2 3 荧光定量表达分析 41 2 2 4 碳水化合物的测 定 41 42 2 3 抑制差减杂交技术 42 53 2 3 1 总 RNA 提取 42 43 2 3 2 去除基因组 DNA 43 2 3 3 mRNA 的纯化 43 44 2 3 4 cDNA 差减文库构建 44 53 2 3 4 1 cDNA 第一链的合成 44 45 2 3 4 2 cDNA 第二链的合成 45 2 3 4 3 Rsa 酶切 45 46 2 3 4 4 接头的连接 46 48 2 3 4 5 第一轮杂交 48 2 3 4 6 第 二轮杂交 48 49 2 3 4 7 第一次 PCR 反应 49 50 2 3 4 8 第二次 PCR 反应 50 51 2 3 4 9 应用 T A 克隆法构建正反向差减文库 51 52 2 3 4 9 1 PCR 反 应产物的纯化 51 2 3 4 9 2 差减 cDNA 片段与 pEASYTM T3 Cloning TransGen Biotech 载体连接 51 52 2 3 4 9 3 连接产物的转化 52 2 3 4 9 4 差减 cDNA 文库的构建 52 2 3 4 10 DNA 测序和序列分析 52 53 2 4 数据处理 53 54 3 结果与分析 54 62 3 1 桃芽自然休眠进程的确定 54 3 2 RNA 质量检测 54 55 3 3 休眠期间碳水化合物含 量变化 55 56 3 4 与碳水化合物代谢有关的基因的表 达变化 56 57 3 5 低温条件下有关基因的转录表达变 化 57 58 3 6 SSH 结果分析 58 62 3 6 1 改良 CTAB 法提取 RNA 58 3 6 2 双链 cDNA dscDNA 合成与 Rsa 酶切效率检测 58 59 3 6 3 两次 PCR 产 物分析 59 60 3 6 4 差减文库的构建及阳性克隆的筛 选 60 3 6 5 测序及功能分类 60 62 4 讨论 62 66 4