左旋多巴偶联物的记忆力增强效果研究计划书.doc

左旋多巴偶联物的记忆力增强效果研究计划书 左旋多巴偶联物的记忆力增强效果研究计划书Research Proposal生物技术唐浩能13335155目录 一、研究目的通过设计、甄选合适的偶联分子，使得左旋多巴偶联物能最大限度地靶向脑区，减少其副作用，从而在代价最低的条件下提高记忆力。 二、研究意义本药物的预期效果是能够提高在短时间内（几小时到一天）的记忆力，而非永久提高。 因此本药物不能作为阿尔兹海默症的根治药物，而只能针对有短期内记忆大量知识需求的某些人群。 本药物适应面广，且通过偶联分子极大降低副作用后，有更高的安全性。 三、研究背景中枢脑区中的杏仁体和海马尽管分别独立地支持情绪记忆和陈述性记忆，但这两个系统也可以一起工作。 最明显的一个例子是，能引起情感反应的事件特别容易被记住。 研究表明，受试者对能引起情感反应的材料的记忆几乎总是比对中性材料的记忆要好得多。 美国加州大学欧文分校的麦高夫及其同事发现，动物接受简单任务的训练之后，如果将某些激素注射到动物体内，他们对训练内容的记忆会变得更好。 这些激素包括肾上腺激素、ACTH和皮质酮，通常是在紧急情况或突发事件时被释放进入血液循环，所以又被称为应激激素。 这些应激激素能够激活杏仁体的神经元，加强杏仁体到海马以及杏仁体到大脑皮层的神经通路的活动，从而对陈述性记忆的巩固产生重要的影响。 卡希尔、麦高夫等人1让8位受试者分别看不带感情色彩的中性电影片段和具有情绪压抑效应的电影片段，同时用正电子断层扫描术（PET）检测受试者大脑的葡萄糖代谢。 脑内葡萄糖代谢与神经元活动呈正相关性大脑什么区域活动越强，这个区域消耗葡萄糖就越多。 三周后，在无任何提示的情况下，检测受试者对电影片段的记忆保持情况。 结果表明，所有受试者对感情色彩强烈的电影片段的记忆要比对中性电影片段的记忆好得多。 有趣的是，受试者观看电影片段时其右侧杏仁体的代谢活动强度与他们后来能回忆起的感情色彩强烈的电影片段的数目呈正相关。 因此，学习时杏仁体活动越强，对具有情感内容的陈述性记忆的增强作用也越强。 中脑腹侧被盖区一直被认为是大脑的奖赏系统1，它是多巴胺神经元胞体所在部位。 这些神经元发出的纤维经内侧前脑束到达脑的许多区域。 比如，它能发出神经元到达杏仁体与海马等脑区。 临床上用于治疗帕金森疾病的药物左旋多巴作为多巴胺的前体物质，可以通过血脑屏障。 因此可以在脑区经脱羧基作用生成多巴胺，作用于大脑中脑腹侧被盖区和杏仁体区域的神经元，通过激活与正面情绪（欣快、愉悦）相关的神经元，在引起使用者正面情绪的同时，通过杏仁体与海马之间的神经元联系，加强海马区域神经元对使用者当时所正在记忆的内容的巩固过程。 同时，左旋多巴还作为去甲肾上腺素的前体物质，通过生成去甲肾上腺素参与了注意力维持。 德国研究人员xx.11.8日称2，大脑内的神经传递物质多巴胺有助于提高记忆力，这一发现或有助于阿尔茨海默氏症的治疗。 多巴胺是一种神经传递物质，多巴胺不足或失调可导致手脚颤动，乃至罹患帕金森氏症。 多巴胺还主要负责传递兴奋及开心的信息，因此又被称为“快乐荷尔蒙”。 德国神经退行性疾病中心和马格德堡大学的研究人员将年龄介于65岁和75岁间的受测对象分为两组，一组服用可在大脑中转化为多巴胺的L-多巴，一组服用安慰剂作为对照。 数小时后，研究人员让他们参与记忆测试，结果显示，服用L-多巴的一组老人在重新识别6小时前看过的照片时更胜一筹。 研究人员认为，这证实了多巴胺有助于提高记忆力的猜测，本项研究有助于研发提高记忆的药物。 图1功效分子有效性文献图2中等剂量的左旋多巴能够提高记忆正确率图3左旋多巴组记忆效果明显高于安慰剂组然而，经多年临床使用，发现左旋多巴有一定的外周性不良反应和中枢性不良反应。 如恶心、呕吐、心悸、气喘、气促以及异常不自主运动等。 四、技术路线为了减少左旋多巴所引起的外周性不良反应，我们采取经鼻腔给药方式以及将左旋多巴与脑靶向分子偶联的方式。 封闭左旋多巴的多巴胺脱羧酶作用位点，使得左旋多巴在到达脑内靶点前无法独立解离开来，也就无法变为多巴胺产生作用，外周不良反应将得到根本性的解决。 图4抗体偶联左旋多巴因此，设计、甄选合适的脑靶向分子就成了我们研究的关键。 为此，我们分别针对四种候选脑靶向分子设计了四条独立的技术路线。 当任何一条研究失败时，都可选择其他三条路线将研究进行下去。 1基础技术路线靶向VMAT2的单链抗体为了实现特异性的脑靶向，我们寻求一种合适的分子作为抗原，这种抗原需要在生理条件下特异性地分布于中枢脑区，从而使得我们设计的抗体能够特异性地靶向脑区。 经过我们的资料查阅，我们发现多巴胺能神经元内的单胺囊泡转运体VMAT2是一种理想的抗原。 1.1.2VMAT2单胺转运体蛋白的制备神经元通过胞吐作用释放单胺类物质的过程依赖VMAT介导分泌囊泡摄取单胺类递质。 分子克隆技术鉴定表明:VMAT1主要在外周组织中表达,参与外周单胺类递质转运的调节;VMAT2则主要在脑内表达,VMAT2决定了细胞内单胺类递质的贮存部位,并认为与中枢单胺类递质及相关神经心理性疾病的调节有关。 囊泡单胺转运体的结构3研究表明,VMAT是结合于膜上的糖蛋白,相对分子质量约在6510385103。 VMAT1具有约521个氨基酸,VMAT2具有约518个氨基酸,不同种属的VMAT相对分子质量和氨基酸数略有差异。 对大鼠VMAT序列的疏水性分析表明:VMAT都具有12个跨膜螺旋区,N-末端和C-末端位于胞质。 囊泡基质中的环上存在N-连接的糖基化作用位点，位于跨膜区1和2之间。 这一模式结构可适用于各种的VMAT1和VMAT2的结构中。 可变性最大的部分为N-和C-末端的部分以及巨大的糖基化环。 例如,在这个环上,VMAT1和VMAT2的同源性只有22%;另一方面,一些跨膜区相当保守,在那些区域一些带电的氨基酸很稳定。 图5人VMAT22D结构图图6小鼠VMAT23D结构图囊泡单胺转运体的分布3有人应用多克隆抗体对VMAT1和VMAT2在大鼠和人脑中的分布进行了研究。 结果表明VMAT1主要分布在大鼠的内分泌和旁分泌细胞(嗜铬细胞、肠的嗜铬粒蛋白A阳性细胞、肠嗜铬细胞和颈上神经节多巴胺能SIF细胞),而在成年脑内不表达。 VMAT2则在脑内的多巴胺能、去甲肾上腺素能、肾上腺素能、5-羟色胺能以及组胺能神经元中都有表达,在交感神经中也有表达。 另外,在胃壁黏膜层的多巴胺能嗜铬粒蛋白A阳性细胞和肠嗜铬细胞样细胞中也有VMAT2的表达。 在人类中也有类似的结果,VMAT1只在神经内分泌细胞包括嗜铬细胞和肠嗜铬细胞中表达,VMAT2则在中枢以及外周神经系统中都有表达。 在中枢神经系统,VMAT2在尾壳核、伏隔核、黑质、被盖腹侧区、蓝斑、中缝核群和孤束核有高表达,在中脑、脑干腹侧部、下丘脑和嗅球都有表达,在大脑皮质亦有少量表达。 囊泡单胺转运体的生理功能3VMAT具有以下明显的特性:对5-羟色胺、多巴胺和肾上腺素的摄取具有广泛的选择性;利舍平和丁苯那嗪对其转运有特定的抑制作用;对单胺的转运依赖于跨膜H+-电化学梯度。 各种循环细胞通过特定的浆膜转运体(如多巴胺转运体)摄取单胺类递质,并在VMAT的帮助下将其储存于分泌囊泡。 VMAT位于突触囊泡膜上,从胞质转运单胺类递质入囊泡贮存以便释放至突触间隙。 VMAT利用囊泡内的质子交换胞质的单胺,此转运的能量囊泡膜上的H+-ATPase产生的跨囊泡膜的pH梯度。 H+-ATPase主动的将质子沿着pH梯度泵入囊泡,囊泡里产生高质子浓度和低pH值,囊泡内的低pH值有助于单胺稳定的贮存。 单胺类递质包括多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺和组胺。 在单胺能神经末梢,重摄取占释出总量的3/4,为单胺能神经递质终止其生理作用的主要方式,既保证了突触传递的灵活性,又符合生物学经济原则。 VMAT1在外周组织清除单胺入囊泡(如肾上腺髓质),VMAT2则清除单胺类递质入脑内的突触囊泡。 VMAT2的功能对于囊泡Ca2+依赖的量子化释放非常重要。 VMAT2通过携带多巴胺进入突触囊泡和调节随后的释放而在多巴胺的贮存和释放中起关键作用。 一旦多巴胺进入突触前神经末梢,它就被VMAT2转运入小囊泡。 当神经冲动到达末梢时,细胞膜对Ca2+通透性改变,Ca2+进入细胞产生兴奋释放偶联,使囊泡与突触前膜融合,然后胞裂而将囊泡内的单胺类递质以量子释放至突触间隙,一个突触小泡内的递质代表一个量子单位。 确认选择VMAT2作为靶向抗原后，我们选择用哺乳动物细胞生产VMAT2蛋白，这是因为VMAT2蛋白的正确糖基化对于与抗体的结合非常重要。 1.2.单链抗体的筛选在生产了VMAT2蛋白作为抗原后，我们将设计针对VMAT2的抗体。 由于经鼻给药方式存在分子量大小的限制4，我们考虑设计分子量尽可能小的单链抗体（约200个氨基酸）作为偶联物，同时降低药物在体内的免疫原性。 我们使用M13噬菌体展示免疫了VMAT2蛋白的小鼠的单链抗体库，并从中筛选出与VMAT2蛋白有较强亲和力的单链抗体，经ELISA试验验证其与VMAT2的相互作用后，将展示有理想单链抗体的噬菌体转移感染无琥珀突变抑制的大肠杆菌菌株，直接少量生产单链抗体。 1.3.左旋多巴与单链抗体的偶联反应左旋多巴是酪氨酸衍生物，具有氨基基团，而单链抗体上的肽链末端也同样具有氨基基团，因此我们选择酸敏感性接头-羧酸酰胺或Cis-acotinyl amide5偶联左旋多巴与单链抗体，使得左旋多巴偶联物只有到达多巴胺能神经元突触囊泡内的酸性环境下才能释放出左旋多巴，而在血浆中性pH环境下则处于稳定状态，无法生成多巴胺作用于外周神经元，从而避免了外周性不良反应的发生。 图7酸敏感性酰胺接头的化学式与降解产物偶联反应实质上为酰胺键的合成反应，可通过酰胺键合成的化学反应实现，但此时会产生与目标产物相差一个酰胺接头分子量大小的杂质，因此我们选择用气相色谱或高效液相色谱法分离目标产物，联用质谱鉴定目标产物。 1.4.-环糊精包合药物及水凝胶的制备纯化得到偶联药物后，为了增加偶联药物的亲水性，以期更好地透过嗅粘膜，并防止药物过快地被嗅纤毛清除，增加药物的滞留时间，同时防止鼻粘膜上的酶对单链抗体可能的酶解作用，我们将用-环糊精包合偶联药物，并制备成水凝胶状。 2备选技术路线一靶向VMAT2的多肽假如基础技术路线所得到的左旋多巴偶联单链抗体由于分子量偏大，不能有效经鼻腔入脑，那么我们将考虑实施备选技术路线一。 此路线选择多肽而非单链抗体作为偶联分子，分子量（环七肽或十二肽）远远小于单链抗体，更易透过嗅粘膜，但由于分子量小，可能与VMAT2上糖基链的亲和力不高，特异性靶向作用不强。 在同样用哺乳动物细胞生产了VMAT2蛋白作为抗原后，我们选用环七肽或十二肽的噬菌体展示系统筛选与VMAT2蛋白有较强亲和力的环七肽或十二肽，这两种随机肽库展示系统相比于同样常用的七肽展示系统而言，更容易形成有空间结构的多肽，这增强了与VMAT2蛋白上的糖基链的结构匹配程度，从而提高了亲和力。 后续路线与基础技术路线相同。 3备选技术路线二高效靶向脑区的环七肽中国科学技术大学的研究组xx年筛选出了一种能高效经鼻腔靶向脑区的环七肽6，这种环七肽的中枢脑区靶向率可达到50%以上，远远大于正常小分子药物经鼻腔给药后的脑区靶向率10%。 且研究组证明，该环七肽确实是通过嗅球通路入脑的。 但该环七肽到底是作用于何种受体实现经鼻入脑的机制尚不明确。 因此，该环七肽有高效的脑区靶向特异性，但不确定是否有良好的中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元靶向特异性。 图8高效靶向脑区的环七肽的相关文献图9该环七肽中枢脑区靶向率可达到50%以上因此我们可以考虑直接用大肠杆菌生产该环七肽，用于偶联左旋多巴。 而后续路线与基础技术路线相同。 4备选技术路线三叶酸介导的脑靶向除了多肽和单链抗体外，有美国研究者还发现叶酸（维生素B9）及其衍生物能介导与其偶联的分子经鼻腔入脑7。 但靶向效率不明，具体作用机制也未研究清楚。 然而，由于该小分子是四条技术路线的偶联分子中分子量最小的一个，生产出来的整个左旋多巴偶联物相对分子质量仅为660Da，能毫无障碍地通过嗅粘膜，且维生素B9是人体必需物质，释放出左旋多巴后剩下的部分分子安全性高，所以这一路线也值得考虑。 图10叶酸介导经鼻腔入脑的相关专利图11叶酸化学式从叶酸化学式中可知，叶酸仅含有一个氨基基团，同样可以用合成酰胺键的化学反应偶联酰胺接头和左旋多巴，因此后续路线与基础技术路线相同。 5记忆力增强效果评价与安全性评价实验生产出左旋多巴偶联物药物后，我们将通过Morris水迷宫实验评价药物增强记忆力的效果，通过大脑神经细胞水平上的毒性检测实验、凋亡检测实验以及整体动物水平上的FOB及改良Irwin实验、在体心电描记遥测技术、呼吸感应体积描记法遥测技术（RIP）、主动皮肤过敏实验（ACA）综合评价药物的安全性。 其中，细胞毒性检测实验包括通过ELISA法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、中枢型髓鞘碱性蛋白（MBP）、钙结合蛋白S-100三种毒性生物标志物的浓度来分别揭示药物对大脑神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞的损伤程度8。 凋亡检测实验包括通过MTT法、TUNEL法、流式细胞术检测神经元凋亡，Real-time PCR检测凋亡相关基因Bcl- 2、Bax、Survivin的mRNA水平变化，Western blot测定Bcl- 2、Bax、Survivin及Cyto-C的蛋白表达9。 但由于这些方法都是对细胞凋亡水平上的检测，因此选择其中一种即可，首选MTT法。 而且，细胞毒性检测实验相比于凋亡检测实验，更能敏感地反应药物的毒性作用，因此如果资金和时间有限，可只进行细胞毒性检测实验。 整体动物水平的检测实验中，FOB及改良Irwin实验是检测中枢性的副作用，在体心电描记遥测技术检测心血管系统副作用，呼吸感应体积描记法遥测技术（RIP）检测呼吸系统副作用，而主动皮肤过敏实验（ACA）则是评价药物的免疫原性。 虽然偶联药物由小分子左旋多巴和大分子蛋白或多肽组成，但左旋多巴是经过多年临床使用的药物，因此不需要再进行遗传毒性和生殖毒性的检测评价，只需进行大分子蛋白或多肽的免疫原性检测实验即可。 五、材料与设备1主要试剂和人胚肾细胞HEK293T ATCC高糖DMEM培养基Hyclone胎牛血清Hyclone ViraPowerHiPerform慢病毒蛋白表达系统Life TechnologiesVMAT2cDNA的表达载体GeneCopoeia噬菌粒pCantab5E GE辅助噬菌体M13KO7GE大肠杆菌TG1菌株NEB大肠杆菌HB2151菌株NEB人源抗E tag抗体GE HiTrap Protein G HP亲和层析柱GE Ph.D.噬菌体环七肽、十二肽库展示试剂盒NEB2主要仪器气相色谱/高效液相色谱仪中山大学测试中心质谱仪中山大学测试中心以上部分实验材料，如HEK293T细胞，慢病毒表达试剂盒等，可尽量向中大生科院相关老师求得，节约研究成本。 六、具体实验方法与方案1VMAT2蛋白与VMAT1蛋白的生产1.1.工程细胞株的选择人胚肾细胞HEK293T T我们设计单链抗体的靶点是VMAT2蛋白上糖基链环，因此，工程细胞中表达的VMAT2蛋白的糖基化是否符合人体内天然糖基化的状态非常重要。 与低等真核生物和细菌表达系统相比，哺乳动物细胞株的主要优势在于其重组蛋白的糖基化形式与人类相似10。 哺乳动物的N-聚糖以复合型和杂合型为主(图12-A、B)，而酵母则为高甘露糖基化(图12-C)。 不同的哺乳动物细胞株之间其糖基化形式也不完全相同。 例如，人体细胞一般不表达-1，3半乳糖基转移酶(-1，3-GalT)，因此会对被-1，3-半乳糖修饰的糖链起免疫反应。 许多小鼠细胞表达系统，包括杂交瘤细胞生产的人源化抗体都含有-1，3-半乳糖。 另外有研究表明，pH、溶氧浓度(DO)、温度、代谢副产物和细胞培养方式等外环境也会影响蛋白的糖基化形式。 图12糖蛋白的不同糖基化形式中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和人类胚胎肾细胞(HEK)都是现今最为常用的哺乳动物细胞株，其他细胞株，如幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠骨髓瘤细胞(NS0)和人视网膜细胞(PERC.6)等都在进一步研究和开发中。 293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。 用Ca3(PO4)2转染效率可高达50%。 考虑到要使表达的VMAT2蛋白能够正确糖基化，且不会在寡糖链末端加上-1，3-半乳糖，因此我们决定选择人胚肾细胞HEK293T来生产VMAT2蛋白。 人胚肾细胞HEK293T的复苏、传代培养和接种铺板方法见12。 1.2.T VMAT重组载体的构建、转染与转化子的筛选首先从GeneCopoeia公司购得含有人VMAT2的cDNA的表达载体。 理论上该重组载体可以直接转染HEK293T细胞，但根据前人经验，化学转染法和物理转染法都很难有效转染HEK293T细胞，且目的基因很低概率会整合进染色体，实现稳定转染。 然而慢病毒介导的生物转染法基因转染效率高，且在慢病毒基因编码的整合酶作用下，能实现目的基因高效的稳定转染11。 因此，我们用限制酶切割使VMAT2重组载体线性化，所使用的限制酶不能在VMAT2基因内部含有识别位点，经Serial Cloner1.3-11软件查询，VMAT2基因内部不含有以下限制酶切位点。 线性化后的重组载体与慢病毒载体进行连接，后续在大肠杆菌DH5a感受态菌株扩增、磷酸钙法初步转染HEK293T、慢病毒转染HEK293T、阳性转化子的筛选的具体方法见12。 图13VMAT2基因内部所有的限制酶切位点情况1.3.产物的分离纯化由于表达出来的VMAT2蛋白含有6*His tag，因此我们选用固化Ni+吸收色谱分离纯化VMAT2蛋白13。 VMAT1蛋白的生产同VMAT2蛋白。 1.4.嵌合VMAT 2、VMAT11蛋白的脂质体的获得分离纯化后的VMAT蛋白溶液，加入20%的Triton X-100，即得。 Triton X-100是一种非离子表面活性剂，非离子型去污剂和离子型不同，它们的头端基团是没有极性的亲水基团。 由于比较温和，它们可以破坏蛋白质-脂质以及脂质-脂质之间的连接，但是不能破坏蛋白质-蛋白质的连接，因此大多非离子去污剂不能使蛋白质变性。 这种去污剂可以使蛋白质溶解和分离，但却保留了蛋白质的天然构象、功能以及它们的相互作用。 所以我们选择Triton X-100溶解膜蛋白VMAT 2、VMAT1。 用TritonX-100溶解的VMAT蛋白可能有两种情况第一种情况TritonX-100形成双层膜，VMAT嵌合在里面，这时有三种嵌合方式糖基链全向外，糖基链部分向外，糖基链全向内。 图14VMAT蛋白的三种可能嵌合方式第二种情况TritonX-100不能形成双层膜，仅是吸附在VMAT2蛋白的疏水氨基酸上。 图15TritonX-100吸附于VMAT2蛋白疏水氨基酸VMAT蛋白溶解状态两种可能的不同情况会影响到后续噬菌体展示时不同的筛选步骤，所以这里事先作个说明。 2噬菌体展示单链抗体文库的构建与筛选采用Trizol试剂（酸性酚-硫氰酸胍-氯仿提取法13）提取VMAT2蛋白溶液腹腔注射后恢复期小鼠脾组织的总RNA，用Oligo-dT纤维素层析法13纯化获得总mRNA，逆转录13成cDNA，根据文献16（表1），针对小鼠抗体轻链和重链可变区基因设计一系列特异性引物，以合成的总cDNA为模板，PCR扩增13得到抗体轻链和重链可变区基因库，再通过重叠延伸PCR（splicing byoverlap extensionPCR，SOE-PCR）将轻链和重链拼接得到scFv文库14，将scFv文库用SfiI和NotI双酶切后，插入pCantab5E M13噬菌粒（图16），转染入大肠杆菌菌株TG1（含有琥珀突变抑制supE基因）后，加入M13KO7辅助噬菌体进行包装，先用VMAT1蛋白负筛选，再以VMAT2蛋白抗原进行4轮淘选，建立VMAT2蛋白抗体scFv噬菌体文库。 这部分的具体实验方法也可参见15。 而关于丝状噬菌体、噬菌体展示技术、辅助噬菌体M13KO7的理论介绍可参见13。 表1小鼠lgG重链、轻链、轻链可变区mRNA的引物上表中的引物不需要都合成，只需选择所占比重较大的一些基因的mRNA，针对那些来设计引物即可。 图16Pcantab5E噬菌粒图谱在用VMAT2蛋白作为抗原进行筛选时，基于其两种可能的溶解状态，筛选步骤也迥异。 具体是哪种溶解状态需要在实验中进行探究验证。 如果是第一种溶解状态，即形成双层膜的嵌合体结构的话，则我们需要进行一下两步来筛选（6*His tag在VMAT蛋白C端）固化Ni+亲和结合糖基链部分向外，糖基链全向内的嵌合脂质体，收获洗脱下来的是糖基链全向外的嵌合脂质体，此时先用聚苯乙烯板吸附固定17-18，再用单链抗体库进行筛选（接触-淘洗-扩增循环）。 如果是第二种溶解状态，即TritonX-100仅是吸附在VMAT2蛋白中间的疏水氨基酸周围，此时只需一步固化Ni+亲和吸附VMAT2进行固化，便可直接进行噬菌体展示系列筛选。 最后将富集到的噬菌体送交商业公司进行插入片段测序。 pCantab5E噬菌粒的5测序引物及序列:pCantab5-R1:atgattacgaagctttggag。 3测序引物及序列:pCantab5-R2:cgatctaaagttttgtcgtcttt。 3单链抗体的少量生产将富集到的噬菌体转移感染大肠杆菌HB2151菌株，由于此菌株不含有琥珀突变抑制基因supE19，所以表达的单链抗体无法与g3p融合，而是以C端带有E tag的单链抗体形式分泌出来。 随后用人源抗E tag抗体和HiTrapProteinGHP亲和层析柱（GE公司）分离纯化。 图17外源蛋白展示于噬菌体gIIIp上204左旋多巴与单链抗体的偶联由于左旋多巴含有一个氨基基团，酸敏感酰胺接头含有两个羧基基团，单链抗体也含有氨基基团，因此偶联反应实际上是酰胺键合成的化学反应，根据文献21，酰胺键合成目前比较高效的方法是硼化合物催化的直接酰胺化反应，其中2-碘5-甲氧基苯硼酸作为催化剂催化活性最高22。 图182-碘5-甲氧基苯硼酸可能的催化机理但由于左旋多巴和单链抗体都含有羧基和氨基，有可能在催化剂作用下直接酰胺化，这样所形成的杂质与目标产物分子量大小仅仅相差一个酸敏感酰胺接头（约110Da），差别非常小，用传统分离方法难以分离，因此我们将使用中大南校区测试中心的气相色谱或高效液相色谱仪与质谱仪联用进行分离并鉴定。 5噬菌体展示环七肽、十二肽库筛选购买NEB公司的Ph.D.噬菌体环七肽、十二肽库展示试剂盒，根据内含的使用手册进行实验，此展示噬菌体无需辅助噬菌体。 此部分的具体研究方法也可参见23。 6CTTPHAWLC环七肽的生产在此环七肽前加入精氨酸Arg、6*His标签，即HHHHHHRCTTPHAWLC多肽，转换成对应的DNA序列，再在两端加上限制酶识别序列、起始密码子和终止密码子，委托商业公司合成序列后，重组进pET质粒载体，在大肠杆菌中表达。 通过NiNTA法纯化，并用测序级梭菌蛋白酶（Arg-C内切蛋白酶）特异性酶促裂解24，得到环七肽。 7-环糊精包合技术通过包合技术形成的一类独特形式的络合物称为包合物。 环糊精包合物是近十几年来发展起来的一种新剂型,是利用环糊精大分子的环状中空圆筒型特殊结构,将药物分子全部或部分包裹于其中形成的一类非共价键络合物。 具空穴结构、起包容作用的成为主体分子,被包容的称为客体分子。 环糊精是目前应用最多的包合物主体分子,是由淀粉经酶解环合得到的由6个以上葡萄糖分子以a-1,4糖苷键连接的环状低聚糖化合物。 环糊精是一种水溶性、非还原性、不易水解的白色结晶粉末,含羟基,呈亲水性,对酸不稳定,对碱热及机械作用较稳定。 具有环状空筒的特殊结构,可以包合很多小分子物质如卤素、稀有气体、有机及无机化合物等,被包合物质的稳定性、挥发性、溶解性、分散性等均会发生相应改变。 根据其聚合度,有a-CD，-CD，-CD三种,分别由 6、 7、8个葡萄糖分子构成环状结构。 由于葡萄糖分子数量不同,形成的筒状空间大小有区别,对客体分子的容纳能力不一致,水溶解度等理化性质有很大差别,以-CD空洞大小适中,水中溶解度最小,最易从水中析出结晶,随着水温升高溶解度增大等性质,对包合物的制备提供了有利条件。 目前我国工业生产和应用的,大部分以-CD为主。 -CD为白色结晶性粉末,分子量1135,熔点300-305，是由7个葡萄糖分子以糖苷键连接构成的截头圆锥形体,有一个中空的内腔,葡萄糖残基上的羟基主要分布在腔的外围,糖苷键氧原子位于腔体中部,腔内疏水,腔外亲水。 正由于这一特性,对亲脂性药物有包合和增溶作用。 -CD经动物实验证明毒性很低。 美国采用大鼠每日口服0. 1、0. 4、1.6g/kg,经6个月的慢性毒性试验,未显示毒性。 包合物的常用制备方法主要有饱和水溶液法重结晶或共沉淀法、超声波法、研磨法、冷冻千燥法、喷雾干燥法和溶液-搅拌法等25。 偶联药物/-环糊精包合物的的具体制备方法参见26。 8壳聚糖环糊精包合物温敏水凝胶的制备水凝胶是由含有大量亲水基团的聚合物形成的三维网络结构。 完全溶胀的水凝胶柔软、圆滑，与水和组织液有较低的界面张力。 较高的含水量使得水凝胶与大多数活体组织相一致，而且水凝胶粘弹性的特征能够减小植入后对周围组织的伤害，这就使得水凝胶成为生物医药领域如药物载体、组织工程的理想材料。 将偶联药物制备成包合物,以凝胶方式通过鼻腔黏膜给药有很多优点 一、防止药物被鼻黏膜上的酶降解,使给药部位保持高的药物浓度。 二、持续释放被包封药物,有长效缓释作用。 三、有生物黏附性,特别是正电荷包合物生物黏附性强,鼻腔给药能减少药物被黏膜纤毛的清除,提高生物利用度等优势。 由于凝胶中的二甲基-环糊精是良好的促透剂,可以降低药物对鼻黏膜毒性,增加药物通过鼻黏膜吸收。 包合物粒径在0.2-20微米的粒子可分布在鼻腔吸收部位的前部,并能进一步被气流、纤毛或膜扩散作用引入部位后部,药物在转运过程被鼻黏膜吸收。 近年来有研究发现，壳聚糖-甘油磷酸钠水凝胶以其温敏性、良好的生物相容性、优越的机械性能等优点成为医药学领域的首选材料。 壳聚糖基水凝胶主要是亲水性的，它能与亲水性的-环糊精包合物相融，而-环糊精外部亲水，内部疏水，内部包合了偶联药物。 当温度低于37时，CS/-CD温敏水凝胶呈流动状态，在37下保温一段时间后就变成不流动的固体凝胶。 CS/-CD温敏水凝胶的具体制备方法参见27。 9Morris水迷宫实验具体实验方法参见28。 10细胞毒性检测实验从孕18-19天的小鼠腹部取出胎鼠，小心分离大脑，建立体外原代小鼠大脑神经细胞培养模型29-30。 神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)是参与糖酵解途径的烯醇化酶中的一种，特异性存在于神经元和神经内分泌细胞的胞质中。 正常体液中NSE含量甚微。 在中枢神经元受到损伤后，NSE从细胞内释放入脑脊液（CSF）和血液，故NSE是检测中枢神经元损伤的敏感指标。 NSE不仅在受伤早期迅速表达，而且是一个非常灵敏的指标。 髓鞘碱性蛋白（MBP）分为中枢型和外周型两种。 中枢型存在于中枢神经系统，由少突胶质细胞合成和分泌。 周围神经损伤后的变性和再生在一定程度上表现为脱髓鞘和髓鞘再形成。 在神经组织发生脱髓鞘改变时MBP会显著上升，MBP检测可作为反映有无脱髓鞘改变的一个特异指标。 S-100是一种低分子量高酸性的钙结合蛋白，亚基主要存在于中枢神经系统星形胶质细胞和少突胶质细胞中，是神经胶质的标记蛋白。 因此，我们通过ELISA法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、中枢型髓鞘碱性蛋白（MBP）、钙结合蛋白S-100三种毒性生物标志物的浓度来分别揭示药物对大脑神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞的损伤程度。 11凋亡检测实验MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。 其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。 二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在540或720nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。 在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 12整体动物水平的检测实验FOB及改良Irwin实验、在体心电描记遥测技术检测、呼吸感应体积描记法遥测技术（RIP）具体方法和检测指标参见8。 表2FOB实验检测指标主动皮肤过敏试验具体方法参见8。 表3ACA评分标准 七、参考文献1寿天德.神经生物学第三版M.北京高等教育出版社，xx,p359,p334,p399.2Emrah Dzel，Nico Bunzeck,Raymond JDolan.Dopamine modulatesepisodic memorypersistence inold ageJ.J Neurosci.xx,32 (41):1419314204.3任今鹏,蒋雨平.囊泡单胺转运体的研究进展J.中国临床神经科学,xx.12 (1):89-90.4Hongbing Wu,Kaili Hu&Xinguo Jiang.From noseto brain:understanding transportcapacity andtransport rateof drugsJ.Expert Opinionon DrugDelivery,xx,5 (10):1159-1168.5Manju Kanamala,William R.Wilson,Mimi Yang.Mechanisms andbiomaterials inpH-responsive tumourtargeted drugdelivery:A reviewJ.Biomaterials,xx,85:152-167.6Xiao-Mei Wan,Yong-Ping Chen,Wen-Rui Xu.Identification ofnose-to-brain homingpeptide throughphage displayJ.peptides,xx,30343350.7Hussain AA,Dittert LW,Traboulsi A.Brain deliveryof folicacid forthe preventionof Alzheimers diseaseand stroke.US6369058;xx8彭双清，郝卫东.药物安全性评价关键技术M.北