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SRAP-RAPD实验操作流程1酶类及试剂Taq DNA聚合酶为大连宝生物工程公司产品；蛋白酶K为Merk公司产品；T4DNA连接酶为Promega公司产品。Wizard DNA Clean-up System、WizardTM PCR Preps DNA Purification System为Promega公司产品；小量基因组DNA抽提试剂盒、UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒为上海生物工程公司产品。DL-2000 DNA Size marker为大连宝生物工程公司产品，100bp DNA Size marker由广州普博馈赠。2培养基LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加800mL去离子水充分溶解，用1mol/L的氢氧化钠溶液调整pH为7.27.4，加去离子水定容至1000mL，分装后15磅高压蒸汽灭菌1520min，4保存备用。LB固体培养基：于LB液体培养基中加1.6%的琼脂粉，15磅高压蒸汽灭菌1520min，待其冷却至70左右时倒板，凝固后4保存备用。LB选择培养基：在LB液体培养基中加1.6%的琼脂粉，15磅高压蒸汽灭菌1520min，待其冷却至50左右时，加入氨苄青霉素（Amp）（终浓度1000IU/ mL）轻轻摇动使其混合均匀，迅速分装至无菌平皿，室温凝固后4保存备用。3 缓冲液及其它溶液按分子克隆实验指南（第三版）（萨姆布鲁克等，2002）介绍的方法进行。（1）Tris-Cl（pH8.0） Tris碱 121.1g 浓盐酸 42mL加去离子水定容至1000mL（2）TE缓冲液（pH8.0） 10mol/L Tris-Cl（pH8.0） 1L0.5M EDTA（pH8.0） 0.2L加无菌去离子水定容至100ml，混匀，分装后经高压灭菌，4保存。（3）5TBE缓冲液Tris 54g 硼酸 27.5g EDTA 3.72g加去离子水定容至1000mL（4）10TBE缓冲液 Tris 54g 硼酸 27.5g EDTA（0.25mol/L） 80L加去离子水定容至500mL（5）X-gal液（20mg/mL） X-gal 0.08g 二甲基甲酰胺 4mL 充分溶解混匀，分装于1.5mL灭菌消毒的Eppendorf管中，用锡箔纸包裹以避光，-20保存。 （6）IPTG液 IPTG 0.6g 去离子水 3mL充分溶解混匀，用0.25m孔径的细菌滤器过滤，分装于1.5mL灭菌消毒的Eppendorf管中，-20保存。 （7）SDS裂解液500mM NaCl 70L100mM Tris-Cl（pH8.0） 30L50mM EDTA（pH8.0） 150L10%SDS 30L（8）70%乙醇无水乙醇 30ml灭菌双蒸水 70ml（9）封底用1%琼脂糖琼脂糖 1g去离子水 100ml（10）40%丙烯酰胺液丙烯酰胺 38gBis 2g去离子水 100ml装于棕色瓶中，4保存。（11）10%AMP过硫酸铵 1g去离子水 10ml（12）0.1%银染液硝酸银 0.5g去离子水 500ml装于棕色瓶中，室温保存。（13）显影液NaOH 15g硼酸 0.190g甲醛 4ml加去离子水定容至1000ml （14）CaCl2溶液（0.1mol/L）无水CaCl2 2.77g灭菌三蒸水 200mL充分溶解混匀，定容至250mL，分装后高压灭菌。其它试剂Tris碱、EDTA、IPTG、X-gal 及SDS为Promega公司产品；胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂粉均为OXOID公司产品；琼脂糖为上海Yito有限公司产品；溴化乙锭（E.B）、氨苄青霉素（Amp）、TEMED为Sigma公司产品；10PCR buffer、MgCl2（25 mM）、dNTPs（2.5mM of each）、2Rapid Ligation Buffer、10Loading Buffer、10Buffer（H）为大连宝生物工程公司产品；T4 kinase buffer为Promega公司产品； 其他化学试剂如NaOH、NaCl、Bis、硝酸银、丙烯酰胺、硼酸、过硫酸胺、尿素、甲醛等均为国产分析纯级产品。4仪器设备HH-W600数显三用恒温水箱：广州市深华生物技术有限公司产品；电热恒温隔水式培养箱：黄石市恒丰医疗器械有限公司产品；QL-901旋涡混合器：江苏海门市麒麟医用仪器厂产品；TGL-16B台式离心机：上海安亭科学仪器厂产品；电子天平（JJ300，300g/10mg）：广州市深华生物技术有限公司产品；立式蒸汽灭菌器LS-C35L型：江阴滨江医疗设备厂；真空干胶仪：美国Bio-Rad公司产品；全封闭紫外透射仪（WFH-201-B）：广州深华生物技术有限公司产品；超净工作台（SW-CJ-IFD）：苏净集团安泰空气技术有限公司产品；凝胶图象分析系统：英国UVITEC公司产品；恒压恒流DF-D11型电泳仪：北京东方特力科贸中心产品；BIO-RAD电泳系统：美国BIO-RAD公司产品；BIO-RAD Mini PROTEAN 3 Cell：美国BIO-RAD公司产品；Biometra PCR仪：德国Biometra公司产品；PTC-100TM Peltier Thermal Cycler：美国MJ Research产品；微量取液器（2L /200L /1000L）：吉尔森公司产品；微量进样器（10L）：上海安亭微量进样器厂；DYCZ-30双板夹心式电泳槽：北京六一仪器厂；TS-1型脱色摇床：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；此外还有：掌式离心机、磁力加热搅拌器、微电脑电热恒温培养箱、台式恒温振荡器、桥式水平电泳槽、胶片观片灯、Orion精密pH计（CNH868）等。DNA提取（*）1.剪取虫体，放入1.5ml离心管。2.加270ul裂解液入每个管。Digestion solution Master MixNucleilysis Solution 200ul0.5u EDTA（PH 8.0） 50ulProteinase K 2mg/ml 20ul总体积 270ul3.在55摄氏度恒温下消化至澄清透明。4.分别加入250ul lysis Buffer 到每管，漩涡振荡，混匀5.把样品马上移至吸附柱，13000rpm 3min（加40s启动时间，下同）6.离心后，弃去收集管液体（弃上清），加入650ul wash solution 到每个管，离心13000rpm，1min，离心后弃去上清，把微型柱放回收集管上，步骤重复3次（共4次）7.最后一次离心完，弃上清液（放回原位），离心13000rpm，3min（甩干管壁）8.把微型柱放到新的1.5ml离心管，加入2050ml室温NucleaseFree water，室温放置2min，离心13000r，1min（不能弃去液体）步骤重复1次（共2次）9. 弃去微型柱，20摄氏度保存DNAPCR扩增PCR反应体系 组分体积（L）ddH2O16.810PCR buffer (MgCl2-free)2.5MgCl2 (25mM)2.5dNTPs (2.5mM of each)2NC2 (50pmol/L )0.5NC5 (50pmol/L)0.5rTaq polymerase (5U/L)0.2模板DNA1同时设立阳性对照和阴性对照。PCR反应条件(SRAP-1)： 94预变性 5min 94变性 30sec 55复性 30sec 35个循环 72延伸 1min 72延伸 5min琼脂糖电泳分析取适量50TAE 缓冲液按1进行稀释，配制1%的琼脂糖凝胶，加入5mg/mL E.B。电泳时，取2L PCR产物与2L（6）加样缓冲液混合均匀，小心加到加样孔中，以DL2000 DNA Marker作对照。SRAP引物组合筛选本试验所用正、反向引物的序列正向引物序列（17bp）反向引物序列(18bp)ME1:5-TGAGTCCAAACCGGATA-3EM1:5-GACTGCGTACGAATTAAT-3ME2:5-TGAGTCCAAACCGGAGC-3EM3:5-GACTGCGTACGAATTGAC-3ME3:5-TGAGTCCAAACCGGAAT-3EM4:5-GACTGCGTACGAATTTGA-3ME4:5-TGAGTCCAAACCGGACC-3EM5:5-GACTGCGTACGAATTAAC-3ME5:5-TGAGTCCAAACCGGAAG-3EM6:5-GACTGCGTACGAATTGCA-3本实验所用的随即引物组合组合编号正反向引物名称组合编号正反向引物名称组合组合组合组合组合组合组合组合组合组合SRAP扩增PCR反应体系 组分体积（L）灭菌双蒸H2O16.8MgCl2 (25mM)410PCR buffer (MgCl2-free)2.5dNTPs (2.5mM of each)2正向引物 (50pmol/L )0.5反向引物 (50pmol/L)0.5rTaq polymerase (5U/L)0.2模板DNA1PCR反应条件(SRAP-2)： 94预变性 5min 94变性 30sec 35复性 30sec 5个循环 72延伸 30sec 94变性 30sec 55复性 30sec 35个循环 72延伸 30sec 72延伸 5min琼脂糖电泳分析取适量50TAE 缓冲液按1进行稀释，配制1%的琼脂糖凝胶，加入5mg/mL E.B.电泳前，在25L PCR产物中加入10L（6Loading buffer）加样缓冲液，混匀后取5L小心加到加样孔中，以DL2000 DNA Marker作对照。6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（1）将新的玻板及橡胶圈先用洗衣粉或洗涤剂进行擦洗，自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗，洗好后放于通风处自然晾干。（2）将小的玻璃板装于橡胶圈的槽中，大板两侧有磨砂玻璃条的那面对着小玻板，也装入橡胶圈中。两边都装好后，用大号铁夹子将橡胶圈的两边对称夹紧。（3）将玻璃板放置与桌面成30度左右的角，大板朝上。用1%琼脂糖把玻璃板底部封好，等第一次快凝固后再封第二次。（4）待封好的琼脂糖凝固后，将玻璃板反面转过来，与桌面成30度放置。配置6%变性聚丙烯酰胺凝胶，按制胶体系（见表1）中所示剂量将各试剂依次加到一个100mL的三角瓶中，轻轻摇匀后（尽量不要有气泡），缓缓注胶并避免产生气泡，插入合适的梳子，待其凝固一个小时。剩余的胶留在三角瓶中作对照。表1 6%变性聚丙烯酰胺凝胶制胶体系（以两板为例）组分用量尿素6.4g去离子水30ml10TBE buffer5.4ml40%丙烯酰胺液(19:1)8ml10% AMP0.53mlTEMED23.4L（5）取下夹在玻板两端的夹子，从凝胶中用力均匀地拔出梳子，将玻板倾斜，用蒸馏水反复冲洗点样孔，然后将玻板放入垂直电泳槽中（小板向里），并用电泳装置本身的夹子使之固定。加入适量的1TBE电泳缓冲液。并用注射器吸取1TBE冲洗凝胶的顶部的点样孔，赶走点样孔中的气泡。（6）根据琼脂糖电泳的结果，不同亮度的PCR产物点样量稍有区别，亮的少点，淡的多点。用微量进样器吸取2-5L PCR产物和6Loading buffer的混合液。每板胶的两边各点DL Marker 2000 2L.（7）点样后即可对应接好电极并打开电源，设定电压和时间。电压为90伏，时间一般为2h，根据不同引物组合所扩增出来的条带大小不同而适当调整。（8）电泳完毕后，关掉电源，取下电极，打开连着电泳槽的两个橡胶通道，让电泳缓冲液流尽。松开电泳槽的旋镙，从电泳槽中取出玻板，小心放于实验台面上（大板向下），用小铲从小板的一角小心将板向上铲起，取下小玻板。用小铲轻轻地划开凝胶与磨砂玻璃的接合处，手拿好玻板，使胶面与事先准备好盛放于器皿中的蒸馏水轻轻地接触，使凝胶与玻板剥离，并做好凝胶电泳时的起始端标记。 （9）凝胶在蒸馏水中，放于脱色摇床上，100rpm，漂洗10s，重复两次。（10）转入0.1%AgNO3 溶液中轻摇染色15min，然后用蒸馏水漂洗一次，1min。（11）倒入显影液到适度着色后，倒掉显影液，加入蒸馏水漂洗一次，1min。之后再加入蒸馏水保持，在胶片观察灯上用数码相机照下来，保存于电脑中。（12）成像后，将凝胶转到一张硬白纸上，用保鲜膜包盖凝胶，剪去多余部分，然后放于真空干胶仪中真空干燥约2h。（13）待胶完全干燥后，除去保鲜膜，在纸上作好记号保存。数据处理电泳图谱中每一条带（DNA片段）均作为一个分子标记，并代表一个结合位点（locus）。根据各分子标记的迁移速率，通过人工肉眼读带，将同一水平线上，即同一分子量大小，有带的样品读为“1”，无带的样品读为“0”，很模糊且很淡的带视为“0”。所得的位点按分子量从大到小排列。一对引物读5条以上不同的带，将读出来的带（用0和1来表示）转换成Excel表格文件，制成0-1表之后，转换为纯文本文件用于数据处理。利用NTSYS-pc1.7版软件包（Rohlf，1992），对结果以非加权算术平均数配对法（unweighted pair-group method with arithmetic averages，UPGMA）进行聚类分析，自动生成相似系数和树状图。具体步骤如下：（1）读带：有带的读为1，无带的读为0，之后把这些数字输入到EXCEL表格中，最上排为样品代码，其下依次为读出来的由不同大小的带转化出来的数字。（2）完成所有引物扩增出来的图谱，之后按顺序把所有引物的数字化表复制到同一个EXCEL表格中，要求不同引物代表性样品数量必须相同，且样品要相同。（3）选定整个表格，调整最合适的行高和列宽。再复制到一个新的WORD文档里，表格转化成文本。保存为纯文本形式。（4）打开纯文本文件，选定自动换行，消除所有数字间的空格，然后再在同一行的每两个数字间空一格。在左上角加上“1 行数 列数 0”标题。（5）打开NTSYS-pc1.7软件，进入主菜单后，选择“Programs”中的“qualitative”选项。调出文件，如D：*.TXT，将其中的参数设置成以下的格式SM 改为 DICE输出文件名，如D：*1.TXT10NO 改为 YESCON（6）F2运行，得到相似性系数后，按ESC回主菜单（7）选择“cluster&graph methoda”中的“sahn clustering”选项，将其中的参数改为以下的格式调出文件名，如D：*1.TXT输出文件名，如D：*2.TXTUPGMAWARH改为FIND25改为10（8）F2运行，F4存盘，如D：*3.TXT（9）加主菜单，选择“tree display“，将其中的参数设置为以下的格式输入文件名，如D：*2.TXT（此处的文件名必须是第7步的输出文件名）TREEGPHENMINIMUN 0MAXIMUN 1MUNBER CLASS INTERVALS 10YES611选择打印机类型LPT1CON（10）按F2，ENTER，即可得到树形图。（11）按“”或者“shift”+“+”调整树形图大小，最后按ALT+P即可打印。特异条带的回收与纯化挑选出种特异条带后，每个种随机选两个样品进行种特异带的切胶回收。用25孔厚度为1.5mm的梳子及玻板制胶。每个加样孔点满样品。隔孔点样，电泳缓冲液需要是新配制的。两边点上10L DL2000 DNA Size Marker，以备观察特异条带的位置。电泳方法6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（1）将新的玻板及橡胶圈先用洗衣粉或洗涤剂进行擦洗，自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗，洗好后放于通风处自然晾干。（2）将小的玻璃板装于橡胶圈的槽中，大板两侧有磨砂玻璃条的那面对着小玻板，也装入橡胶圈中。两边都装好后，用大号铁夹子将橡胶圈的两边对称夹紧。（3）将玻璃板放置与桌面成30度左右的角，大板朝上。用1%琼脂糖把玻璃板底部封好，等第一次快凝固后再封第二次。（4）待封好的琼脂糖凝固后，将玻璃板反面转过来，与桌面成30度放置。配置6%变性聚丙烯酰胺凝胶，按制胶体系（见表1）中所示剂量将各试剂依次加到一个100mL的三角瓶中，轻轻摇匀后（尽量不要有气泡），缓缓注胶并避免产生气泡，插入合适的梳子，待其凝固一个小时。剩余的胶留在三角瓶中作对照。表1 6%变性聚丙烯酰胺凝胶制胶体系（以两板为例）组分用量尿素6.4g去离子水30ml10TBE buffer5.4ml40%丙烯酰胺液(19:1)8ml10% AMP0.53mlTEMED23.4L（5）取下夹在玻板两端的夹子，从凝胶中用力均匀地拔出梳子，将玻板倾斜，用蒸馏水反复冲洗点样孔，然后将玻板放入垂直电泳槽中（小板向里），并用电泳装置本身的夹子使之固定。加入适量的1TBE电泳缓冲液。并用注射器吸取1TBE冲洗凝胶的顶部的点样孔，赶走点样孔中的气泡。（6）根据琼脂糖电泳的结果，不同亮度的PCR产物点样量稍有区别，亮的少点，淡的多点。用微量进样器吸取全部PCR产物和6Loading buffer的混合液。每板胶的两边各点DL Marker 2000 5L.（7）点样后即可对应接好电极并打开电源，设定电压和时间。电压为90伏，时间一般为2h，根据不同引物组合所扩增出来的条带大小不同而适当调整。（8）电泳完毕后，关掉电源，取下电极，打开连着电泳槽的两个橡胶通道，让电泳缓冲液流尽。松开电泳槽的旋镙，从电泳槽中取出玻板，小心放于实验台面上（大板向下），用小铲从小板的一角小心将板向上铲起，取下小玻板。用小铲轻轻地划开凝胶与磨砂玻璃的接合处，手拿好玻板，使胶面与事先准备好盛放于器皿中的蒸馏水轻轻地接触，使凝胶与玻板剥离，并做好凝胶电泳时的起始端标记。 （9）电泳结束后用EB染色。取10mg/mL E.B20L加于200ml的新鲜1TBE缓冲液中，混匀。60rpm摇30-60min。之后用紫外成像系统观察跑胶结果，成像，（下需垫上干净的薄膜）找到所需的条带，取出凝胶，于紫外透射仪中切下每个样品我们所需的条带，放于新的干净1.0ml的离心管中。切好所有条带后，再次成像，观察切下的条带正确与否。之后在每个离心管中加入50L的灭菌双蒸水，放于4冰箱过夜。以经过过夜的含DNA片段的凝胶条浸泡液为模板，用相对应的引物扩增扩增体系表PCR反应体系组分体积（L）灭菌双蒸H2O13.810PCR buffer (MgCl2-free)2.5MgCl2 (25mM)2.5dNTPs (2.5mM of each)2正向引物(50pmol/L )0.5反向引物(50pmol/L)0.5rTaq polymerase (5U/L)0.2含有DNA的凝胶浸泡液3同时设阴性对照。PCR反应条件(SRAP-3)： 94预变性 5min 94变性 30sec 50复性 30sec 35个循环 72延伸 30sec 72延伸 5min扩增完毕后，取3L PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，观察扩增结果。结果好的话进行PCR产物切胶回收：切胶回收方法（promege）：(1) 取45L PCR产物于1的琼脂糖凝胶中，80V电压，电泳约4050min；(2) 于紫外透射仪中，用灭菌的手术刀切下含有目的基因片段的琼脂糖凝胶块，放入已称好重的高压灭菌的1.5mL的离心管中，用电子天平称重，并作好记录；(3) 按每100mg琼脂糖凝胶加入400L Binding Buffer的量，加入相应体积的Binding Buffer，混匀后，置于5060水浴中10min，使胶彻底融化（加热融胶时，每2min混匀一次）；(4) 将UNIQ-5柱放入2mL的收集管中，将融化的胶溶液转移到UNIQ-5柱中，室温放置2min， 8000rpm/min离心1min；(5) 取下UNIQ-5柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-5柱放入原收集管中，加入500L Wash Solution，10000rpm/min离心30sec；(6) 重复步骤 (5)；(7) 取下UNIQ-5柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-5柱放回收集管中，10000rpm/min离心1min；(8) 将UNIQ-5柱放入高压灭菌的1.5mL离心管中，在柱膜中央加30L 灭菌双蒸水或Elution Buffer，室温或37放置2min；(9) 10000rpm/min离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或于-20保存备用。(10) 可取35L PCR纯化产物加适量加样缓冲液混合，电泳检查回收率，可根据带的亮度估算DNA回收纯化后的浓度。切胶回收（天根）1向吸附柱CA2中加入500ul的平衡液BL，13000rmp/m离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量。3每100mg琼脂糖凝胶加入300L PN,55放置10min（胶全部溶解即可）。4将上一步所得的溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min，13000rmp/m离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。5向吸附柱中CA2中加入600ul漂洗液PW，13000rmp/m离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。（此步做2次）6将吸附柱CA2放回收集管中13000rmp/m离心2min，劲量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置3min7将吸附柱CA2放置一个干净的离心管中，向吸附模中间悬空滴加脱洗液NucleaseFree water(不少于30ul)，室温放置2min离心13000rmp/m，1min（不能弃去液体）8如有需要，可将离心管中得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7克隆连接体系如下表：表1.9 连接反应体系组分体积（L）2Rapid Ligation Buffer5pGEM-T easy vector1PCR纯化产物3T4 DNA ligase1将上述各组分加到一新鲜洁净的0.2mL离心管中，于掌式离心机中瞬时离心混匀，置于4冰箱过夜或在PCR扩增仪中16作用3小时之后，于-20保存备用。重组质粒的转化(1) 从-70冰箱取出感受态细胞，置于冰浴至融解，取50-100L置于高压灭菌的1.5mL的离心管中，将重组质粒瞬时离心，取5L加入感受态细胞悬液中，用手指轻弹混匀，冰浴20min； (2) 于42水浴中，热应激90sec，立即冰浴2min；(3) 加入900L 预热的LB培养液，于恒温摇床中37，150rpm/min增菌培养1.5h；(4) 制备LB固体选择培养基：在含Amp的LB固体培养基中加入55L IPTG/X-gal（50L X-gal 、5L IPTG）混合液，用涂菌棒涂抹均匀（于超净工作台中进行），恒温箱中37平放30min； (5) 取培养后的菌液10000rpm/min离心1min，弃900L上清，余下液体重悬沉淀，涂布于含Amp和IPTG/X-gal 的LB固体选择培养基平皿上，恒温箱中37平放30min，待其吸收完全后，倒置平皿，继续培养1416h后，取出观察结果。阳性克隆转化子为白色菌落，阴性克隆转化子为蓝色菌落。重组质粒的菌落PCR鉴定(1) 用灭菌牙签小心挑取平皿中的单个白色菌落，于含有1mL LB液体培养基和1L Amp的离心管中轻轻搅动几次，每个克隆均挑取四个菌落。置于恒温摇床中37，150rpm/min培养过夜后（16h），4保存备用；(2) 用引物组合进行菌液PCR鉴定 扩增体系如下表：表1.10 菌液PCR反应体系组分体积（L）ddH2O15.875MgCl2(25mM)2.510PCR Buffer(Mg2+ free)2.5dNTPs (2.5mM