2章 培养基成分和作用ppt课件

第二章培养基 培养基是培养植物组织的基质 是植物组织和细胞在离开母体的条件下生存和生长发育所需要的物质来源 培养基的成分决定着植物细胞和组织的生长状况和发育的方向 不同的植物和不同的培养目的需要选用不同的培养基以取得特定的培养效果 第二章培养基 无机营养 有机营养 生理活性物质 其他添加物 水 第一节无机营养成分 无机元素以无机盐的形式加入到培养基中 在培养基中为离子状态 植物细胞组织吸收的是离子状态的元素 无机营养成分包括大量元素氮 磷 钾 钙 镁 硫六种和微量元素铁 硼 锰 铜 锌 钼 钴等七种 除了这些之外 有些培养基配方也含有其他元素 但这些元素的作用还不清楚 也可能是不必要的 第一节无机营养成分 1 大量无机元素在培养基中最重要的无机成分是N 无机氮的供应有两种形式 一种是硝酸盐 另一种是铵盐 当作为唯一的氮源时 硝酸盐的作用要比铵盐好得多 但在单独使用硝酸盐时 培养基的pH值会向碱性方向漂移 在培养基中同时加入铵盐可以起到缓冲的作用 培养基中硝态氮和铵态氮的比例和相对量的多少对培养结果影响十分明显 MS和N6是两种不同类型的培养基 前者含有较高浓度和比例的铵态氮 后者含有高浓度的硝态氮和低比例的铵态氮 两者的培养效果常常不同 第一节无机营养成分 1 无机大量元素其他无机大量元素P和K以磷酸钾或磷酸二氢钾的化合物加入 Mg以硫酸镁的形态加入 S以硫酸氨的形式加入 Ca以氯化钙的形式加入 这些元素的需要量明显没有N的需要量大 而且加入量往往是过剩的 在一般培养基中 含N盐的总量在每升2000 3000毫克之间 含Ca或Mg的盐的量在每升100至400之间 第一节无机营养成分 2 无机微量成分微量元素中硼 锰 锌和铁的需求量比较大 在每升30 100毫克的范围内 铜 钴和钼的需求量很少 在1毫克或以下的范围 有些培养基的微量成分元素种类比较少 由于某些微量元素的需求量的确很微少 除了精确的营养成分研究 采用特别高纯度的试剂进行液体培养之外 完全可以从水 试剂 特别是琼脂中混入的杂质中吸收而满足生长发育的需要 第一节无机营养成分 2 无机微量元素在微量元素中 铁是一种需求量相对较大但容易沉淀 较难被吸收的元素 现在通常采用乙二胺四乙酸 EDTA 的钠盐加以螯合保护 以保证铁元素的有效性 绝大多数培养基都含有碘的化合物碘化钾 但碘的必要性还没有得到证明 第二章培养基 无机营养 有机营养 生理活性物质 其他添加物 水 第二节有机营养成分 1 糖类在培养条件下 离体的植物细胞不能进行有效的光合作用生成碳水化合物 由自养生物变成异养生物 生长发育所需要的碳源只能从培养基中吸收 因此 可以被细胞吸收利用的糖类碳水化合物是培养基的必要成分 蔗糖是培养基中最常用的碳源 实际上 由于培养基灭菌采用了高温高压的条件 加入到培养基中的蔗糖有相当一部分发生了水解反应 转化成了葡萄糖和果糖 第二节有机营养成分 1 糖类培养基中蔗糖的常用浓度是2 5 蔗糖除了作为碳源外 还起着调节培养基渗透压的作用 根的器官培养采用较低浓度的蔗糖 幼胚培养采用高浓度的蔗糖 花药培养采用高浓度的蔗糖 第二节有机营养成分 2 氨基酸类氨基酸类在组织培养中并不是必要的 但有时在培养基中加入某些特定的氨基酸可以取得明显有益的效果 常用的氨基酸有脯氨酸 甘氨酸 谷氨酸 天冬氨酸和色氨酸等 1000 1500mg l的脯氨酸有促进水稻愈伤组织增殖以及改良愈伤组织质量的显著作用 2000mg l的脯氨酸能大幅度提高大豆不定芽的形成和有利于不定芽的生长 第二节有机营养成分 2 氨基酸类一种特殊的培养基 完全不采用无机态氮 仅采用甘氨酸 精氨酸 天冬氨酸 谷氨酰胺和色氨酸的有机氮为唯一氮源的培养基 叫AA培养基 这可以说是一种非常特别的培养基 AA培养基在有些情况下可以促进悬浮培养的细胞团的分散 成为禾本科作物悬浮培养细胞游离原生质体时较常采用的培养基 第二节有机营养成分 3 其它包括多种的天然有机物质以及加工品 最常用的有椰子汁 CW CM 水解蛋白或蛋白胨 peptone 此外还有人用玉米胚乳浸出物 麦芽浸出物 酵母浸出物 番茄汁 香蕉汁等等 虽然这些物质往往对培养起着重要的促进作用 但因为原材料和加工方法的不同 使用效果有可能不稳定 是造成实验重复性差 效果不稳定的主要原因 不采用天然物质的成分一定的培养基称为完全合成培养基 几种天然有机物质的制备方法 番茄 挤压后取得汁液 直接加入培养基 调节酸碱度后灭菌 马铃薯 切成边长约6mm的小块后加水煮沸15 20分钟 取汁液加入培养基 然后调整酸碱度 再行灭菌 香蕉 压烂成泥浆状后全部加入到培养基中 调整酸碱度后灭菌 椰子水 直接加热至80度以上 然后冷却至常温 再用3层纱布过滤除去变性凝固的蛋白质成分 加入到培养基后 调整酸碱度灭菌 第二章培养基 无机营养 有机营养 生理活性物质 其他添加物 水 第三节生理活性物质 生理活性物质 physiologicallyactiveelements 在培养基中的浓度一般在十万分之一至千万分之一 具有提高细胞活力或改变细胞的发育模式的作用 和一般的营养成分有本质上的不同 生理活性物质一般包括植物激素和维生素 vitamin 两大类别 第三节生理活性物质 1 植物激素植物激素也称植物生长调节物质 一般将天然的植物激素称为荷尔蒙 hormone 而将人工合成的称为生长调节剂 growthregulator 植物激素不仅具有促进细胞组织的生长的一般作用 还能诱导培养细胞组织的脱分化和器官分化 以达到一定的培养目的 目前 在植物体中发现的五类激素 都已在植物组织培养中得到不同程度的应用 激素的使用使很多植物种类的组织细胞培养成为可能 分化 脱分化和再分化的概念 分化 differentiation 遗传上相同的细胞在结构和功能上变得不同的有序过程 脱分化 dedifferentiation 一个成熟的细胞转变为分生状态并形成未分化的愈伤组织的现象 再分化 redifferentiation 脱分化后的分生细胞 愈伤组织 在特定条件下发育成新的器官甚至完整植株 植株再生 Plantregeneration 的过程 这些过程受内源或外源的植物激素的直接调控 而本质上则是基因按一定顺序选择性地表达或关闭的结果 胡萝卜根部组织的脱分化 再分化 水稻愈伤组织再分化 植物激素的特征 非营养物质 以微小剂量起作用 作用效果往往很复杂 常常因浓度 植物物种和器官组织的不同而有显著的差别 作用机理是激发某种反应 一般认为是通过诱导基因表达或信号转导来调控或启动生理代谢过程 第三节生理活性物质 1 植物激素1 生长素 auxin 天然存在的生长素主要是吲哚乙酸 IAA 和少量的吲哚丁酸 indolebutyricacid IBA 在组织培养中 应用更多的是人工合成的具有吲哚乙酸类似功能的化合物 主要包括 萘乙酸 naphthaleneaceticacid NAA 二氯苯氧乙酸 2 4 dichlorophenoxyaceticacid 2 4 D 三氯苯氧乙酸 2 4 5 T 等 这些化学合成的生长素类物质不仅价格便宜 而且比吲哚乙酸的光稳定性和热稳定性好 第三节生理活性物质 1 植物激素1 生长素2 4 D和2 4 5 T的作用力度较强 一般用于诱导组织脱分化和促进愈伤组织的增殖 NAA的作用效果介于IBA和2 4 D之间 和2 4 D明显不同的一个特点是不像2 4 D那样强烈地抑制叶绿素的形成 NAA在组织培养中主要用于促进根的形成和配合细胞分裂素使用 提高培养物的活力 生长素的使用浓度一般在0 1 10mg l 第三节生理活性物质 1 植物激素2 细胞分裂素 cytokinin 天然存在的主要是玉米素 Zeatin 天然的细胞分裂素其热稳定性都比较差 价格也特别昂贵 在组培中更经常使用的是人工合成的细胞分裂素 人工合成的分裂素主要包括 激动素 俗名动力精 Kinetin 略称Kt 化学名称 6 糠基氨基嘌呤 6 furfurylaminopurine 苄基腺嘌呤 6 benzyladenine 6 BA 也称6 苄氨基嘌呤 6 benzylaminopurine 6 BAP 噻苯隆 N 苯基 N 1 2 3 噻二唑 5 脲 thidiazuron TDZ 第三节生理活性物质 1 植物激素2 细胞分裂素 cytokinin Kt一般是配合2 4 D在诱导愈伤组织中使用 BA一般是在诱导不定芽时单独或配合NAA使用 TDZ一般情况下作用最强烈 纯品价格高 通常是在BA作用效果不理想时才使用 第三节生理活性物质 1 植物激素3 赤霉素 gibberellicacid 天然赤霉素 加上合成的一共有好几十种 而最有代表性 研究得较多的是其中赤霉酸 赤霉素A3或GA3 使用赤霉素的效果和目的主要有 缓解细胞分裂素对茎部伸长的抑制作用 用于果树的胚珠培养 以促进胚胎发育 用于草莓和马铃薯等的茎尖生长点培养 用于促进椰菜花的愈伤组织再分化 第三节生理活性物质 1 植物激素4 脱落酸 abscisicacid ABA 脱落酸是在前世纪60年代才被发现的 在化学结构上和赤霉素同属于萜烯类化合物 脱落酸有顺反两种异构体 反式异构体的生理活性很低 脱落酸在组织培养方面的作用有 A 抑制未成熟胚的过早萌发 促进胚胎的正常发育 B 促进番茄 番薯 烟草和水稻的植株再分化 C 在人工种子的制备中使用脱落酸防止胚胎的过早萌发或包埋的芽体的过早萌动 第三节生理活性物质 1 植物激素5 乙烯 Ethylene 在五类植物激素中 乙烯是被确认得最迟的 也是唯一的一种气态激素 乙烯在组培中的应用例子很少 但在密封的培养容器内几乎都可以检测到乙烯的存在 证明培养细胞组织都或多或少地产生乙烯 油菜等十字花科植物的离体培养物则受到其本身产生的乙烯的显著抑制 添加硝酸银 2 10mg l 可以有效地促进培养物的增殖和生长 第三节生理活性物质 2 维生素类和类维生素大多数培养的细胞都能合成所有必需的维生素 但在数量上往往不够 在培养基中加入一定量的某些维生素可以有效地促进细胞组织的生长和增殖 有时还对培养成功与否起着决定性的作用 常用的维生素有硫胺素 维生素B1 thiamine HCl 吡哆醇 维生素B6 pyridoxine HCl 烟酸 尼古丁酸 维生素B3 Nicotinicacid 泛酸钙 B5 Ca pantothenate 等 第三节生理活性物质 2 维生素类和类维生素在所有的维生素种 硫胺素最为重要 使用浓度在0 1 10mg L 硫胺素和吡哆醇一般采用盐酸盐的形态 这样可以更加容易溶解在水中 肌醇是一种类似维生素的物质 在培养基中使用浓度比维生素高 一般使用浓度为每升100毫克 第二章培养基 无机营养 有机营养 生理活性物质 其他添加物 水 第四节其他添加物 1 培养基固化剂1 琼脂 agar 固化剂中使用最多的是琼脂 又名琼胶 洋菜 冻粉 是一类从石花菜及其它红藻类植物提取出来的藻胶 条状琼脂为类白色或淡黄色半透明细长条状 粉状琼脂为鳞片状无色或淡黄色粉末 琼脂是多糖类物质 使用浓度为0 6 1 现在还没有看到植物组织能吸收利用琼脂的报导 但琼脂里混杂的物质常常对培养结果产生比较明显的影响 第四节其他添加物 1 培养基固化剂1 琼脂 agar 琼脂溶液 培养基 一般在45摄氏度前后逐渐凝固 浓度是影响凝固温度的一个因子 如果培养基灭菌后没有混匀 容器底部的浓度偏高 容易在底部开始凝固 附 琼脂糖 agarose 在多数情况下的培养效果比琼脂好 特别是低凝固温度的琼脂糖是原生质体包埋培养的首选材料 第四节其他添加物 1 固化剂2 卡拉胶 carrageenan 卡拉胶是另一种在组织培养生产上用得最广泛的固化剂 使用浓度为0 6 0 8 价格为琼脂的1 2 1 3 卡拉胶是从红藻中的几个海藻品种中提取的海藻多糖的统称 不同的来源有不同的精细结构 其胶体性质也不尽相同 第四节其他添加物 1 固化剂2 卡拉胶卡拉胶干的粉末性质很稳定 长期放置不会降解 在中性和碱性溶液中也很稳定 即使加热也不水解 植物细胞不能分解或吸收卡拉胶 卡拉胶在培养效果上和琼脂往往有区别 使用琼脂的培养效果往往较好 例如有利于避免植物材料的玻璃化 第四节其他添加物 1 固化剂3 Phytagel 植物胶 Phytagel是一种纯度高 透明度好 凝胶强度大的固化剂 使用浓度为1 5 2g L 仅为琼脂的1 4到1 5的用量 Phytagel由细菌所产生 主要成分为葡糖甙酸 鼠李糖和极少量的葡萄糖 Phytagel需要一定浓度的钙离子才能够凝固 在培养水稻植株的后期本来已经固化的培养基会变软甚至液化 第四节其他添加物 1 固化剂4 冷凝胶固化质量类似优质琼脂 但透明度比琼脂高 并且粘度比琼脂小 因此特别适合组培苗最后一个阶段 诱导芽条长根的培养 因为组培苗出瓶后需要洗干净根上的培养基才能种植 第四节其他添加物 1 固化剂5 其他淀粉也可作为培养基的固化剂 但物理性能很差 粘性大 操作不方便 有些植物种类或器官能在一定程度上利用培养基中的淀粉 热稳定和化学惰性的物质 这类物质很多 但在组织培养中应用不常见 主要是起到物理性质的支撑作用 有四个因素会影响培养基的固化强度 固化剂的量 培养基酸碱度 高压灭菌的温度和时间长度 培养基成分特别是重金属离子浓度 固化剂一定要在溶解状态时搅拌混匀 不然会沉淀而造成培养基上层偏软 第四节其他添加物 2 酸碱度调节剂和稳定剂一般培养基酸碱度在调配后偏于酸性 pH值在5 0前后 培养基在高压灭菌后pH值还会继续降低 太低的pH值不仅不适合植物细胞的生长 而且 还会明显降低培养基的凝胶强度 或导致培养基完全不能凝固 高压灭菌之前将培养基的pH值适当调高 一般是采用1N的NaOH或KOH溶液将酸碱度调至pH值等于5 6 5 8 第四节其他添加物 2 酸碱度调节剂和稳定剂很多缓冲剂由于对植物细胞具有毒害作用而不能够在培养基中使用 实际上能够用于稳定培养基酸碱度的只有MES 吗啉代乙基磺酸 一般使用量在500mg l左右 由于MES自身是酸性物质 增加添加量会导致培养基太酸而不适合细胞生长 因此 不能够通过增加使用量来提高缓冲能力 第四节其他添加物 3 渗透压 osmoticpotential 调节剂在某些特殊情况下需要对培养基的渗透压进行调节 培养基的成分决定了渗透压的具体数值 对渗透压的调节需要改变培养基的成分 渗透压调节剂一般采用植物不能进行代谢的物质 用的最多的是甘露醇 mannitol 和山梨醇 sorbitol 实际上 某些植物是能够代谢山梨醇的 对渗透压的改变量和调节剂的分子量成反比 第四节其他添加物 4 吸附剂 absorbance 吸附剂的作用是吸收植物组织分泌到培养基中的有害物质 保护植物组织免受毒害 防止组织褐化 browning necrosis 1 活性炭 activatedcharcoal AC 活性炭是一种多孔性的微粒 主要是利用物理性的吸附作用 加到培养基后可以和外渗物结合 减少外渗物对组织的毒害作用 但活性炭也会吸收植物生长调节剂 从另一个方面对组织培养造成影响 第四节其他添加物 4 吸附剂 absorbance 2 聚乙烯吡咯烷酮 Polyvinylpyrrodine PVP PVP是大分子化合物 具有不同的分子量可供选用 对酚类物质具有专一的吸附能力 在生物化学